Name: profiling ubiquitin and ubiquitin-like dependent post-translational modifications and identification of significant alterations
Uploaded: 2019-11-07T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Profiling Ubiquitin and Ubiquitin-like Dependent Post-translational Modifications and Identification of Significant Alterations at JoVE.com

עבודה זו נתמכת על ידי La ligue contre סרטן ל hv ו-MS, ו-ARC (העמותה למזוג לה מחקר sur לסרטן) ל-PS, אינקה (מכון לאומי du סרטן) ו הסרטן אופולה paca כדי JI. מתקן הספקטרומטר המסה של מרסיי פרוטאומניקס (marseille-proteomique.univ-amu.fr) נתמך על ידי IBISA (תשתיות ביולוגיי סנטרה et Agronomie), Plateforme טכנוגיטק אקס-מרסיי, הCancéropôle PACA, ה-פרובנס-אלפ-קוט ד'אזור רמיון, מכון פקולי-קלמטס ומרכז דה רצ'רצ'ה אן Cancérologie דה מרסיי.

1. הדור של קווי תאים יציבים המבטא 6His-דגל-Ubl
הערה: שיתוף משותף של תאים HEK-293T עם pCCL-6HF-Ubl, pVSVG ו דלתא עוזר.
<ol><li>יום 0: התאים 293T הזרע בצלחת 6-הבאר כדי להשיג 50-70% המפגש היום אחרי.</li>
	<li>יום 1: שיתוף 50-70% תאים confluent עם שילוב של 1 μg של pCCL-6HF-Ubl או pCCL-GFP, 1 μg של pVSVG ו-1 μg של דלתא-עוזר וקטורים, באמצעות מ...

<ol>
	<li>Prabakaran, S., Lippens, G., Steen, H., Gunawardena, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-translational+modification:+Nature's+escape+from+genetic+imprisonment+and+the+basis+for+dynamic+information+encoding.">Post-translational modification: Nature's escape from genetic imprisonment and the basis for dynamic information encoding.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: Systems Biology and Medicine. , (2012).</li><li>Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+and+function+of+ubiquitin-like+proteins.">Origin and function of ubiquitin-like proteins.</a> Nature. 458 (7237), 422-429 (2009).</li><li>Kirkpatrick, D. S., Weldon, S. F., Tsaprailis, G., Liebler, D. C., Gandolfi, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+identification+of+ubiquitinated+proteins+from+human+cells+expressing+His-tagged+ubiquitin.">Proteomic identification of ubiquitinated proteins from human cells expressing His-tagged ubiquitin.</a> Proteomics. 5 (8), 2104-2111 (2005).</li><li>Peng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+proteomics+approach+to+understanding+protein+ubiquitination.">A proteomics approach to understanding protein ubiquitination.</a> Nature Biotechnology. 21 (8), 921-926 (2003).</li><li>Matsumoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+analysis+of+the+human+ubiquitin-related+proteome.">Large-scale analysis of the human ubiquitin-related proteome.</a> Proteomics. 5 (16), 4145-4151 (2005).</li><li>Hjerpe, R., Rodr&#237;guez, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+approaches+for+characterizing+ubiquitinated+proteins.">Efficient approaches for characterizing ubiquitinated proteins.</a> Biochemical Society Transactions. 36 (5), 823-827 (2008).</li><li>Bonacci, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+new+mechanisms+of+cellular+response+to+chemotherapy+by+tracking+changes+in+post-translational+modifications+by+ubiquitin+and+ubiquitin-like+proteins.">Identification of new mechanisms of cellular response to chemotherapy by tracking changes in post-translational modifications by ubiquitin and ubiquitin-like proteins.</a> Journal of Proteome Research. 13 (5), 2478-2494 (2014).</li><li>Bedford, L., Lowe, J., Dick, L. R., Mayer, R. J., Brownell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin-like+protein+conjugation+and+the+ubiquitin-proteasome+system+as+drug+targets.">Ubiquitin-like protein conjugation and the ubiquitin-proteasome system as drug targets.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 10 (1), 29-46 (2011).</li><li>Hoeller, D., Dikic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+ubiquitin+system+in+cancer+therapy.">Targeting the ubiquitin system in cancer therapy.</a> Nature. 458 (7237), 438-444 (2009).</li><li>Silva, J. C., Gorenstein, M. V., Li, G. Z. Z., Vissers, J. P. C., Geromanos, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absolute+quantification+of+proteins+by+LCMSE:+a+virtue+of+parallel+MS+acquisition.">Absolute quantification of proteins by LCMSE: a virtue of parallel MS acquisition.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. , (2006).</li><li>Kim, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+and+quantitative+assessment+of+the+ubiquitin-modified+proteome.">Systematic and quantitative assessment of the ubiquitin-modified proteome.</a> Molecular Cell. 44 (2), 325-340 (2011).</li></ol>

