Name: profiling ubiquitin and ubiquitin-like dependent post-translational modifications and identification of significant alterations
Uploaded: 2019-11-07T13:00:00
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Diese Arbeit wurde von La Ligue Contre le Cancer to HV und MS und der ARC (Association pour la recherche sur le cancer) an PS, INCa (institute national du cancer) und Canceropole PACA to JI unterstützt. Die Massenspektrometrieanlage von Marseille Proteomics (marseille-proteomique.univ-amu.fr) unterstützt von IBISA (Infrastructures Biologie Santé et Agronomie), Plateforme Technologique Aix-Marseille, der Cancéropéle PACA, der Provence-Alpes-Céte d'Azur Région, das Institut Paoli-Calmettes und das Centre de Recherche en Cancérologie de Marseille.

1. Erzeugung stabiler Zelllinien, die 6His-Flag-Ubl exdrücken
HINWEIS: Ko-Transfektion von HEK-293T-Zellen mit pCCL-6HF-Ubl, pVSVG und Delta-Helper.
<ol><li>Tag 0: Samen 293T Zellen in einer 6-Well-Platte, um 50-70% Zusammenfluss am Tag danach zu erhalten.</li>
	<li>Tag 1: Ko-Transfekte 50-70% konfluente Zellen mit einer Mischung aus 1 g pCCL-6HF-Ubl oder pCCL-GFP, 1 g pVSVG und 1 g Delta-Helper-Vektoren unter Verwendung eines Transfektionsreagenzes und eines Protokolls für die Lentivirus-...

<ol>
	<li>Prabakaran, S., Lippens, G., Steen, H., Gunawardena, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-translational+modification:+Nature's+escape+from+genetic+imprisonment+and+the+basis+for+dynamic+information+encoding.">Post-translational modification: Nature's escape from genetic imprisonment and the basis for dynamic information encoding.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: Systems Biology and Medicine. , (2012).</li><li>Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+and+function+of+ubiquitin-like+proteins.">Origin and function of ubiquitin-like proteins.</a> Nature. 458 (7237), 422-429 (2009).</li><li>Kirkpatrick, D. S., Weldon, S. F., Tsaprailis, G., Liebler, D. C., Gandolfi, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+identification+of+ubiquitinated+proteins+from+human+cells+expressing+His-tagged+ubiquitin.">Proteomic identification of ubiquitinated proteins from human cells expressing His-tagged ubiquitin.</a> Proteomics. 5 (8), 2104-2111 (2005).</li><li>Peng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+proteomics+approach+to+understanding+protein+ubiquitination.">A proteomics approach to understanding protein ubiquitination.</a> Nature Biotechnology. 21 (8), 921-926 (2003).</li><li>Matsumoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+analysis+of+the+human+ubiquitin-related+proteome.">Large-scale analysis of the human ubiquitin-related proteome.</a> Proteomics. 5 (16), 4145-4151 (2005).</li><li>Hjerpe, R., Rodr&#237;guez, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+approaches+for+characterizing+ubiquitinated+proteins.">Efficient approaches for characterizing ubiquitinated proteins.</a> Biochemical Society Transactions. 36 (5), 823-827 (2008).</li><li>Bonacci, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+new+mechanisms+of+cellular+response+to+chemotherapy+by+tracking+changes+in+post-translational+modifications+by+ubiquitin+and+ubiquitin-like+proteins.">Identification of new mechanisms of cellular response to chemotherapy by tracking changes in post-translational modifications by ubiquitin and ubiquitin-like proteins.</a> Journal of Proteome Research. 13 (5), 2478-2494 (2014).</li><li>Bedford, L., Lowe, J., Dick, L. R., Mayer, R. J., Brownell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin-like+protein+conjugation+and+the+ubiquitin-proteasome+system+as+drug+targets.">Ubiquitin-like protein conjugation and the ubiquitin-proteasome system as drug targets.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 10 (1), 29-46 (2011).</li><li>Hoeller, D., Dikic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+ubiquitin+system+in+cancer+therapy.">Targeting the ubiquitin system in cancer therapy.</a> Nature. 458 (7237), 438-444 (2009).</li><li>Silva, J. C., Gorenstein, M. V., Li, G. Z. Z., Vissers, J. P. C., Geromanos, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absolute+quantification+of+proteins+by+LCMSE:+a+virtue+of+parallel+MS+acquisition.">Absolute quantification of proteins by LCMSE: a virtue of parallel MS acquisition.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. , (2006).</li><li>Kim, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+and+quantitative+assessment+of+the+ubiquitin-modified+proteome.">Systematic and quantitative assessment of the ubiquitin-modified proteome.</a> Molecular Cell. 44 (2), 325-340 (2011).</li></ol>

