Name: profiling ubiquitin and ubiquitin-like dependent post-translational modifications and identification of significant alterations
Uploaded: 2019-11-07T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Profiling Ubiquitin and Ubiquitin-like Dependent Post-translational Modifications and Identification of Significant Alterations at JoVE.com

Ce travail a été soutenu par La Ligue Contre le Cancer au VH et à la SP, et l'ARC (association pour la recherche sur le cancer) à PS, INCa (Institut national du cancer) et Canceropole PACA à JI. Le site de spectrométrie de masse de Marseille Proteomics (marseille-proteomique.univ-amu.fr) soutenu par IBISA (Infrastructures Biologie Santé et Agronomie), Plateforme Technologique Aix-Marseille, Cancéropôle PACA, Provence-Alpes-Côte d'Azur Région, l'Institut Paoli-Calmettes et le Centre de Recherche en Cancérologie de Marseille.

1. Génération de lignées cellulaires stables exprimant 6His-Flag-Ubl
REMARQUE : Co-transfection des cellules HEK-293T avec pCCL-6HF-Ubl, pVSVG et delta-Helper.
<ol><li>Jour 0 : Seed 293T cells in a 6-well plate to obtain 50-70% confluence the day after.</li>
	<li>Jour 1 : Co-transfect 50-70% cellules confluentes avec un mélange de 1 g de pCCL-6HF-Ubl ou pCCL-GFP, 1 g de pVSVG et 1 g de vecteurs delta-Helper, à l'aide d'un réactif de transfection et d'un protocole pour la production de ...

<ol>
	<li>Prabakaran, S., Lippens, G., Steen, H., Gunawardena, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-translational+modification:+Nature's+escape+from+genetic+imprisonment+and+the+basis+for+dynamic+information+encoding.">Post-translational modification: Nature's escape from genetic imprisonment and the basis for dynamic information encoding.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: Systems Biology and Medicine. , (2012).</li><li>Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+and+function+of+ubiquitin-like+proteins.">Origin and function of ubiquitin-like proteins.</a> Nature. 458 (7237), 422-429 (2009).</li><li>Kirkpatrick, D. S., Weldon, S. F., Tsaprailis, G., Liebler, D. C., Gandolfi, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+identification+of+ubiquitinated+proteins+from+human+cells+expressing+His-tagged+ubiquitin.">Proteomic identification of ubiquitinated proteins from human cells expressing His-tagged ubiquitin.</a> Proteomics. 5 (8), 2104-2111 (2005).</li><li>Peng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+proteomics+approach+to+understanding+protein+ubiquitination.">A proteomics approach to understanding protein ubiquitination.</a> Nature Biotechnology. 21 (8), 921-926 (2003).</li><li>Matsumoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+analysis+of+the+human+ubiquitin-related+proteome.">Large-scale analysis of the human ubiquitin-related proteome.</a> Proteomics. 5 (16), 4145-4151 (2005).</li><li>Hjerpe, R., Rodr&#237;guez, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+approaches+for+characterizing+ubiquitinated+proteins.">Efficient approaches for characterizing ubiquitinated proteins.</a> Biochemical Society Transactions. 36 (5), 823-827 (2008).</li><li>Bonacci, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+new+mechanisms+of+cellular+response+to+chemotherapy+by+tracking+changes+in+post-translational+modifications+by+ubiquitin+and+ubiquitin-like+proteins.">Identification of new mechanisms of cellular response to chemotherapy by tracking changes in post-translational modifications by ubiquitin and ubiquitin-like proteins.</a> Journal of Proteome Research. 13 (5), 2478-2494 (2014).</li><li>Bedford, L., Lowe, J., Dick, L. R., Mayer, R. J., Brownell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin-like+protein+conjugation+and+the+ubiquitin-proteasome+system+as+drug+targets.">Ubiquitin-like protein conjugation and the ubiquitin-proteasome system as drug targets.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 10 (1), 29-46 (2011).</li><li>Hoeller, D., Dikic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+ubiquitin+system+in+cancer+therapy.">Targeting the ubiquitin system in cancer therapy.</a> Nature. 458 (7237), 438-444 (2009).</li><li>Silva, J. C., Gorenstein, M. V., Li, G. Z. Z., Vissers, J. P. C., Geromanos, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absolute+quantification+of+proteins+by+LCMSE:+a+virtue+of+parallel+MS+acquisition.">Absolute quantification of proteins by LCMSE: a virtue of parallel MS acquisition.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. , (2006).</li><li>Kim, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+and+quantitative+assessment+of+the+ubiquitin-modified+proteome.">Systematic and quantitative assessment of the ubiquitin-modified proteome.</a> Molecular Cell. 44 (2), 325-340 (2011).</li></ol>

Nous avons développé une méthodologie robuste et fiable pour générer des profils de protéines modifiées par les principaux membres de la famille de l'ubiquitine. En effet, nous avons appliqué avec succès ce protocole pour générer des profils de PTM par ubiquitine, mais aussi par SUMO et Nedd8, et pour détecter les altérations associées à un traitement7, en réponse à la surexpression ou à l'élimination d'un certain gène (données non montré) et dans les cellules qui ont acquis ...