פיתחנו מתודולוגיה חזקה ואמינה כדי ליצור פרופילים של חלבונים ששונו על ידי בני המשפחה אוביקוויב הראשי. אכן, יש לנו הוחל בהצלחה פרוטוקול זה כדי ליצור פרופילים של לפטין על ידי אוביקוויב, וגם על ידי סומו ו Nedd8, כדי לזהות שינויים הקשורים לטיפול7, בתגובה על הביטוי או הסתרה של גן מסוים (...

השיטה המוצעת כאן מוקדש לחקר הגברת המתווכת על ידי בני משפחה אוביקוויב מתאי יונקים מתורבתים כדי לזהות שינויים פוטנציאליים הקשורים בתנאי ספציפי (טיפול, בידול, וכו '). פטין מייצג את השלב האחרון של רגולציה של החלבונים ' פונקציות1. אכן, לאחר שיוצרו על ידי מכונות הטרנסלטיות, רוב אם לא כל החלבונים עוברים סוגים שונים של פטין כי לווסת את פעילותם, אינטראקציות מולקולריות, ו תאיים מיקום1. בין שפע של לפטין הם אלה בתיווך על ידי משפחת אוביקוויב של חלבונים, אוביקוויב עצמו ואת כל אוביקוויב-אוהב, יש את הפוטנציאל לווסת את כל החלבונים תאיים או חלקי cytoplasmic2. בגלל שהם עצמם חלבונים, הם יכולים להיות מצויידים אחד לשני, יצירת רשתות הומוגנית והטרוגנית של טופולוגיות שונות, כל אחד משויך פונקציות רגולטוריות ספציפיות2. כלים נחוצים כדי לנסות לפענח ולהבין זה מכונות מורכבות. גישות רבות פותחו ברחבי העולם, בעלי יתרונות וחסרונות משלהם, וכאן אנו מציעים אחד עם ביצועים גבוהים המתאימים לתאים מתורבתים.
היתרון העיקרי של שיטה זו הוא הדיוק שלה. אכן, הטוהר של חלבונים מבודדים שונה הוא משופר מאוד על ידי שימוש קומבינטורית של שני התגים (6his ודגל) ואת שני הליך ההליך ולכן זה הרבה יותר סלקטיבי מאשר תג אחד פיוז ' ן ו/ubl3,4. הנוכחות של התגית 6His מאפשר צעד ראשון של טיהור במצב מלאה לחלוטין ובכך הימנעות כל שיתוף טיהור של חלבונים המכילים אוביקוויב כריכה האיגוד או מחייב חלבונים אחרים של הכריכה. זוהי בעיה טכנית נתקל מספר גישות אחרות המבוססות על טיהור אהדה של פרוטמס אובימבחנות באמצעות נוגדנים ספציפיים5 או מרכיבים כריכה אוביקוויב (צינוריות)6. חשוב מכך, טכניקה זו אינה מוטה לטובת טיהור של סוג מסוים של אוביקווינציה, כפי שהוא יכול להיות במקרה של גישות אחרות, שכן הן מונו והן סוגים שונים של polyubiquitinations זוהו7. כתוצאה מכך, לאחר שנמצא, שינוי של אוביקווינציה יהיה צריך ללמוד בפרטים נוספים על ידי גישות ביוכימיות סטנדרטיות כדי לזהות את הסוג המדויק של אוביקווינציה המעורבים.
לבסוף, יתרון טכני נוסף של פרוטוקול זה הוא השימוש של וירוסים, כי בקלות ובמהירות יוצר ביטוי יציב קווי התא עם רמה סבירה של ביטויים של משנה מתויג מבלי להפריע התנהגות סלולרית נורמלית.
ואילו תפקיד חשוב אחד של אוביקווינציה היא למקד חלבונים עבור השפלה פרוטאספאל, ידוע כיום כי יש לו תכונות רגולטוריות רבות אחרות עבור חלבונים ביותר תאיים או באופן חלקי תאיים1. מספר הפונקציות הללו מוגבר עוד יותר על-ידי קיומם של אוביקווינים רבים כמו חלבונים, ויוצרים משפחה של חלבונים המסדירים כמעט כל מנגנוני תא1. שינויים שלהם יכול להיות השפעה דרסטית על ביולוגיה התא יכול להוביל או להשתתף במצבים פתולוגיים8, כגון סרטן9. מכאן, כלים נחוצים כדי לחקור את הנוף העצום הזה ולזהות את השינויים הקשורים במצב פתולוגי שיכול לשמש כמטרות טיפוליות מספר.
פרוטוקול זה מוקדש תאים בתרבות מאז הם צריכים להיות מתותמרים כדי לבטא אקסוגני מתויג ועוד/Ubl. לאחר שנוצר, אלה קווי תא יציבה ניתן להשתמש כדי ליצור פרופילים Ubl מהתרבות ב 2D או 3D או שתלי xenografts ובכך להאריך את האופק של מודלים ניסיוניים שונים, כי ניתן להחיל על לימוד לימודי פרופילים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ANTI-FLAG M2 Affinity Gel</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2220-5ML</td>
			<td>binds all Flag tagged proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Flag M2 antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F3165</td>
			<td>to detect 6His-Flag tagged expression of ub/ubl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer 40 &#181;m</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td>to remove floating pellet from guanidine lysed cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flag peptide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F3290</td>
			<td>elute flag tagged proteins from anti-flag beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanidine hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>50933</td>
			<td>chaotropic agent used to denature all proteins in cell lysate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I5513</td>
			<td>eluates 6His bond proteins from Ni-NTA beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 3000</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>L3000015</td>
			<td>to transfect HEK-293T cells to produce lentiviruses</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lobind tubes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z666491</td>
			<td>avoids absorption of precious material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membrane Filter, 0.45 &#181;m</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>HAWP04700F1</td>
			<td>to filter the lentiviral supernantant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>30210</td>
			<td>purification of the 6His tag</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