Wir haben eine robuste und zuverlässige Methodik entwickelt, um Profile von Proteinen zu generieren, die von den wichtigsten Ubiquitin-Familienmitgliedern modifiziert wurden. In der Tat haben wir dieses Protokoll erfolgreich angewendet, um Profile von PTMs durch Ubiquitin, aber auch durch SUMO und Nedd8 zu generieren und Veränderungen im Zusammenhang mit einer Behandlung zu erkennen7, als Reaktion auf die Überexpression oder den Knockdown eines bestimmten Gens (Daten nicht und in Zellen, die ei...

Die hier vorgeschlagene Methode ist der Untersuchung von PTMs gewidmet, die von Ubiquitin-Familienmitgliedern aus kultivierten Säugetierzellen vermittelt werden, um potenzielle Veränderungen im Zusammenhang mit einer bestimmten Erkrankung (Behandlung, Differenzierung usw.) zu identifizieren. PTM stellen den letzten Schritt der Regulierung der Proteinfunktionendar 1. In der Tat, einmal von der translationalen Maschinerie produziert, die meisten, wenn nicht alle Proteine unterziehen verschiedene Arten von PTMs, die ihre Aktivität, molekulare Wechselwirkungen und intrazelluläre Lagemodulieren 1. Zu den vielen PTMs gehören die, die von der Ubiquitin-Familie von Proteinen vermittelt werden, Ubiquitin selbst und alle Ubiquitin-Likes, haben das Potenzial, alle intrazellulären oder teilweise zytoplasmatischen Proteine zu regulieren2. Da sie selbst Proteine sind, können sie miteinander konjugiert werden und homogene und heterogene Ketten unterschiedlicher Topologien bilden, die jeweils mit spezifischen regulatorischen Funktionen verbunden sind2. Werkzeuge werden benötigt, um zu versuchen, diese komplexe Maschinerie zu entschlüsseln und zu verstehen. Viele Ansätze wurden weltweit entwickelt, mit ihren eigenen Vor- und Nachteilen, und hier schlagen wir einen mit hoher Leistung für kultivierte Zellen vor.
Der Hauptvorteil dieser Methode ist ihre Genauigkeit. Tatsächlich wird die Reinheit isolierter modifizierter Proteine durch die kombinatorische Verwendung der beiden Tags (6His und Flag) und das Zwei-Stufen-Verfahren erheblich verbessert und ist daher viel selektiver als eine Single-Tag-Fusion Ub/Ubl3,4. Das Vorhandensein des 6His-Tags ermöglicht einen ersten Schritt der Reinigung in einem vollständig denaturierenden Zustand, wodurch jede Ko-Reinigung von Proteinen, die Ubiquitin-bindende Domänen oder andere Proteine enthalten, die an die ubiquitinierten binden, vermieden wird. Dies ist ein technisches Problem, auf das mehrere andere Ansätze stoßen, die auf der Affinitätsreinigung ubiquitinierter Proteome basieren, die entweder spezifische Antikörper5 oder Tandem-Ubiquitin-Bindungselemente (TUBEs)6verwenden. Wichtig ist, dass diese Technik nicht zugunsten der Reinigung einer bestimmten Art von Ubiquitination voreingenommen ist, da es bei einigen anderen Ansätzen der Fall sein könnte, da sowohl Mono- als auch verschiedene Arten von Polyubiquitinationen identifiziert wurden7. Folglich muss, sobald eine Veränderung der Ubiquitination gefunden wurde, durch biochemische Standardansätze genauer untersucht werden, um die genaue Art der Ubiquitination zu ermitteln.
Ein weiterer technischer Vorteil dieses Protokolls ist die Verwendung von Lentiviren, die leicht und schnell stabile zelllösende Zelllinien mit einem angemessenen Ausdrucksgrad des markierten Modifizierers erzeugen, ohne das normale Zellverhalten zu stören.
Während eine wichtige Rolle der Ubiquitination darin besteht, Proteine auf den proteasomalen Abbau auszurichten, ist es inzwischen bekannt, dass sie viele andere regulatorische Eigenschaften für potenziell die meisten intrazellulären oder teilweise intrazellulären Proteine hat1. Die Anzahl dieser Funktionen wird durch die Existenz vieler Ubiquitin-ähnlicher Proteine noch verstärkt, wodurch eine Familie von Proteinen gebildet wird, die fast jeden Zellmechanismus regulieren1. Ihre Veränderungen können drastische Auswirkungen auf die Zellbiologie haben und können zu pathologischen Situationen führen oder daran teilnehmen8, wie Krebs9. Daher sind Werkzeuge erforderlich, um diese weite Landschaft zu erforschen und die Veränderungen zu identifizieren, die mit einem pathologischen Zustand verbunden sind, der als neuartige therapeutische Ziele dienen könnte.
Dieses Protokoll ist Zellen in der Kultur gewidmet, da sie transduziert werden müssen, um exogene markierte Ub/Ubl auszudrücken. Nach der Erstellung können diese stabilen Zelllinien verwendet werden, um Ubl-Profile aus Kultur in 2D- oder 3D- oder Xenografts zu generieren und so den Horizont der verschiedenen experimentellen Modelle zu erweitern, die zum Studium von PTMs-Profilen angewendet werden können.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ANTI-FLAG M2 Affinity Gel</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2220-5ML</td>
			<td>binds all Flag tagged proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Flag M2 antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F3165</td>
			<td>to detect 6His-Flag tagged expression of ub/ubl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer 40 &#181;m</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td>to remove floating pellet from guanidine lysed cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flag peptide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F3290</td>
			<td>elute flag tagged proteins from anti-flag beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanidine hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>50933</td>
			<td>chaotropic agent used to denature all proteins in cell lysate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I5513</td>
			<td>eluates 6His bond proteins from Ni-NTA beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 3000</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>L3000015</td>
			<td>to transfect HEK-293T cells to produce lentiviruses</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lobind tubes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z666491</td>
			<td>avoids absorption of precious material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membrane Filter, 0.45 &#181;m</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>HAWP04700F1</td>
			<td>to filter the lentiviral supernantant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>30210</td>
			<td>purification of the 6His tag</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