La méthode proposée ici est dédiée à l'étude des PTM médiées par les membres de la famille de l'ubiquitine à partir de cellules de mammifères cultivées afin d'identifier les altérations potentielles associées à une condition spécifique (traitement, différenciation, etc.). Les PTM représentent la dernière étape de la régulation des fonctions des protéines1. En effet, une fois produites par la machinerie translationnelle, la plupart sinon toutes les protéines subissent différents types de PTM qui modulent leur activité, interactions moléculaires, et emplacement intracellulaire1. Parmi la pléthore de PTM sont ceux médiés par la famille d'ubiquitine de protéines, l'ubiquitine elle-même et toutes les ubiquitine-likes, ont le potentiel de réguler toutes les protéines intracellulaires ou partiellement cytoplasmiques2. Parce qu'elles sont elles-mêmes des protéines, elles peuvent être conjuguées les unes aux autres, formant des chaînes homogènes et hétérogènes de diverses topologies, chacune associée à des fonctions réglementaires spécifiques2. Des outils sont nécessaires pour essayer de déchiffrer et de comprendre cette machinerie complexe. Beaucoup d'approches ont été développées dans le monde entier, ayant leurs propres avantages et inconvénients, et ici nous proposons un avec la haute performance adaptée aux cellules cultivées.
Le principal avantage de cette méthode est sa précision. En effet, la pureté des protéines modifiées isolées est fortement améliorée par l'utilisation combinatoire des deux étiquettes (6His et Flag) et les deux étapes-procédure et donc il est beaucoup plus sélectif qu'une seule étiquette fusion Ub/Ubl3,4. La présence de l'étiquette 6His permet une première étape de purification dans un état totalement dénaturant évitant ainsi toute co-purification des protéines contenant des domaines de liaison d'ubiquitine ou d'autres protéines se liant aux ubiquitinated. Il s'agit d'un problème technique rencontré par plusieurs autres approches basées sur la purification d'affinité des protéomes ubiquitinated utilisant des anticorps spécifiques5 ou des éléments de liaison d'ubiquitine de tandem (TUBEs)6. Fait important, cette technique n'est pas biaisée en faveur de la purification d'un certain type d'ubiquitination, comme cela pourrait être le cas pour d'autres approches, puisque les deux types de mono et différents types de polyubiquitinations ont été identifiés7. Par conséquent, une fois trouvé, une altération de l'ubiquitination devra être étudiée plus en détail par des approches biochimiques standard afin d'identifier le type exact d'ubiquitination impliquée.
Enfin, un autre avantage technique de ce protocole est l'utilisation de lentivirus, qui crée facilement et rapidement des lignées cellulaires stables exprimant avec un niveau raisonnable d'expressions de modificateur marqué sans interférer avec le comportement cellulaire normal.
Alors qu'un rôle important de l'ubiquitination est de cibler les protéines pour la dégradation protéasomale, il est maintenant connu qu'il a de nombreuses autres propriétés réglementaires pour potentiellement la plupart des protéines intracellulaires ou partiellement intracellulaires1. Le nombre de ces fonctions est encore augmenté par l'existence de nombreuses ubiquitines comme les protéines, formant une famille de protéines régulant presque tous les mécanismes cellulaires1. Leurs altérations peuvent avoir un impact drastique sur la biologie cellulaire et peuvent conduire ou participer à des situations pathologiques8, comme le cancer9. Par conséquent, des outils sont nécessaires pour explorer ce vaste paysage et identifier les altérations associées à une condition pathologique qui pourrait servir de nouvelles cibles thérapeutiques.
Ce protocole est dédié aux cellules en culture car elles doivent être transduisées pour exprimer exogène marqué Ub / Ubl. Une fois créées, ces lignées cellulaires stables peuvent être utilisées pour générer des profils Ubl à partir de la culture en 2D ou 3D ou xénogreffes, prolongeant ainsi l'horizon des différents modèles expérimentaux qui peuvent être appliqués pour étudier les profils ptMs.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ANTI-FLAG M2 Affinity Gel</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2220-5ML</td>
			<td>binds all Flag tagged proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Flag M2 antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F3165</td>
			<td>to detect 6His-Flag tagged expression of ub/ubl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer 40 &#181;m</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td>to remove floating pellet from guanidine lysed cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flag peptide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F3290</td>
			<td>elute flag tagged proteins from anti-flag beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanidine hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>50933</td>
			<td>chaotropic agent used to denature all proteins in cell lysate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I5513</td>
			<td>eluates 6His bond proteins from Ni-NTA beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 3000</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>L3000015</td>
			<td>to transfect HEK-293T cells to produce lentiviruses</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lobind tubes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z666491</td>
			<td>avoids absorption of precious material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membrane Filter, 0.45 &#181;m</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>HAWP04700F1</td>
			<td>to filter the lentiviral supernantant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>30210</td>
			<td>purification of the 6His tag</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