profiling ubiquitin and ubiquitin-like dependent post-translational modifications and identification of significant alterations

אוביקוויב (רוב) והשינויים התלויים שלאחר ההעברה של חלבונים לשחק תפקידים ביולוגיים בסיסיים בתוך התא על ידי שליטה ביציבות החלבון, פעילות, אינטראקציות, ולוקליזציה תאיים. הם מאפשרים לתאים להגיב לאותות ולהסתגל לשינויים בסביבתו. שינויים במנגנונים אלה עלולים לגרום למצבים פתולוגיים חמורים כגון מחלות ניווניות וסרטן. מטרת הטכניקה המתוארת כאן היא להקים פרופילים התלויים בפרופילי מדים והכל, במהירות ובדייקנות, מקווי תאים מתורבתים. השוואת פרופילים שונים המתקבלים מתנאים שונים מאפשרת זיהוי של שינויים ספציפיים, כגון אלה הנגרמת על ידי טיפול למשל. התמרה ויראלית מתווכת תא מבוצעת כדי ליצור קווי תאים יציבים המבטא שני תגים (6His ודגל) גירסה של משנה (אוביקוויב או ubl כגון SUMO1 או Nedd8). תגים אלה מאפשרים טיהור של אוביקוויב ולכן של חלבונים אוביקווילביים מן התאים. הדבר נעשה באמצעות תהליך טיהור דו-שלבים: הראשון מבוצע בתנאים מסוימים תוך שימוש בתגית השישית, והשני בתנאים מקוריים המשתמשים בתג ' דגל '. זה מוביל לבידוד מאוד ספציפי וטהור של חלבונים שהשתנו אשר מזוהים לאחר מכן למחצה כימות על ידי כרומטוגרפיה נוזלית ואחריו באמצעות ספקטרומטריה מאסיבית המסה (LC-MS/MS) טכנולוגיה. ניתוח לאינפורמטיקה קלה של נתוני MS באמצעות תוכנת Excel מאפשר הקמת פרופילי PTM על ידי ביטול אותות רקע. פרופילים אלה מושווים בין כל תנאי כדי לזהות שינויים ספציפיים אשר לאחר מכן ילמדו באופן ספציפי יותר, החל באימות שלהם על ידי טכניקות ביוכימיה סטנדרטית.