profiling ubiquitin and ubiquitin-like dependent post-translational modifications and identification of significant alterations

Ubiquitin (ub) und ubiquitin-like (ubl) abhängige posttranslationale Modifikationen von Proteinen spielen grundlegende biologische regulatorische Rollen innerhalb der Zelle, indem sie Proteinstabilität, Aktivität, Wechselwirkungen und intrazelluläre Lokalisation kontrollieren. Sie ermöglichen es der Zelle, auf Signale zu reagieren und sich an Veränderungen in ihrer Umgebung anzupassen. Veränderungen innerhalb dieser Mechanismen können zu schweren pathologischen Situationen wie neurodegenerativen Erkrankungen und Krebs führen. Ziel der hier beschriebenen Technik ist es, ub/ubls abhängige PTMs-Profile schnell und genau aus kultivierten Zelllinien zu erstellen. Der Vergleich verschiedener Profile, die unter verschiedenen Bedingungen gewonnen werden, ermöglicht die Identifizierung spezifischer Veränderungen, wie sie z. B. durch eine Behandlung induziert werden. Lentivirale, vermittelte Zelltransduktion wird durchgeführt, um stabile Zelllinien zu erzeugen, die eine Zwei-Tags-Version (6His und Flag) des Modifikators (Ubiquitin oder ein Ubl wie SUMO1 oder Nedd8) exdrücken. Diese Tags ermöglichen die Reinigung von Ubiquitin und damit von ubiquitinierten Proteinen aus den Zellen. Dies geschieht durch einen zweistufigen Reinigungsprozess: Der erste wird unter Denaturierung von Bedingungen mit dem 6His-Tag und der zweite unter systemeigenen Bedingungen mit dem Flag-Tag durchgeführt. Dies führt zu einer hochspezifischen und reinen Isolierung modifizierter Proteine, die anschließend durch Flüssigchromatographie identifiziert und halbquantifiziert werden, gefolgt von der Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS)-Technologie. Die einfache informatierte Analyse von MS-Daten mit Excel-Software ermöglicht die Erstellung von PTM-Profilen durch eliminierung von Hintergrundsignalen. Diese Profile werden zwischen den einzelnen Bedingungen verglichen, um spezifische Veränderungen zu identifizieren, die dann genauer untersucht werden, beginnend mit ihrer Validierung durch Standard-Biochemie-Techniken.

