Name: profiling ubiquitin and ubiquitin-like dependent post-translational modifications and identification of significant alterations
Uploaded: 2019-11-07T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Profiling Ubiquitin and Ubiquitin-like Dependent Post-translational Modifications and Identification of Significant Alterations at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av La Ligue contre Le Cancer til HV og MS, og ARC (foreningen pour la Recherche sur Le kreft) til PS, INCa (instituttet nasjonale du kreft) og Canceropole PACA til JI. Massen massespektrometri anlegget av Marseille Proteomikk (marseille-proteomique.univ-amu.fr) støttet av IBISA (infrastruktur biologie santé et Agronomie), Plateforme Technologique Aix-Marseille, den Cancéropôle PACA, Provence-Alpes-Côte d'Azur Région, Institut Paoli-Calmettes og Centre de Recherche en Cancérologie de Marseille.

1. generering av stabile cellelinjer uttrykker 6His-Flag-ubl
Merk: co-transfeksjoner av HEK-293T celler med pCCL-6HF-ubl, pVSVG og delta-Helper.
<ol><li>Dag 0: Seed 293T celler i en 6-brønn plate for å få 50-70% samløpet dagen etter.</li>
	<li>Dag 1: co-transfect 50-70% confluent celler med en blanding av 1 mikrogram pCCL-6HF-ubl eller pCCL-GFP, 1 mikrogram pVSVG og 1 μg av delta-Helper-vektorer, ved hjelp av en transfeksjoner reagens og protokoll for lentivirus produksjon. Etter 6 h av...

<ol>
	<li>Prabakaran, S., Lippens, G., Steen, H., Gunawardena, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-translational+modification:+Nature's+escape+from+genetic+imprisonment+and+the+basis+for+dynamic+information+encoding.">Post-translational modification: Nature's escape from genetic imprisonment and the basis for dynamic information encoding.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: Systems Biology and Medicine. , (2012).</li><li>Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+and+function+of+ubiquitin-like+proteins.">Origin and function of ubiquitin-like proteins.</a> Nature. 458 (7237), 422-429 (2009).</li><li>Kirkpatrick, D. S., Weldon, S. F., Tsaprailis, G., Liebler, D. C., Gandolfi, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+identification+of+ubiquitinated+proteins+from+human+cells+expressing+His-tagged+ubiquitin.">Proteomic identification of ubiquitinated proteins from human cells expressing His-tagged ubiquitin.</a> Proteomics. 5 (8), 2104-2111 (2005).</li><li>Peng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+proteomics+approach+to+understanding+protein+ubiquitination.">A proteomics approach to understanding protein ubiquitination.</a> Nature Biotechnology. 21 (8), 921-926 (2003).</li><li>Matsumoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+analysis+of+the+human+ubiquitin-related+proteome.">Large-scale analysis of the human ubiquitin-related proteome.</a> Proteomics. 5 (16), 4145-4151 (2005).</li><li>Hjerpe, R., Rodr&#237;guez, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+approaches+for+characterizing+ubiquitinated+proteins.">Efficient approaches for characterizing ubiquitinated proteins.</a> Biochemical Society Transactions. 36 (5), 823-827 (2008).</li><li>Bonacci, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+new+mechanisms+of+cellular+response+to+chemotherapy+by+tracking+changes+in+post-translational+modifications+by+ubiquitin+and+ubiquitin-like+proteins.">Identification of new mechanisms of cellular response to chemotherapy by tracking changes in post-translational modifications by ubiquitin and ubiquitin-like proteins.</a> Journal of Proteome Research. 13 (5), 2478-2494 (2014).</li><li>Bedford, L., Lowe, J., Dick, L. R., Mayer, R. J., Brownell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin-like+protein+conjugation+and+the+ubiquitin-proteasome+system+as+drug+targets.">Ubiquitin-like protein conjugation and the ubiquitin-proteasome system as drug targets.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 10 (1), 29-46 (2011).</li><li>Hoeller, D., Dikic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+ubiquitin+system+in+cancer+therapy.">Targeting the ubiquitin system in cancer therapy.</a> Nature. 458 (7237), 438-444 (2009).</li><li>Silva, J. C., Gorenstein, M. V., Li, G. Z. Z., Vissers, J. P. C., Geromanos, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absolute+quantification+of+proteins+by+LCMSE:+a+virtue+of+parallel+MS+acquisition.">Absolute quantification of proteins by LCMSE: a virtue of parallel MS acquisition.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. , (2006).</li><li>Kim, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+and+quantitative+assessment+of+the+ubiquitin-modified+proteome.">Systematic and quantitative assessment of the ubiquitin-modified proteome.</a> Molecular Cell. 44 (2), 325-340 (2011).</li></ol>

Vi har utviklet en robust og pålitelig metodikk for å generere profiler av proteiner modifisert av de viktigste ubiquitin familiemedlemmene. Faktisk har vi brukt denne protokollen til å generere profiler av PTMs ved ubiquitin, og også av SUMO og Nedd8, og å oppdage endringer knyttet til en behandling7, som svar på over uttrykket eller knockdown av et bestemt gen (data ikke vist) og i celler som ervervet en resistent fenotype til ulike kjemoterapeutiske legemidler.
<p class="jove_content"...