profiling ubiquitin and ubiquitin-like dependent post-translational modifications and identification of significant alterations

Les modifications post-traductionnelles dépendantes de l'ubiquitine (ubl) des protéines jouent des rôles biologiques fondamentaux de régulation au sein de la cellule en contrôlant la stabilité des protéines, l'activité, les interactions et la localisation intracellulaire. Ils permettent à la cellule de répondre aux signaux et de s'adapter aux changements de son environnement. Les modifications au sein de ces mécanismes peuvent conduire à des situations pathologiques graves telles que les maladies neurodégénératives et les cancers. Le but de la technique décrite ici est d'établir des profils de PTMdépendants dépendants d'ub/ubls, rapidement et exactement, des lignées cellulaires cultivées. La comparaison de différents profils obtenus à partir de différentes conditions permet d'identifier des altérations spécifiques, telles que celles induites par un traitement par exemple. La transduction des cellules médiées lentivirales est effectuée pour créer des lignées cellulaires stables exprimant une version à deux étiquettes (6His et Drapeau) du modificateur (ubiquitine ou ubl comme SUMO1 ou Nedd8). Ces étiquettes permettent la purification de l'ubiquitine et donc des protéines ubiquitinated des cellules. Cela se fait par un processus de purification en deux étapes: Le premier est effectué dans des conditions dénaturantes en utilisant l'étiquette 6His, et le second dans des conditions natives en utilisant l'étiquette drapeau. Cela conduit à un isolement très spécifique et pur des protéines modifiées qui sont ensuite identifiées et semi-quantifiées par chromatographie liquide suivie par la spectrométrie de masse en tandem (LC-MS/MS) technologie. L'analyse informatique facile des données De SP à l'aide du logiciel Excel permet l'établissement de profils PTM en éliminant les signaux d'arrière-plan. Ces profils sont comparés entre chaque condition afin d'identifier des altérations spécifiques qui seront ensuite étudiées plus spécifiquement, à commencer par leur validation par des techniques de biochimie standard.

Transduction des cellules mammifères de culture pour créer des cellules exprimant gFP et 6HF-Ub Pour produire des lentivirus qui seront utilisés plus tard pour transduire les cellules MiaPaCa-2, 70 % des cellules HEK-293T confluentes sont cotranscérées avec une quantité égale des trois vecteurs, pCCL-6HF-Ubiquitin ou GFP/Delta-Helper/pvSvG. Après 24 h de production, le milieu contenant des particules lentivirales est récupéré et filtré. Il est possible à c...

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Profiling Ubiquitin and Ubiquitin-like Dependent Post-translational Modifications and Identification of Significant Alterations

Ce protocole vise à établir des protéomes spécifiques à l'ubiquitine (Ubquitin) et à l'ubiquitine (Ubls) afin d'identifier les altérations de ce type de modifications post-traductionnelles (PTM), associées à une condition spécifique telle qu'un traitement ou un phénotype.

Profilage des modifications post-traductions à l'ubiquitine et à l'ubiquitine et identification des modifications importantes

Ubiquitin (ub) and ubiquitin-like (ubl) dependent post-translational modifications of proteins play fundamental biological regulatory roles within the ...

