Name: profiling ubiquitin and ubiquitin-like dependent post-translational modifications and identification of significant alterations
Uploaded: 2019-11-07T13:00:00
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इस काम को ला लिग कॉन्ट्रे ले कैंसर द्वारा एचवी और एमएस को समर्थन दिया गया था, और एआरसी (एसोसिएशन पीएना ला रेचेचे सुर ले कैंसर) पीएस, आईएनसीए (इंस्टीट्यूट नेशनल ड्यू कैंसर) और कैंसरपोल पीएसीए को जीआई। आईबीआईएसए (इंफ्रास्ट्रक्चर्स बायोलॉजी सैंटे एट एग्रोनोमी), प्लेटफोर्म टेक्नोलोजिसिक एक्स-मार्सिले, कैनेरोपोले पैका, प्रोवेंस-आल्प्स-कोटे डी अज़ूर द्वारा समर्थित मार्सिले प्रोटेओमिक्स (marseille-proteomique.univ-amu.fr) की द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमेट्री सुविधा रेगिओन, इंस्टीट्यूट पाओली-लेसेट्स और सेंटर डी रेचेचे एन कैनसेरोलोजी डी मार्सिले।

1. स्थिर सेल लाइनों की पीढ़ी 6His-झंडा-Ubl व्यक्त
नोट: पीसीसीएल-6एचएफ-यूबीएल, पीवीएसवीजी और डेल्टा-हेल्पर के साथ एचईसी-293T कोशिकाओं का सह-ट्रांसफेक्शन।
<ol><li>दिन 0: एक 6 अच्छी तरह से थाली में बीज 293T कोशिका?...

<ol>
	<li>Prabakaran, S., Lippens, G., Steen, H., Gunawardena, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-translational+modification:+Nature's+escape+from+genetic+imprisonment+and+the+basis+for+dynamic+information+encoding.">Post-translational modification: Nature's escape from genetic imprisonment and the basis for dynamic information encoding.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: Systems Biology and Medicine. , (2012).</li><li>Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+and+function+of+ubiquitin-like+proteins.">Origin and function of ubiquitin-like proteins.</a> Nature. 458 (7237), 422-429 (2009).</li><li>Kirkpatrick, D. S., Weldon, S. F., Tsaprailis, G., Liebler, D. C., Gandolfi, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+identification+of+ubiquitinated+proteins+from+human+cells+expressing+His-tagged+ubiquitin.">Proteomic identification of ubiquitinated proteins from human cells expressing His-tagged ubiquitin.</a> Proteomics. 5 (8), 2104-2111 (2005).</li><li>Peng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+proteomics+approach+to+understanding+protein+ubiquitination.">A proteomics approach to understanding protein ubiquitination.</a> Nature Biotechnology. 21 (8), 921-926 (2003).</li><li>Matsumoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+analysis+of+the+human+ubiquitin-related+proteome.">Large-scale analysis of the human ubiquitin-related proteome.</a> Proteomics. 5 (16), 4145-4151 (2005).</li><li>Hjerpe, R., Rodr&#237;guez, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+approaches+for+characterizing+ubiquitinated+proteins.">Efficient approaches for characterizing ubiquitinated proteins.</a> Biochemical Society Transactions. 36 (5), 823-827 (2008).</li><li>Bonacci, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+new+mechanisms+of+cellular+response+to+chemotherapy+by+tracking+changes+in+post-translational+modifications+by+ubiquitin+and+ubiquitin-like+proteins.">Identification of new mechanisms of cellular response to chemotherapy by tracking changes in post-translational modifications by ubiquitin and ubiquitin-like proteins.</a> Journal of Proteome Research. 13 (5), 2478-2494 (2014).</li><li>Bedford, L., Lowe, J., Dick, L. R., Mayer, R. J., Brownell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin-like+protein+conjugation+and+the+ubiquitin-proteasome+system+as+drug+targets.">Ubiquitin-like protein conjugation and the ubiquitin-proteasome system as drug targets.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 10 (1), 29-46 (2011).</li><li>Hoeller, D., Dikic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+ubiquitin+system+in+cancer+therapy.">Targeting the ubiquitin system in cancer therapy.</a> Nature. 458 (7237), 438-444 (2009).</li><li>Silva, J. C., Gorenstein, M. V., Li, G. Z. Z., Vissers, J. P. C., Geromanos, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absolute+quantification+of+proteins+by+LCMSE:+a+virtue+of+parallel+MS+acquisition.">Absolute quantification of proteins by LCMSE: a virtue of parallel MS acquisition.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. , (2006).</li><li>Kim, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+and+quantitative+assessment+of+the+ubiquitin-modified+proteome.">Systematic and quantitative assessment of the ubiquitin-modified proteome.</a> Molecular Cell. 44 (2), 325-340 (2011).</li></ol>

हमने मुख्य सर्वव्यापक परिवार के सदस्यों द्वारा संशोधित प्रोटीन की प्रोफाइल उत्पन्न करने के लिए एक मजबूत और विश्वसनीय पद्धति विकसित की है। दरअसल, हमने सर्वव्यापकता द्वारा पीटीएमएस की प्रोफाइल उत्पन...