Metoden foreslås her er dedikert til å studere PTMs formidlet av ubiquitin familiemedlemmer fra kultivert pattedyrceller for å identifisere potensielle endringer knyttet til en bestemt tilstand (behandling, differensiering, etc). PTMs representerer det siste trinnet i regulering av proteiner ' funksjoner1. Faktisk, en gang produsert av translational maskiner, de fleste om ikke alle proteiner gjennomgår ulike typer PTMs som modulere sin aktivitet, molekylære interaksjoner, og intracellulære plassering1. Blant overflod av PTMs er de mediert av ubiquitin familien av proteiner, ubiquitin seg selv og alle ubiquitin-liker, har potensial til å regulere alle intracellulære eller delvis cytoplasmatiske proteiner2. Fordi de er selv proteiner, kan de bli bøyd til hverandre, danner homogene og heterogene kjeder av mangfoldig topologi, hver knyttet til spesifikke regulatoriske funksjoner2. Verktøy er nødvendig for å prøve å dechiffrere og forstå denne komplekse maskiner. Mange tilnærminger ble utviklet over hele verden, har sine egne fordeler og ulemper, og her foreslår vi en med høy ytelse egnet for kulturperler celler.
Den største fordelen med denne metoden er dens nøyaktighet. Faktisk er renheten av isolerte modifiserte proteiner svært forbedret ved Kombinatorisk bruk av de to kodene (6His og flagg) og de to trinn-prosedyre, og derfor er det mye mer selektiv enn en enkelt tag Fusion UB/ubl3,4. Tilstedeværelsen av 6His koden gjør et første skritt i rensing i en fullt denaturering tilstand og dermed unngår enhver co-rensing av proteiner som inneholder ubiquitin bindende domener eller andre proteiner binding til ubiquitinated seg. Dette er et teknisk problem som oppdages av flere andre tilnærminger basert på affinitet rensing av ubiquitinated proteomes ved hjelp av enten spesifikke antistoffer5 eller tandem ubiquitin bindende elementer (TUBEs)6. Viktigere, denne teknikken er ikke partisk til fordel for rensing av en bestemt type ubiqitinering, som det kan være tilfelle for noen andre tilnærminger, siden både mono og ulike typer polyubiquitinations ble identifisert7. Følgelig, en gang grunnlegge, en omleggingen av ubiqitinering ville være nødt til å bli studert inne flere detaljene av målestokk biokjemiske tilnærmelser for at identifisere det pressepenger av type av ubiqitinering involvert.
Til slutt, en annen teknisk fordel med denne protokollen er bruk av lentiviruses, som enkelt og raskt skaper stabile uttrykker cellelinjer med rimelig nivå av uttrykk for kodede spesialfunksjoner uten å forstyrre den normale cellulære atferd.
Mens en viktig rolle ubiqitinering er å målrette proteiner for proteasomal degradering, er det nå kjent at den har mange andre regulatoriske egenskaper for potensielt mest intracellulære eller delvis intracellulære proteiner1. Antallet av disse funksjonene er ytterligere forsterket av eksistensen av mange ubiquitin som proteiner, danner en familie av proteiner som regulerer nesten alle celle mekanismer1. Deres endringer kan ha drastisk innvirkning på cellebiologi og kan lede eller delta i patologiske situasjoner8, som for eksempel kreft9. Derfor er verktøy som trengs for å utforske dette enorme landskapet og identifisere endringer knyttet til en patologisk tilstand som kan tjene som romanen terapeutiske mål.
Denne protokollen er dedikert til celler i kulturen siden de må være transduced å uttrykke eksogene Tagged UB/ubl. Når disse stabile cellelinjene er opprettet, kan de brukes til å generere ubl-profiler fra kultur i 2D-eller 3D-eller xenotransplantater, og dermed forlenge horisonten på de ulike eksperimentelle modellene som kan brukes til å studere PTMs-profiler.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ANTI-FLAG M2 Affinity Gel</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2220-5ML</td>
			<td>binds all Flag tagged proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Flag M2 antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F3165</td>
			<td>to detect 6His-Flag tagged expression of ub/ubl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer 40 &#181;m</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td>to remove floating pellet from guanidine lysed cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flag peptide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F3290</td>
			<td>elute flag tagged proteins from anti-flag beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanidine hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>50933</td>
			<td>chaotropic agent used to denature all proteins in cell lysate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I5513</td>
			<td>eluates 6His bond proteins from Ni-NTA beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 3000</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>L3000015</td>
			<td>to transfect HEK-293T cells to produce lentiviruses</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lobind tubes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z666491</td>
			<td>avoids absorption of precious material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membrane Filter, 0.45 &#181;m</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>HAWP04700F1</td>
			<td>to filter the lentiviral supernantant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>30210</td>
			<td>purification of the 6His tag</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