Ce protocole est un moyen facile de générer les profils des modifications post-translationnelles d’ubiquitine et d’ubiquitine en identifiant et en semi-quantifiant des protéines spécifiques identifiées. Le principal avantage de cette technique est l’utilisation de lentivirus pour créer une ligne d’expression cellulaire stable en une semaine, et l’utilisation de deux étiquettes pour purifier spécifiquement les protéines. En fait, ce genre de modifications post-translationnelles sont impliqués dans la plupart des fonctions biologiques, et les altérations de ce mécanisme se trouvent dans la plupart des maladies.Par conséquent, l’identification de ces altérations peut servir de pronostic et/ou de diagnostic et bien sûr de cibles moléculaires. L’ubiquitine est l’une des protéines les plus conservées dans les cellules eucaryotes et cette protéine essentielle à leur survie. Par conséquent, ce type de méthode pourrait être appliqué à n’importe quel modèle eucaryotique, des mammifères à la levure.Cependant, notre système lentiviral est limité à l’étude des cellules. Puisque l’ensemble de la procédure est assez long avec parfois un long temps d’incubation, il est possible de le faire sur deux jours au lieu d’un. L’élitate des perles de nickel peut être congelé à moins 20 et avant d’ajouter les perles flag.Ce protocole contient de nombreuses étapes parmi lesquelles certaines sont critiques afin de garantir le succès final de la purification, et donc l’établissement précis du profil de modification post-translationnelle. La démonstration de la procédure sera effectuée par Mirna Swayden et Aurélie Dobric, deux doctorantes du laboratoire. Pour commencer, ajouter 0,5 fois 10 à la sixième des cellules HEK 293T dans une plaque de six puits avec deux millilitres par puits de DMEM avec 10%FBS à semer, et incuber à 37 degrés Celsius, 5% de dioxyde de carbone, et 100% d’humidité.Le lendemain, 50 à 70% de confluence est atteinte. Cotransfecter les cellules avec un mélange d’un microgramme de pCCL-6HF ubiquitine-like ou pCCL-GFP, un microgramme de PBS VG, et un microgramme de vecteurs delta helper en utilisant un réagentine transfection et le protocole pour la production de lentivirus. Après six heures de transfection, changer le milieu en un milieu frais correspondant au milieu des cellules à transduire.Ensemencer les cellules à transduire dans une plaque de six puits avec leur média de culture standard afin d’obtenir 10 à 20% de confluence le lendemain. 24 heures après la transfection, récupérer le milieu contenant des particules lentivirales et filtrer à l’aide de filtres de 0,45 micron. Remplacer le milieu des cellules à transdire par le milieu filtré contenant des lentivirus.Incuber les cellules avec des lentivirus pendant 24 à 72 heures dans un incubateur à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone, puis changer le milieu avec frais, standard. Vérifiez l’expression GFP à l’aide d’un microscope fluorescent inversé pour évaluer l’efficacité de la transduction. Si aucune fluorescence n’est détectée, attendez deux à trois jours de plus.Si le contrôle GFP est positif avec la fluorescence verte, faire pousser toutes les cellules jusqu’à ce qu’elles en ont assez pour effectuer un contrôle d’expression de l’ubiquitine 6-His-FLAG-like par immunofluorescence, comme indiqué ici, et tache occidentale utilisant l’anticorps anti-FLAG. Après avoir cultivé les cellules dans des plats de 15 centimètres, lavez la vaisselle de culture au moins une fois avec de la solution saline tamponnée de phosphate à température ambiante. Pour commencer la lyse cellulaire, ajouter deux millilitres de tampon un dans chaque plat de 15 centimètres à température ambiante.Utilisez un grattoir cellulaire pour récupérer tous les lysates dans des tubes de centrifugeuse conique de 50 millilitres. Sonicate les lystates trois fois pendant 30 secondes, séparés par une pause d’une minute. Centrifugeuse les lysates soniques à 15 000 fois g pendant 15 minutes.Transférer le supernatant dans un nouveau tube à l’aide d’une passoire cellulaire de 40 microns. Il est très important de filtrer les lysates après la sonication et la centrifugation. Ne pas le faire peut entraîner la copurification de nombreuses protéines non spécifiques, augmentant ainsi l’arrière-plan et réduisant fortement la taille du profil PTM.Transférer une quantité égale de protéines entre 50 et 100 milligrammes dans de nouveaux tubes Falcon. Ajouter des perles d’ion nickel NTA dans chaque tube avec la quantité de deux microlitres de perles par milligramme de protéines. Placer les tubes sur un rotateur pour tourner à 30 rpm pendant 2 1/2 heures à température ambiante.Puis pelleter les perles à 500 fois g pendant cinq minutes. Lavez les perles avec un millilitre de tampon et transférez les échantillons dans un tube de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre. Placez le tube sur la glace.Lavez-les deux fois avec un millilitre de tampon glacé deux contenant de l’imidazole de dix millimlaires. Pour les protéines