यहां प्रस्तावित विधि एक विशिष्ट स्थिति (उपचार, भेदभाव, आदि) से जुड़े संभावित परिवर्तनों की पहचान करने के लिए सुसंस्कृत स्तनधारी कोशिकाओं से सर्वव्यापक परिवार के सदस्यों द्वारा मध्यस्थता पीटीएमएस का अध्ययन करने के लिए समर्पित है। पीटीएमएस प्रोटीन के कार्यों के नियमन के अंतिम चरण का प्रतिनिधित्व करते हैं1। दरअसल, एक बार ट्रांसलेशनल मशीनरी द्वारा उत्पादित, सबसे अधिक नहीं तो सभी प्रोटीन विभिन्न प्रकार के पीटीएमएस से गुजरते हैं जो उनकी गतिविधि, आणविक बातचीत और इंट्रासेल्युलर स्थान1को मिलाते हैं। पीटीएमएस की अधिकता में प्रोटीन के सर्वव्यापी परिवार द्वारा मध्यस्थता करने वाले हैं, सर्वव्यापी स्वयं और सभी सर्वव्यापी-पसंद, सभी इंट्रासेलर या आंशिक रूप से साइटोप्लाज्मिक प्रोटीन2को विनियमित करने की क्षमता रखते हैं। क्योंकि वे खुद प्रोटीन हैं, वे एक दूसरे के लिए संयुग्मित किया जा सकता है, विविध topologies की सजातीय और विषम श्रृंखला बनाने, प्रत्येक विशिष्ट नियामक कार्यों के साथ जुड़े2। इस जटिल मशीनरी को समझने और समझने की कोशिश करने के लिए उपकरण की जरूरत है। दुनिया भर में कई दृष्टिकोण विकसित किए गए थे, जिनके अपने फायदे और नुकसान थे, और यहां हम सुसंस्कृत कोशिकाओं के लिए उपयुक्त उच्च प्रदर्शन के साथ एक का प्रस्ताव करते हैं।
इस विधि का मुख्य लाभ इसकी सटीकता है। दरअसल, अलग संशोधित प्रोटीन की शुद्धता दो टैग (6His और ध्वज) और दो कदम प्रक्रिया के संयोजन उपयोग से अत्यधिक सुधार हुआ है और इसलिए यह एक टैग फ्यूजन यूबी/यूबीएल3,4की तुलना में बहुत अधिक चयनात्मक है । 6His टैग की उपस्थिति पूरी तरह से इनकार करने वाली स्थिति में शुद्धि का पहला चरण सक्षम बनाती है जिससे सर्वव्यापी बाध्यकारी डोमेन या सर्वव्यापी लोगों के लिए बाध्यकारी अन्य प्रोटीन वाले प्रोटीन के किसी भी सह-शुद्धिकरण से बचा जा सकता है। यह एक तकनीकी समस्या है जो सर्वव्यापी प्रोटेम की आत्मीयता शुद्धि के आधार पर विशिष्ट एंटीबॉडी5 या टैंडेम सर्वव्यापी बाध्यकारी तत्वों (TUBEs)6का उपयोग करके कई अन्य दृष्टिकोणों द्वारा सामना करना पड़ा है। महत्वपूर्ण बात, यह तकनीक एक निश्चित प्रकार के सर्वव्यापकता के शुद्धिकरण के पक्ष में पक्षपाती नहीं है, क्योंकि यह कुछ अन्य दृष्टिकोणों के लिए मामला हो सकता है, क्योंकि मोनो और विभिन्न प्रकार के पॉलीयूबिओटिओशन दोनों की पहचान7की गई थी। नतीजतन, एक बार पाया, सर्वव्यापकता के परिवर्तन के लिए मानक जैव रासायनिक दृष्टिकोण द्वारा अधिक जानकारी में अध्ययन किया जाना होगा ताकि सर्वव्यापीकी सटीक तरह की पहचान करने के लिए शामिल है ।
अंत में, इस प्रोटोकॉल का एक और तकनीकी लाभ लेंटिवायरस का उपयोग है, जो सामान्य सेलुलर व्यवहार में हस्तक्षेप किए बिना टैग किए गए संशोधक की अभिव्यक्ति के उचित स्तर के साथ आसानी से और तेजी से स्थिर व्यक्त करने वाली सेल लाइनें बनाता है।