Transduktion von Kultur-Säugetierzellen zur Erzeugung von GFP- und 6HF-Ub-exemitten Zellen Zur Herstellung von Lentiviren, die später zur Transduce von MiaPaCa-2-Zellen verwendet werden, werden 70% konfluente HEK-293T-Zellen mit einer gleichen Menge der drei Vektoren, pCCL-6HF-Ubiquitin oder GFP/Delta-Helper/pvSvG, kotransfiziert. Nach 24 h Produktion wird das Medium, das lentivirale Partikel enthält, zurückgewonnen und gefiltert. An dieser Stelle ist es möglich, ...

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Profiling Ubiquitin and Ubiquitin-like Dependent Post-translational Modifications and Identification of Significant Alterations

Dieses Protokoll zielt darauf ab, Ubiquitin (Ub) und Ubiquitin-Likes (Ubls) spezifische Proteome zu etablieren, um Änderungen dieser Art von post-translationalen Modifikationen (PTMs) zu identifizieren, die mit einer bestimmten Erkrankung wie einer Behandlung oder einem Phänotyp verbunden sind.

Profilierung von Ubiquitin und Ubiquitin-ähnlichen abhängigen posttranslationalen Änderungen und Identifizierung signifikanter Änderungen

Ubiquitin (ub) and ubiquitin-like (ubl) dependent post-translational modifications of proteins play fundamental biological regulatory roles within the ...