התמרה של תאי היונקים התרבותיים ליצירת תאים מבוססי GFP ו-6HF. כדי לייצר וירוסים שישמשו מאוחר יותר כדי לשנות את MiaPaCa-2 תאים, 70% confluent HEK-293T תאים הם שיתוף עם כמות שווה של שלושה וקטורים, pCCL-6HF-אוביקוויב או GFP/דלתא-עוזר/pvSvG. לאחר 24 שעות של ייצור, המדיום המכיל חלקיקי הנגיף הוא ה...

Watch this Scientific Journal Video about Profiling Ubiquitin and Ubiquitin-like Dependent Post-translational Modifications and Identification of Significant Alterations at JoVE.com

Profiling Ubiquitin and Ubiquitin-like Dependent Post-translational Modifications and Identification of Significant Alterations

פרוטוקול זה מטרתו להקים אוביקוויב (וכדומה) ו אוביקוויב-אוהב (Ubls) הפרוטאמים ספציפיים כדי לזהות שינויים של סוג זה של שינויים לאחר העברה (לאחר ההעברה), הקשורים במצב ספציפי כגון טיפול או פנוטיפים.

יצירת פרופיל אוביקוויפין ואוביקוויב-שינויים עצמאיים וזיהוי של שינויים משמעותיים

Ubiquitin (ub) and ubiquitin-like (ubl) dependent post-translational modifications of proteins play fundamental biological regulatory roles within the ...