जबकि सर्वव्यापकता की एक महत्वपूर्ण भूमिका प्रोटेसोमल क्षरण के लिए प्रोटीन को लक्षित करना है, अब यह ज्ञात है कि इसमें संभावित रूप से सबसे अधिक इंट्रासेलर या आंशिक रूप से इंट्रासेल्युलर प्रोटीन1के लिए कई अन्य नियामक गुण हैं। इन कार्यों की संख्या प्रोटीन जैसे कई सर्वव्यापी के अस्तित्व से और अधिक बढ़ादी जाती है, जो लगभग हर कोशिका तंत्र1को विनियमित करने वाले प्रोटीन का परिवार बनाती है। इनके परिवर्तनों का कोशिका जीव विज्ञान पर भारी प्रभाव पड़ सकता है और वे कैंसर9जैसी पैथोलॉजिकलस्थितियोंमें ले जा सकते हैं या भाग ले सकते हैं . इसलिए, इस विशाल परिदृश्य का पता लगाने और एक रोग की स्थिति से जुड़े परिवर्तनों की पहचान करने के लिए उपकरणों की आवश्यकता होती है जो उपन्यास चिकित्सीय लक्ष्यों के रूप में काम कर सकती है।
यह प्रोटोकॉल संस्कृति में कोशिकाओं को समर्पित है क्योंकि उन्हें एक्सोजेनस टैग यूबी/यूबीएल को व्यक्त करने के लिए ट्रांसड्यू किए जाने की आवश्यकता है । एक बार बनाए जाने के बाद, इन स्थिर सेल लाइनों का उपयोग 2डी या 3 डी या ज़ेनोग्राफ्ट में संस्कृति से यूबीएल प्रोफाइल उत्पन्न करने के लिए किया जा सकता है, जिससे विभिन्न प्रयोगात्मक मॉडलों के क्षितिज का विस्तार हो ता है जिन्हें पीटीएमएस प्रोफाइल का अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ANTI-FLAG M2 Affinity Gel</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2220-5ML</td>
			<td>binds all Flag tagged proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Flag M2 antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F3165</td>
			<td>to detect 6His-Flag tagged expression of ub/ubl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer 40 &#181;m</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td>to remove floating pellet from guanidine lysed cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flag peptide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F3290</td>
			<td>elute flag tagged proteins from anti-flag beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanidine hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>50933</td>
			<td>chaotropic agent used to denature all proteins in cell lysate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I5513</td>
			<td>eluates 6His bond proteins from Ni-NTA beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 3000</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>L3000015</td>
			<td>to transfect HEK-293T cells to produce lentiviruses</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lobind tubes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z666491</td>
			<td>avoids absorption of precious material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membrane Filter, 0.45 &#181;m</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>HAWP04700F1</td>
			<td>to filter the lentiviral supernantant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>30210</td>
			<td>purification of the 6His tag</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