Dieses Protokoll ist eine einfache Möglichkeit, die Profile von Ubiquitin und Ubiquitin-ähnlichen post-translationalen Modifikationen zu generieren, indem spezifische identifizierte Proteine identifiziert und halbquantifiziert werden. Der Hauptvorteil dieser Technik ist die Verwendung von Lentiviren, um eine stabile Zelllinie der Expression innerhalb einer Woche zu schaffen, und die Verwendung von zwei Tags, um Proteine gezielt zu reinigen. Tatsächlich sind diese Post-Translations-Änderungen an den meisten biologischen Funktionen beteiligt, und Veränderungen dieses Mechanismus sind bei den meisten Krankheiten zu finden.Daher kann die Identifizierung dieser Veränderungen als prognostische und/oder diagnostische und natürlich als molekulare Targets dienen. Ubiquitin ist eines der am besten konservierten Protein in eukaryotischen Zellen und dies ist für ihr Überleben unerlässlich. Daher könnte diese Art von Methode auf jedes eukaryotische Modell angewendet werden, von Säugetieren bis Hefe.Unser lentivirales System beschränkt sich jedoch auf die Untersuchung von Zellen. Da das ganze Verfahren ziemlich lang ist mit manchmal langer Inkubationszeit, ist es möglich, es über zwei Tage statt eines zu tun. Das Eluat aus Nickelperlen kann bei minus 20 eingefroren werden und vor dem Hinzufügen der Flaggenperlen.Dieses Protokoll enthält viele Schritte, von denen einige entscheidend sind, um den endgültigen Erfolg der Reinigung zu gewährleisten, und damit die genaue Erstellung des post-translationalen Änderungsprofils. Die Demonstration des Verfahrens wird von Mirna Swayden und Aurelie Dobric, zwei Doktoranden des Labors, durchgeführt. Zunächst fügen Sie 0,5 mal 10 zu der sechsten der HEK 293T-Zellen in einer Sechs-Brunnen-Platte mit zwei Millilitern pro Brunnen DMEM mit 10%FBS zu Samen hinzu und brüten bei 37 Grad Celsius, 5% Kohlendioxid und 100% Luftfeuchtigkeit.Am nächsten Tag wird 50 bis 70% Zusammenfluss erreicht. Kotransfieren Sie die Zellen mit einer Mischung aus einem Mikrogramm pCCL-6HF-Ubiquitin-ähnlichen oder pCCL-GFP, einem Mikrogramm PBS VG und einem Mikrogramm Delta-Hilfsvektoren mit einem Transfektionsreagenz und Protokoll für die Lentivirus-Produktion. Ändern Sie nach sechs Stunden Transfektion das Medium in ein frisches Medium, das den zu transduzierenden Medien der zu transduzierenden Zellen entspricht.Säen Sie die Zellen, die in einer Sechs-Brunnen-Platte mit ihren Standard-Kulturmedien transduziert werden sollen, um am Tag danach 10 bis 20 % Zusammenfluss zu erhalten. 24 Stunden nach der Transfektion das Medium mit lentiviralen Partikeln wiederherstellen und mit 0,45-Mikron-Filtern filtern. Ersetzen Sie das Medium der zu transduzierenden Zellen durch das gefilterte Medium, das Lentiviren enthält.Inkubieren Sie die Zellen mit Lentiviren 24 bis 72 Stunden in einem Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid, und wechseln Sie dann das Medium mit frischem, Standard-Eins. Überprüfen Sie die GFP-Expression mit einem invertierten Fluoreszenzmikroskop, um die Effizienz der Transduktion zu bewerten. Wenn keine Fluoreszenz erkannt wird, warten Sie zwei bis drei Tage weiter.Wenn die GFP-Kontrolle mit grüner Fluoreszenz positiv ist, wachsen alle Zellen, bis sie genug haben, um eine Expressionskontrolle von 6-His-FLAG-Ubiquitin-ähnlichen durch Immunfluoreszenz durchzuführen, wie hier gezeigt, und westlichen Blot mit Anti-FLAG-Antikörper. Nach dem Anbau der Zellen in 15-Zentimeter-Geschirr die Kulturgerichte mindestens einmal mit phosphatgepufferter Saline bei Raumtemperatur waschen. Um mit der Zelllyse zu beginnen, fügen Sie zwei Milliliter Puffer eins in jede 15-Zentimeter-Schale bei Raumtemperatur ein.Verwenden Sie einen Zellschaber, um alle Lysate in 50-Milliliter-Konifugenröhren zurückzugewinnen. Sonicate die Lystates dreimal für 30 Sekunden, getrennt durch eine einminütige Pause. Zentrifugieren Sie die beschallten Lysate 15 Minuten lang mit 15.000 mal g.Übertragen Sie den Überstand durch ein 40-Mikron-Zellsieb auf ein neues Rohr. Es ist sehr wichtig, Lysate nach Beschallung und Zentrifugation zu filtern. Wenn dies nicht geschieht, kann dies zur Koreinigung vieler unspezifischer Proteine führen, wodurch der Hintergrund erhöht und die Größe des PTM-Profils stark reduziert wird.