פרוטוקול זה הוא דרך קלה ליצור את הפרופילים של אוביקיטין ושינויים פוסט-תרגומיים דמויי אוביקיטין על ידי זיהוי וכימות למחצה של חלבונים מזוהים ספציפיים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא השימוש lentiviruses כדי ליצור קו תא יציב של ביטוי בתוך שבוע, ואת השימוש בשני תגים כדי לטהר חלבונים במיוחד. למעשה, סוג זה של שינויים שלאחר התרגום מעורבים ברוב הפונקציות הביולוגיות, ושינויים של מנגנון זה נמצאים ברוב המחלות.לכן, זיהוי שינויים אלה עשוי לשמש פרוגנוסטי ו /או אבחון וכמובן מטרות מולקולריות. Ubiquitin הוא אחד החלבון החיסכון ביותר בתאים eukaryotic וזה חיוני להישרדותם. לכן, סוג זה של שיטה יכול להיות מיושם על כל מודל eukaryotic, מיונקים שמרים.עם זאת, מערכת lentiviral שלנו מוגבלת לחקר תאים. מאז כל ההליך הוא די ארוך עם זמן דגירה ארוך לפעמים, אפשר לעשות את זה במשך יומיים במקום אחד. ניתן להקפיא את ה-eluate מ-nickel חרוזים במינוס 20 ולפני הוספת גם גם את גם את גם גם את גם 10 חרוזי הניקל.פרוטוקול זה מכיל שלבים רבים ביניהם חלקם קריטיים על מנת להבטיח את ההצלחה הסופית של הטיהור, וכך הקמה מדויקת של פרופיל השינוי שלאחר התרגום. הפגנת ההליך תבוצע על ידי מירנה סווידן ואאורלי דובריק, שני דוקטורים של המעבדה. כדי להתחיל, להוסיף 0.5 פעמים 10 כדי השישי של תאי HEK 293T בצלחת שש באר עם שני מיליליטר לגם של DMEM עם 10% FBS לזרע, ודגירה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו חמצני, ו 100% לחות.למחרת מושגת התכנסות של 50 עד 70%. Cotransfect התאים עם תערובת של מיקרוגרם אחד של pCCL-6HF כמו או pCCL-GFP, מיקרוגרם אחד של PBS VG, ומיקרוגרם אחד של וקטורים עוזר דלתא באמצעות רהט transfection ופרוטוקול לייצור lentivirus. לאחר שש שעות של חילוף, שנה את המדיום למדיום טרי המתאים למדיית התאים שיש להחליף.זרע את התאים להיות מתמר בצלחת שש באר עם מדיה התרבות הסטנדרטית שלהם על מנת לקבל 10 עד 20% confluence ביום שאחרי. 24 שעות לאחר ההחלמה, לשחזר את המדיום המכיל חלקיקי lentiviral, ולסנן באמצעות מסנני 0.45 מיקרון. החלף את המדיה של התאים כדי להיות מומר על ידי המדיום המסונן המכיל lentiviruses.דגירה התאים עם lentiviruses במשך 24 עד 72 שעות באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני, ולאחר מכן לשנות את המדיום עם טרי, סטנדרטי אחד. בדוק ביטוי GFP באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך כדי להעריך את יעילות ההתמהמה. אם לא זוהתה פלואורסצנטיות, המתן ליומיים-שלושה נוספים.אם פקד GFP הוא חיובי עם פלואורסצנטיות ירוקה, לגדל את כל התאים עד שיש מספיק כדי לבצע שליטה ביטוי של 6-His-FLAG ubiquitin כמו על ידי immunofluorescence, כפי שמוצג כאן, ואת הכתם המערבי באמצעות נוגדן נגד FLAG. לאחר גידול התאים במנות של 15 ס"מ, שטפו את מנות התרבות לפחות פעם אחת עם מלוחים עם מאגר פוספט בטמפרטורת החדר. כדי להתחיל תריס תא, להוסיף שני מיליליטר של חיץ אחד לתוך כל צלחת 15 ס"מ בטמפרטורת החדר.השתמש מגרד תא לשחזר את כל lysates לתוך צינורות צנטריפוגה חרוט 50 מיליליטר. Sonicate lystates שלוש פעמים במשך 30 שניות, מופרדים על ידי הפסקה של דקה אחת. צנטריפוגה lysates sonicated ב 15, 000 פעמים גרם במשך 15 דקות.מעבירים את העל-טבעי לצינור חדש דרך מסננת תאים של 40 מיקרון. חשוב מאוד לסנן ליאזטים לאחר sonication וצנטריפוגה. לא עושה את זה עלול לגרום copurification של חלבונים רבים שאינם ספציפיים, ובכך להגדיל את הרקע מאוד להקטין את גודל פרופיל PTM.מעבירים כמות שווה של חלבון בין 50 ל-100 מיליגרם לצינורות פלקון חדשים. הוסף גם יון ניקל NTA חרוזים לתוך כל צינור עם כמות של שני microliters של חרוזים לכל מיליגרם אחד של חלבון. מניחים את הצינורות על מסובב כדי לסובב ב 30 סל"ד במשך 2 1/2 שעות בטמפרטורת החדר.ואז גלולה את חרוזים ב 500 פעמים g במשך חמש דקות. לשטוף את חרוזים עם מיליליטר אחד של חיץ אחד, ולהעביר את הדגימות לצינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מיליליטר. מניחים את הצינור על קרח.