profiling ubiquitin and ubiquitin-like dependent post-translational modifications and identification of significant alterations

Ubiquitin (UB) og Ubiquitin (ubl) avhengig post-translational modifikasjoner av proteiner spille grunnleggende biologiske regulatoriske roller i cellen ved å kontrollere protein stabilitet, aktivitet, interaksjoner, og intracellulære lokalisering. De gjør det mulig for cellen å reagere på signaler og tilpasse seg endringer i miljøet. Endringer innenfor disse mekanismene kan føre til alvorlige patologiske situasjoner som nevrodegenerative sykdommer og kreft. Målet med teknikken er beskrevet her er å etablere UB/ubls avhengige PTMs profiler, raskt og nøyaktig, fra kulturperler cellelinjer. Sammenligningen av ulike profiler innhentet fra ulike forhold tillater identifisering av spesifikke endringer, slik som de som er indusert av en behandling for eksempel. Lentiviral mediert celle Transduction er utført for å lage stabile cellelinjer uttrykker en to-koder (6His og Flag) versjon av spesial (ubiquitin eller en ubl som SUMO1 eller Nedd8). Disse kodene tillater rensing av ubiquitin og derfor av ubiquitinated proteiner fra cellene. Dette gjøres gjennom en to-trinns rensing prosess: den første er utført i denaturering forhold ved hjelp av 6His-koden, og den andre i native vilkår ved hjelp av flagget tag. Dette fører til en svært spesifikk og ren isolering av modifiserte proteiner som senere identifiseres og semi-kvantifisert av flytende kromatografi etterfulgt av tandem masse massespektrometri (LC-MS/MS) teknologi. Enkel informatikk analyse av MS data ved hjelp av Excel-programvare muliggjør etablering av PTM profiler ved å eliminere bakgrunns signaler. Disse profilene er sammenlignet mellom hver betingelse for å identifisere spesifikke endringer som vil bli studert mer spesifikt, og starter med sin validering av standard biokjemi teknikker.

Transduction av kultur pattedyrceller for å lage GFP og 6HF-UB uttrykke celler Å produsere lentiviruses som vil bli brukt senere til å overfører MiaPaCa-2 celler, 70% confluent HEK-293T celler er co-transfekterte med en lik mengde av de tre vektorer, pCCL-6HF-Ubiquitin eller GFP/delta-Helper/pvSvG. Etter 24 h av produksjonen, er mediet som inneholder lentiviral partikler utvinnes og filtrert. Det er mulig på dette punktet å kontrollere effektiviteten av transfeks...

Watch this Scientific Journal Video about Profiling Ubiquitin and Ubiquitin-like Dependent Post-translational Modifications and Identification of Significant Alterations at JoVE.com

Profiling Ubiquitin and Ubiquitin-like Dependent Post-translational Modifications and Identification of Significant Alterations

Denne protokollen tar sikte på å etablere ubiquitin (UB) og ubiquitin (Ubls) spesifikke proteomes for å identifisere endringer av disse type post-translational modifikasjoner (PTMs), forbundet med en bestemt tilstand, for eksempel en behandling eller en fenotype.

Profilering Ubiquitin og Ubiquitin-lignende avhengige post-translational modifikasjoner og identifisering av vesentlige endringer

Ubiquitin (ub) and ubiquitin-like (ubl) dependent post-translational modifications of proteins play fundamental biological regulatory roles within the ...