liées à l’épuute, ajouter 600 microlitres de tampon deux contenant de l’imidazole de 250 millimlaires, et tourner pendant deux heures à quatre degrés Celsius. Après avoir granulé les perles par centrifugation à 500 fois g pendant une minute, transférer le supernatant dans un nouveau tube pré-refroidi de 1,5 millilitre, et ajouter 50 microlitres de perles anti-FLAG M2 conjuguées aux anticorps.Tournez à 30 rpm pendant 2 1/2 heures à quatre degrés Celsius. Ensuite, lavez-les deux fois avec 500 microlitres de tampon deux, puis deux fois avec 500 microlitres de tampon trois. Pour l’élitution finale, ajouter 100 microlitres de tampon trois contenant un peptide FLAG à 0,01 microgramme par microlitre, et tourner à quatre degrés Celsius pendant 1 1/2 heures.Après centrifugation à 500 fois g pendant une minute, transférer le supernatant dans un nouveau tube pré-refroidi. Prenez 10 microlitres à charger sur SDS-PAGE, et effectuer une coloration d’argent du gel pour contrôler la qualité de purification. Si la purification semble bonne, analyser les 90% laissés par LC-MS.Pour effectuer la normalisation, utilisez les formules pour normaliser les valeurs entre les cellules traitées par la drogue et les cellules non traitées pour l’ubiquitine et le GFP. Pour enlever l’arrière-plan, soustrayez les valeurs de l’échantillon de contrôle GFP des valeurs des échantillons d’ubiquitine, afin d’obtenir des valeurs spécifiques pour chaque protéine identifiée dans les deux conditions. Pour obtenir la variation de l’ubiquitination, obtenir un score entre moins 100 et plus 100 pour les variations positives et négatives des MNP induites par un médicament.La différence entre les valeurs spécifiques des échantillons traités et non traités est divisée par la somme de toutes les valeurs, y compris celles dans le contrôle, et multipliée par 100. Les variations inférieures à moins 50, représentant la répression du PTM, ou au-dessus de 50, représentant l’induction de PTM, sont considérées comme significatives. Utilisez cette formule pour obtenir une valeur de confiance comprise entre zéro et 100%Les valeurs supérieures à 50 sont généralement considérées comme confiantes.Pour obtenir une meilleure répartition des valeurs d’induction et de répression, et pour tenir compte à la fois des paramètres de variation et de confiance, utilisez cette formule pour multiplier les valeurs de variance et de confiance. Dans cette étude, la transduction des cellules mammifères de culture a été réalisée pour créer gfp et 6-histidine FLAG ubiquitine exprimant des cellules. L’efficacité de la transduction lentiviral a d’abord été contrôlée en examinant la fluorescence de GFP des cellules GFP-transduced.L’expression de FLAG-ubiquitine a été faite par coloration d’immunofluorescence utilisant un anticorps anti-FLAG, qui montre le pourcentage de cellules transduced. Afin de contrôler le niveau d’expression de flag-ubiquitine exogène, des lysates des cellules transduced ont été analysés par SDS-PAGE suivi de la tache occidentale avec l’anticorps anti-FLAG. Après purification des protéines ubiquitinées, 10% de l’élitution finale a été utilisée pour contrôler la quantité et l’intégrité du matériel purifié par SDS-PAGE et la coloration argentée du gel.Contexte La soustraction de l’échantillon GFP a identifié 364 protéines significativement ubiquitinées avec un score supérieur à 50%Une analyse d’enrichissement de ces protéines ubiquitinées a été effectuée afin de mettre en évidence les processus biologiques dans lesquels elles ont été impliquées. Réseaux d’interaction potentiels formés par des altérations induites par la gemcitabine de l’ubiquitination. Ceci a mené à l’identification des réseaux fonctionnels d’interaction fortement affectés par l’ubiquitination accrue ou diminuée des protéines impliquées.Il a également été confirmé que l’ubiquitination de PCNA a augmenté après traitement de gemcitabine. Il est très important d’éviter le transfert de certaines perles après les deux étapes d’élitution, car il peut entraîner une augmentation significative de l’arrière-plan. Cette procédure générera des modifications post-translationnelles spécifiques qui, en comparant différentes conditions, permettront d’identifier des modifications spécifiques.La première étape suivante sera de valider au moins les altérations d’intérêt basées sur des approches biochimiques. Nous avons développé cette méthode pour explorer les modifications post-translationnelles basées sur l’ubiquitine afin d’identifier de nouvelles façons et mécanismes des cellules cancéreuses pancréatiques. Depuis ce protocole et d’autres développés dans le monde entier ont été utilisés avec succès pour déchiffrer différents processus biologiques.Les lentivirus doivent être utilisés au moins en laboratoire BL-2. Guanidine est un agent de dénaturation forte et doit être utilisé avec soin. Le sonicateur peut également être nocif pour les oreilles et doivent être utilisés selon les recommandations.

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