לשטוף פעמיים עם מיליליטר אחד של חיץ קר כקרח שני המכיל imidazole עשרה מילימולאר. כדי לסלק חלבונים, להוסיף 600 microliters של חיץ שני המכיל imidazole 250 מילימולאר, ולסובב במשך שעתיים בארבע מעלות צלזיוס. לאחר pelleting את חרוזים על ידי צנטריפוגה ב 500 פעמים גרם במשך דקה אחת, להעביר את supernatant לצינור חדש מקורר מראש 1.5 מיליליטר, ולהוסיף 50 microliters של בחנורים נוגדנים M2 אנטי-FLAG M2.סובב ב-30 סל"ד למשך שעתיים וחצי בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן לשטוף פעמיים עם 500 microliters של חיץ 2, ואז פעמיים עם 500 microliters של חיץ שלוש. לאליטיון הסופי, הוסיפו 100 מיקרוליטרים של חיץ 3 המכילים פפטיד FLAG ב-0.01 מיקרוגרם למיקרוליטר, וסובבו בארבע מעלות צלזיוס למשך שעה וחצי.לאחר צנטריפוגה ב 500 פעמים g במשך דקה אחת, להעביר את supernatant לצינור חדש מקורר מראש. יש ליטול 10 מיקרוליטרים כדי לטעון ב-SDS-PAGE, ולבצע הכתמת כסף של הג'ל כדי לשלוט באיכות הטיהור. אם הטיהור נראה טוב, נתח את ה- 90%שהותיר LC-MS.כדי לבצע נורמליזציה, השתמש בנוסחאות כדי לנרמל ערכים בין תאים שטופלו בסמים ותאים לא מטופלים עבור ubiquitin ו- GFP. להסרת רקע, חיסור ערכים בדגימה של פקד GFP ערכים בדגימות ubiquitin, כדי לקבל ערכים ספציפיים עבור כל חלבון מזוהה בשני התנאים. כדי להשיג את הווריאציה של בכל מקום, לקבל ציון בין מינוס 100 פלוס 100 עבור וריאציות חיוביות ושליליות של PTMs המושרה על ידי תרופה.ההפרש בין הערכים הספציפיים של דגימות מטופלות ודגימות לא מטופלות מחולק בסכום כל הערכים, כולל אלה בפקד, ומכפיל את ה- 100. וריאציות מתחת למינוס 50, המייצגות דיכוי של PTM, או מעל 50, המייצג אינדוקציה של PTM, נחשבות למשמעותיות. השתמש בנוסחה זו כדי להשיג ערך אמון בין אפס ל- 100%ערכים מעל 50 נחשבים בדרך כלל בטוחים.כדי להשיג התפלגות יפה יותר של ערכי אינדוקציה ודיכוי, ולשקול הן פרמטרים וריאציה וביטחון, השתמש בנוסחה זו כדי להכפיל את ערכי השונות והביטחון. במחקר זה, התמרה של תאים יונקים תרבות הושגה כדי ליצור GFP ו 6-היסטידין דגל בכל מקום להביע תאים. היעילות של התמרה lentiviral נשלטה לראשונה על ידי התבוננות פלואורסצנטיות GFP של תאים מתומרים GFP.הביטוי של FLAG-ubiquitin נעשה על ידי כתמי שפעת חיסונית באמצעות נוגדן נגד FLAG, אשר מראה את אחוז התאים שהתורמים. על מנת לשלוט ברמת הביטוי של FLAG-ubiquitin אקסוגני, ליזטים מתאים מתומרים נותחו על ידי SDS-PAGE ואחריו כתם מערבי עם נוגדן נגד FLAG. לאחר טיהור החלבונים בכל מקום, 10% מהאלוטיון הסופי שימש לשליטה בכמות ושלמות החומר המטוהר על ידי SDS-PAGE וכתמי כסף של הג'ל.חיסור מדגם GFP ברקע זיהה 364 חלבונים שנמצאים בכל מקום באופן משמעותי עם ציון מעל 50%A ניתוח העשרה של ערכת גנים של חלבונים אלה בכל מקום בוצע על מנת להדגיש את התהליכים הביולוגיים שבהם הם היו מעורבים. רשתות אינטראקציה פוטנציאליות שנוצרו על ידי שינויים הנגרמים על ידי gemcitabine של בכל מקום. זה הוביל לזיהוי של רשתות אינטראקציה תפקודית מושפע מאוד על ידי בכל מקום מוגבר או ירד של החלבונים המעורבים.זה גם אושר כי בכל מקום של PCNA גדל לאחר טיפול gemcitabine. חשוב מאוד להימנע מהעברת כמה חרוזים לאחר שני שלבי האלוטיון, שכן זה עלול לגרום לעלייה משמעותית ברקע. הליך זה ייצור שינויים ספציפיים שלאחר התרגום אשר, על ידי השוואת תנאים שונים, יאפשר זיהוי של שינויים ספציפיים.השלב הבא יהיה לאמת לפחות את שינויים של עניין המבוסס על גישות ביוכימיות. פיתחנו שיטה זו כדי לחקור בכל מקום מבוסס, שינויים שלאחר התרגום על מנת לזהות דרכים ומנגנונים חדשים של תאים סרטניים בלבלב. מאז פרוטוקול זה אחרים שפותחו ברחבי העולם הופעלו בהצלחה כדי לפענח תהליכים ביולוגיים שונים.יש להשתמש ב- lentiviruses לפחות במעבדת BL-2. גואנידין הוא סוכן denaturing חזק ויש להשתמש בו בזהירות. Sonicator יכול גם להזיק לאוזניים ויש להשתמש בו בעקבות המלצות.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Method for Measuring RNA N6-methyladenosine Modifications in Cells and Tissues