Denne protokollen er en enkel måte å generere profiler av ubiquitin og ubiquitin-lignende post-translasjonelle modifikasjoner ved å identifisere og semi-kvantifisere spesifikke identifiserte proteiner. Den største fordelen med denne teknikken er bruk av lentivirus for å skape stabil cellelinje av uttrykk innen en uke, og bruk av to koder for å spesifikt rense proteiner. Faktisk er denne typen post-translasjonelle modifikasjoner involvert i de fleste biologiske funksjoner, og endringer av denne mekanismen finnes i de fleste sykdommer.Derfor kan identifisering av disse endringene tjene som en prognostisk og / eller diagnose og selvfølgelig som molekylære mål. Ubiquitin er et av de mest bevarte proteinene i eukaryotiske celler, og dette er avgjørende for deres overlevelse. Derfor kan denne typen metode brukes på en hvilken som helst eukaryotisk modell, fra pattedyr til gjær.Vårt lentiviralsystem er imidlertid begrenset til studiet av celler. Siden hele prosedyren er ganske lang med noen ganger lang inkubasjonstid, er det mulig å gjøre det over to dager i stedet for en. Eluatet fra nikkelperler kan fryses på minus 20 og før du legger til flaggperlene.Denne protokollen inneholder mange trinn hvorav noen er kritiske for å garantere den endelige suksessen til rensingen, og derfor nøyaktig etablering av post-translational modifikasjon profil. Demonstrert av prosedyren vil bli utført av Mirna Swayden og Aurelie Dobric, to ph.d.-studenter i laboratoriet. For å begynne, legg til 0,5 ganger 10 til den sjette av HEK 293T-celler i en seksbrønns plate med to milliliter per brønn av DMEM med 10% FBS til frø, og inkuber ved 37 grader Celsius, 5% karbondioksid og 100% fuktighet.Neste dag oppnås 50 til 70% samløpet. Sammensamne cellene med en blanding av ett mikrogram pCCL-6HF ubiquitin-lignende eller pCCL-GFP, ett mikrogram PBS VG, og ett mikrogram deltahjelpervektorer ved hjelp av en transfection reagens og protokoll for lentivirusproduksjon. Etter seks timers transfection, endre mediet til en frisk en som svarer til mediet av celler som skal transduseres.Seed cellene som skal transduseres i en seks-brønns plate med sine standard kulturmedier for å oppnå 10 til 20% samløpet dagen etter. 24 timer etter transfeksjon, gjenopprette mediet som inneholder lentiviral partikler, og filtrere ved hjelp av 0,45-mikron filtre. Erstatt mediet av cellene som skal transduseres av det filtrerte mediet som inneholder lentivirus.Inkuber cellene med lentivirus i 24 til 72 timer i en inkubator ved 37 grader Celsius og 5% karbondioksid, og endre deretter mediet med frisk, standard en. Kontroller GFP-uttrykket ved hjelp av et invertert fluorescerende mikroskop for å evaluere effektiviteten av transduksjon. Hvis det ikke oppdages fluorescens, vent i ytterligere to til tre dager.Hvis GFP-kontrollen er positiv med grønn fluorescens, vokse alle celler til de har nok til å utføre en uttrykkskontroll av 6-His-FLAG ubiquitin-lignende ved immunofluorescens, som vist her, og vestlig flekk ved hjelp av anti-FLAG antistoff. Etter å ha dyrket cellene i 15-centimeter retter, vask kulturrettene minst en gang med fosfatbufret saltvann ved romtemperatur. For å begynne cellelys, legg til to milliliter buffer en i hver 15-centimeter tallerken ved romtemperatur.Bruk en celleskraper til å gjenopprette alle lysates i 50-milliliter koniske sentrifugerør. Sonicate lystates tre ganger i 30 sekunder, atskilt med en ett minutt pause. Sentrifuge sonicated lysates på 15,000 ganger g i 15 minutter.Overfør det overnaturlige til et nytt rør gjennom en 40-mikron cellesil. Det er svært viktig å filtrere lysates etter sonikering og sentrifugering. Ikke gjør dette kan resultere i kopurification av mange ikke-spesifikke proteiner, og dermed øke bakgrunnen og sterkt redusere størrelsen på PTM-profilen.Overfør en lik mengde protein mellom 50 og 100 milligram til nye Falcon rør. Tilsett nikkelion NTA perler i hvert rør med mengden av to mikroliter perler per ett mg protein. Plasser rørene på en rotator for å rotere ved 30 o/min i 2 1/2 timer ved romtemperatur.Deretter pellet perlene på 500 ganger g i fem minutter. Vask perlene med en milliliter buffer en, og overfør prøvene til en 1,5-milliliter mikrocentrifuge tube. Plasser røret på isen.Vask to ganger med en milliliter iskald buffer to som inneholder ti millimolar imidazol. For å elute-bundet proteiner, tilsett 600 mikroliter buffer to som inneholder 