Übertragen Sie eine gleiche Menge Protein zwischen 50 und 100 Milligramm in neue Falcon-Röhrchen. Fügen Sie Nickel-Ionen-NTA-Perlen in jede Röhre mit der Menge von zwei Mikroliter Perlen pro einem Milligramm Protein hinzu. Legen Sie die Rohre auf einen Rotator, um bei 30 U/min für 2 1/2 Stunden bei Raumtemperatur zu drehen.Dann pellet die Perlen bei 500 mal g für fünf Minuten. Waschen Sie die Perlen mit einem Milliliter Puffer ein, und übertragen Sie die Proben in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr. Legen Sie die Röhre auf Eis.Zweimal mit einem Milliliter eiskalten Puffer zwei mit zehn Millimolar Imidazol waschen. Um elute-gebundene Proteine, fügen Sie 600 Mikroliter Puffer zwei enthält 250-Millimolar Imidazol, und rotieren für zwei Stunden bei vier Grad Celsius. Nachdem Sie die Perlen eine Minute lang per Zentrifugieren bei 500 mal g gepelt haben, den Überstand in ein neues vorgekühltes 1,5-Milliliter-Rohr übertragen und 50 Mikroliter Anti-FLAG M2-Antikörperkonjugatierte Perlen hinzufügen.Drehen Sie bei 30 Rpm für 2 1/2 Stunden bei vier Grad Celsius. Dann zweimal mit 500 Mikroliter Puffer zwei waschen, dann zweimal mit 500 Mikroliter Puffer drei. Für die endgültige Elution 100 Mikroliter Puffer drei hinzufügen, die ein FLAG-Peptid bei 0,01 Mikrogramm pro Mikroliter enthalten, und drehen Sie bei vier Grad Celsius für 1 1/2 Stunden.Nach der Zentrifugation bei 500 mal g für eine Minute, übertragen Sie den Überstand auf ein neues vorgekühltes Rohr. Nehmen Sie 10 Mikroliter, um auf SDS-PAGE zu laden, und führen Sie eine Silberfärbung des Gels durch, um die Reinigungsqualität zu kontrollieren. Wenn die Reinigung gut aussieht, analysieren Sie die 90%, die von LC-MS übrig bleiben.Um die Normalisierung durchzuführen, verwenden Sie die Formeln, um Werte zwischen medikamentös behandelten Zellen und unbehandelten Zellen für Ubiquitin und GFP zu normalisieren. Um den Hintergrund zu entfernen, subtrahieren Sie Die Werte in der Kontrollstichprobe GFP von den Werten in den Ubiquitin-Proben, um spezifische Werte für jedes identifizierte Protein unter beiden Bedingungen zu erhalten. Um die Variation der Ubiquitination zu erhalten, erhalten Sie einen Wert zwischen minus 100 und plus 100 für positive und negative Variationen von PTMs, die durch ein Medikament induziert werden.Die Differenz zwischen den spezifischen Werten der behandelten und der unbehandelten Proben wird durch die Summe aller Werte, einschließlich der Werte im Steuerelement, dividiert und mit 100 multipliziert. Variationen unter minus 50, die eine Repression von PTM oder über 50, die die Induktion von PTM darstellen, werden als signifikant angesehen. Verwenden Sie diese Formel, um einen Konfidenzwert zwischen Null und 100 %Werte über 50 zu erhalten, die in der Regel als sicher angesehen werden.Um eine schönere Verteilung der Induktions- und Repressionswerte zu erhalten und sowohl Variations- als auch Konfidenzparameter zu berücksichtigen, verwenden Sie diese Formel, um die Varianz- und Konfidenzwerte zu multiplizieren. In dieser Studie wurde die Transduktion von Kultur-Säugetierzellen erreicht, um GFP und 6-Histidin FLAG-Ubiquitin-exzessierende Zellen zu erzeugen. Die Wirksamkeit der lentiviralen Transduktion wurde zunächst durch die Betrachtung der GFP-Fluoreszenz von GFP-transduced-Zellen kontrolliert.Die Expression von FLAG-Ubiquitin erfolgte durch Immunfluoreszenzfärbung mit einem Anti-FLAG-Antikörper, der den Prozentsatz der transduzierten Zellen anzeigt. Um den Expressionsgrad von exogenem FLAG-Ubiquitin zu kontrollieren, wurden Lysate aus transduzierten Zellen von SDS-PAGE gefolgt von Western Blot mit Anti-FLAG-Antikörper analysiert. Nach der Reinigung der ubiquitinierten Proteine wurden 10% der endigen Elution verwendet, um die Menge und Integrität des gereinigten Materials durch SDS-PAGE und Silberfärbung des Gels zu kontrollieren.Die GfP-Probensubtraktion im Hintergrund identifizierte 364 Proteine, die signifikant mit einem Wert über 50% ubiquitiniert waren. Potenzielle interagierende Netzwerke, die durch Gemcitabin-induzierte Veränderungen der Ubiquitination gebildet werden. Dies führte zur Identifizierung von funktionellen interagierenden Netzwerken, die stark von einer erhöhten oder verminderten Ubiquitination der beteiligten Proteine betroffen sind.Es wurde auch bestätigt, dass die Ubiquitination von PCNA nach der Behandlung von Gemcitabin zunahm. Es ist sehr wichtig, die Übertragung von einigen Perlen nach beiden Elutionsschritten zu vermeiden, da es zu einer signifikanten Zunahme des Hintergrunds führen kann. Dieses Verfahren wird spezifische post-translationale Änderungen hervorbringen, die durch den Vergleich verschiedener Bedingungen die Identifizierung spezifischer Änderungen ermöglichen.Der erste nächste Schritt wird darin bestehen, zumindest die Änderungen von Interesse auf der Grundlage biochemischer Ansätze zu validieren. Wir haben diese Methode entwickelt, um ubiquitinbasierte, posttranslationale Modifikationen zu erforschen, um neue Wege und Mechanismen von Bauchspeicheldrüsenkrebszellen zu identifizieren. Da dieses Protokoll und andere weltweit entwickelte Protokolle erfolgreich eingesetzt wurden, um verschiedene biologische Prozesse zu entschlüsseln.Die Lentiviren müssen mindestens im BL-2 Labor eingesetzt werden. Guanidin ist ein starkes Denaturierungsmittel und muss sorgfältig eingesetzt werden. Der Beschallungsgerät kann auch für die Ohren schädlich sein und muss nach den Empfehlungen verwendet werden.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Method for Measuring RNA N6-methyladenosine Modifications in Cells and Tissues