A Method for Measuring RNA N6-methyladenosine Modifications in Cells and Tissues

שיטה למדידת RNA<em&gt; N</em<sup&gt; 6</sup&gt; שינויי -methyladenosine ב תאים ורקמות

N6-Methyladenosine (m6A) modifications of RNA are diverse and ubiquitous amongst eukaryotes. They occur in mRNA, rRNA, tRNA, and microRNA. Recent studies ...

Isolation of Intermediate Filament Proteins from Multiple Mouse Tissues to Study Aging-associated Post-translational Modifications

בידוד של חלבונים ביניים חלבונים מ רקמות עכבר מרובות לחקר ההזדקנות הקשורים שינויים טרנסלוציוניים

Intermediate filaments (IFs), together with actin filaments and microtubules, form the cytoskeleton &#8211; a critical structural element of every cell. ...

Utilizing a Comprehensive Immunoprecipitation Enrichment System to Identify an Endogenous Post-translational Modification Profile for Target Proteins

ניצול מערכת העשרה Immunoprecipitation מקיף כדי לזהות פרופיל אנדוגני שינוי Post-translational של חלבונים היעד

It is now well-appreciated that post-translational modifications (PTMs) play an integral role in regulating a protein&#39;s structure and function, which ...

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

Polysome פרופיל לישמניה, תאים אנושיים, Testis העכבר

Proper protein expression at the right time and in the right amounts is the basis of normal cell function and survival in a fast-changing environment. For ...

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

זיהוי של קינאז תלוי-Cyclin 1 אתרי זירחון ספציפיים על-ידי קינאז במבחנה Assay

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

ניטרופפטיד פרופיל וזיהוי מאויר על ידי אנגיוטנסין השני

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

Functional Characterization of RING-Type E3 Ubiquitin Ligases In Vitro and In Planta

אפיון פונקציונלי של מסוג הטבעת E3 ליגטיות בתוך מבחנה ובפלאנטה

Ubiquitination, as a posttranslational modification of proteins, plays an important regulatory role in homeostasis of eukaryotic cells. The covalent ...

Ubiquitin Chain Analysis by Parallel Reaction Monitoring

ניתוח שרשרת Ubiquitin על ידי ניטור תגובה מקבילה

Assessment of the global profile of ubiquitin chain topologies within a proteome is of interest to answer a wide range of biological questions. The ...

Purification of Tubulin with Controlled Posttranslational Modifications and Isotypes from Limited Sources by Polymerization-Depolymerization Cycles

טיהור טובולין עם שינויים מבוקרים לאחר טרנסלציה ואיזוטיפים ממקורות מוגבלים על ידי מחזורי פידול-דפולימריזציה

One important aspect of studies of the microtubule cytoskeleton is the investigation of microtubule behavior in in vitro reconstitution experiments. They ...

Ganglioside Extraction, Purification and Profiling

מיצוי גנגליוסייד, טיהור ופרופיל

Gangliosides are glycosphingolipids that contain one or more sialic acid residues. They are found on all vertebrate cells and tissues but are especially ...