profiling ubiquitin and ubiquitin-like dependent post-translational modifications and identification of significant alterations

सर्वव्यापकता (यूबी) और सर्वव्यापी की तरह (यूबीएल) प्रोटीन के बाद अनुवादात्मक संशोधन प्रोटीन स्थिरता, गतिविधि, बातचीत, और इंट्रासेलुलर स्थानीयकरण को नियंत्रित करके कोशिका के भीतर मौलिक जैविक नियामक भूमिकाएं निभाते हैं। वे सेल को संकेतों का जवाब देने और अपने वातावरण में बदलाव के अनुकूल बनाने में सक्षम बनाते हैं। इन तंत्रों के भीतर परिवर्तन न्यूरोडीजेनेरेटिव बीमारियों और कैंसर जैसे गंभीर रोग स्थितियों का कारण बन सकते हैं। यहां वर्णित तकनीक का उद्देश्य सुसंस्कृत सेल लाइनों से यूबी/यूबीएलएस निर्भर पीटीएमएस प्रोफाइल को तेजी से और सही ढंग से स्थापित करना है । विभिन्न शर्तों से प्राप्त विभिन्न प्रोफाइल की तुलना विशिष्ट परिवर्तनों की पहचान की अनुमति देती है, जैसे कि उदाहरण के लिए उपचार द्वारा प्रेरित। लेंटिवायरल मध्यस्थता सेल ट्रांसड्यूक्शन को दो टैग (6His और फ्लैग) संस्करण को व्यक्त करने के लिए स्थिर सेल लाइनें बनाने के लिए किया जाता है जो संशोधक (सर्वव्यापी या यूबीबीएल जैसे एसयूबीओ1 या नेड8) का संस्करण है। ये टैग सर्वव्यापकता के शुद्धिकरण की अनुमति देते हैं और इसलिए कोशिकाओं से सर्वव्यापी प्रोटीन की अनुमति देते हैं। यह दो चरण शुद्धिकरण प्रक्रिया के माध्यम से किया जाता है: पहला 6His टैग का उपयोग करके शर्तों को डेन्टुरिंग में किया जाता है, और दूसरा फ्लैग टैग का उपयोग करके मूल परिस्थितियों में होता है। इससे संशोधित प्रोटीन का अत्यधिक विशिष्ट और शुद्ध अलगाव होता है जिसे बाद में तरल क्रोमेटोग्राफी द्वारा पहचाना जाता है और अर्ध-मात्रा निर्धारित की जाती है और उसके बाद मिलकर मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एलसी-एमएस/एमएस) प्रौद्योगिकी होती है । एक्सेल सॉफ्टवेयर का उपयोग करके एमएस डेटा का आसान सूचना विश्लेषण पृष्ठभूमि संकेतों को खत्म करके पीटीएम प्रोफाइल की स्थापना को सक्षम बनाता है। इन प्रोफाइल की तुलना प्रत्येक स्थिति के बीच की जाती है ताकि विशिष्ट परिवर्तनों की पहचान की जा सके, जिसका मानक जैव रसायन तकनीकों द्वारा उनके सत्यापन से शुरू होकर अधिक विशेष रूप से अध्ययन किया जाएगा।

जीएफपी और 6एचएफ-यूबी व्यक्त कोशिकाओं को बनाने के लिए संस्कृति स्तनधारी कोशिकाओं का ट्रांसड्यूक्शन लेंटिवायरस का उत्पादन करने के लिए जो बाद में MiaPaCa-2 कोशिकाओं को पार करने के लिए इस्त...

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Profiling Ubiquitin and Ubiquitin-like Dependent Post-translational Modifications and Identification of Significant Alterations

इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य सर्वव्यापकता (यूबी) और सर्वव्यापी-पसंद (यूबीएलएस) विशिष्ट प्रोटेम स्थापित करना है ताकि इस प्रकार के पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधनों (पीटीएमएस) के परिवर्तनों की पहचान की जा सके, जो उपचार या फेनोटाइप जैसी विशिष्ट स्थिति से जुड़े हैं।

सर्वव्यापकता और सर्वव्यापी की तरह निर्भर पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधनों और महत्वपूर्ण परिवर्तनों की पहचान की रूपरेखा

Ubiquitin (ub) and ubiquitin-like (ubl) dependent post-translational modifications of proteins play fundamental biological regulatory roles within the ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

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मापने शाही सेना के लिए एक विधि<em&gt; एन</em<sup&gt; 6</sup&gt; कोशिकाओं और ऊतकों में -methyladenosine संशोधनों

N6-Methyladenosine (m6A) modifications of RNA are diverse and ubiquitous amongst eukaryotes. They occur in mRNA, rRNA, tRNA, and microRNA. Recent studies ...

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इंटरमीडिएट फिलामेंट प्रोटीन का मल्टीपल माऊस ट्यूस्यूज से अलगाव, एजिंग से जुड़े पोस्ट-ट्रांसजेशनल संशोधनों का अध्ययन

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एक व्यापक Immunoprecipitation संवर्धन प्रणाली का उपयोग करने के लिए एक अंतर्जात पद-अनुवाद लक्ष्य प्रोटीन के लिए संशोधन प्रोफ़ाइल की पहचान

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One important aspect of studies of the microtubule cytoskeleton is the investigation of microtubule behavior in in vitro reconstitution experiments. They ...

Ganglioside Extraction, Purification and Profiling

गैंग्लियोसाइड निष्कर्षण, शुद्धिकरण और प्रोफाइलिंग

Gangliosides are glycosphingolipids that contain one or more sialic acid residues. They are found on all vertebrate cells and tissues but are especially ...