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Verfahren zum Messen von RNA<em&gt; N</em<sup&gt; 6</sup&gt; -methyladenosine Änderungen in Zellen und Geweben

N6-Methyladenosine (m6A) modifications of RNA are diverse and ubiquitous amongst eukaryotes. They occur in mRNA, rRNA, tRNA, and microRNA. Recent studies ...

Forschung

Biochemie

Isolation of Intermediate Filament Proteins from Multiple Mouse Tissues to Study Aging-associated Post-translational Modifications

Isolierung von Zwischenfilamentproteinen aus mehreren Mausgeweben zur Untersuchung von altern-assoziierten posttranslationalen Modifikationen

Intermediate filaments (IFs), together with actin filaments and microtubules, form the cytoskeleton &#8211; a critical structural element of every cell. ...

Utilizing a Comprehensive Immunoprecipitation Enrichment System to Identify an Endogenous Post-translational Modification Profile for Target Proteins

Nutzung eines umfassenden Immunopräzipitation Bereicherung System um eine endogene Post-translationale Modifikation Profil für Zielproteine zu identifizieren

It is now well-appreciated that post-translational modifications (PTMs) play an integral role in regulating a protein&#39;s structure and function, which ...

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

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Polysome Profilerstellung in Leishmaniose, menschliche Zellen und Maus Hoden

Proper protein expression at the right time and in the right amounts is the basis of normal cell function and survival in a fast-changing environment. For ...

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

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Identifizierung von Cyclin-abhängige Kinase 1 spezifische Phosphorylierung Websites durch eine In-vitro- Kinase Assay

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

Nitropeptid Profilierung und Identifikation illustriert von Angiotensin II

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

Functional Characterization of RING-Type E3 Ubiquitin Ligases In Vitro and In Planta

Funktionelle Charakterisierung von RING-Typ E3 Ubiquitin Ligases In Vitro und In Planta

Ubiquitination, as a posttranslational modification of proteins, plays an important regulatory role in homeostasis of eukaryotic cells. The covalent ...

Ubiquitin Chain Analysis by Parallel Reaction Monitoring

Ubiquitin-Kettenanalyse durch Parallelreaktionsüberwachung

Assessment of the global profile of ubiquitin chain topologies within a proteome is of interest to answer a wide range of biological questions. The ...

Purification of Tubulin with Controlled Posttranslational Modifications and Isotypes from Limited Sources by Polymerization-Depolymerization Cycles

Reinigung von Tubulin mit kontrollierten posttranslationalen Modifikationen und Isotypen aus begrenzten Quellen durch Polymerisations-Depolymerisationszyklen

One important aspect of studies of the microtubule cytoskeleton is the investigation of microtubule behavior in in vitro reconstitution experiments. They ...

Ganglioside Extraction, Purification and Profiling

Gangliosidextraktion, -reinigung und -profilierung

Gangliosides are glycosphingolipids that contain one or more sialic acid residues. They are found on all vertebrate cells and tissues but are especially ...