250-millimolar imidazol, og rotere i to timer ved fire grader Celsius. Etter pelleting perlene ved sentrifugering på 500 ganger g i ett minutt, overføre supernatant til en ny forhåndskjølt 1,5-milliliter rør, og tilsett 50 mikroliter anti-FLAG M2 antistoff-konjugert perler.Roter ved 30 rpm i 2 1 / 2 timer ved fire grader Celsius. Vask deretter to ganger med 500 mikroliter buffer to, deretter to ganger med 500 mikroliter buffer tre. For den endelige elution, legg til 100 mikroliter buffer tre som inneholder et FLAG peptid på 0,01 mikrogram per mikroliter, og roter ved fire grader Celsius i 1 1/2 timer.Etter sentrifugering på 500 ganger g i ett minutt, overfør supernatanten til et nytt forhåndskjølt rør. Ta 10 mikroliter å laste på SDS-PAGE, og utfør en sølvfarging av gelen for å kontrollere rensekvaliteten. Hvis rensingen ser bra ut, analyserer du 90 %som er igjen av LC-MS.For å utføre normalisering, bruk formlene til å normalisere verdier mellom stoffbehandlede celler og ubehandlede celler for ubiquitin og GFP. For å fjerne bakgrunn, trekk verdier i kontrollprøven GFP fra verdier i ubiquitin-prøvene, for å oppnå spesifikke verdier for hvert identifiserte protein under begge forhold. For å oppnå variasjonen av ubiquitination, få en score mellom minus 100 og pluss 100 for positive og negative variasjoner av PTMs indusert av et stoff.Forskjellen mellom de spesifikke verdiene for behandlede og ubehandlede prøver deles på summen av alle verdier, inkludert de som er i kontrollen, og multiplisert med 100. Variasjoner under minus 50, som representerer undertrykkelse av PTM, eller over 50, som representerer induksjon av PTM, anses som signifikante. Bruk denne formelen til å få en konfidensverdi mellom null og 100 % verdier over 50 anses vanligvis å være sikre.For å få en bedre fordeling av induksjons- og undertrykkelsesverdier, og for å vurdere både variasjons- og konfidensparametere, bruk denne formelen til å multiplisere varians- og konfidensverdiene. I denne studien ble transduksjon av kultur pattedyrceller oppnådd for å skape GFP og 6-histidin FLAG ubiquitin uttrykke celler. Effekten av lentiviral transduksjon ble først kontrollert ved å se på GFP fluorescens av GFP-transduserte celler.Uttrykket av FLAG-ubiquitin ble gjort ved immunofluorescence farging ved hjelp av et anti-FLAG antistoff, som viser prosentandelen av transduserte celler. For å kontrollere uttrykksnivået av eksogen FLAG-ubiquitin ble lysater fra transduserte celler analysert av SDS-PAGE etterfulgt av vestlig flekk med anti-FLAG antistoff. Etter rensing av ubiquitinated proteiner, 10% av den endelige elution ble brukt til å kontrollere mengden og integriteten til renset materiale ved SDS-PAGE og sølv farging av gelen.Bakgrunn GFP prøve subtraksjon identifisert364 proteiner betydelig ubiquitinated med en score over 50%Et gensett berikelse analyse av disse ubiquitinated proteiner ble utført for å markere de biologiske prosessene der de var involvert. Potensielle interagerende nettverk dannet av gemcitabin-induserte endringer av ubiquitination. Dette førte til identifisering av funksjonelle interagerende nettverk sterkt påvirket av økt eller redusert ubiquitination av de involverte proteinene.Det ble også bekreftet at ubiquitination av PCNA økte etter gemcitabin behandling. Det er svært viktig å unngå overføring av noen perler etter begge elution trinn, siden det kan resultere i en betydelig økning av bakgrunn. Denne prosedyren vil generere spesifikke endringer etter oversettelsen som ved å sammenligne ulike betingelser vil muliggjøre identifisering av bestemte endringer.Det første neste trinnet vil være validere minst endringer av interesse basert på biokjemiske tilnærminger. Vi utviklet denne metoden for å utforske ubiquitin-baserte, post-translasjonelle modifikasjoner for å identifisere nye måter og mekanismer for kreftceller i bukspyttkjertelen. Siden denne protokollen og andre utviklet over hele verden har blitt ansatt med hell for å tyde ulike biologiske prosesser.Lentivirusene må brukes minst i BL-2-laboratoriet. Guanidine er et sterkt denaturingsmiddel og må brukes forsiktig. Sonicatoren kan også være skadelig for ørene og må brukes etter anbefalinger.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Method for Measuring RNA N6-methyladenosine Modifications in Cells and Tissues

A Method for Measuring RNA N6-methyladenosine Modifications in Cells and Tissues

En metode for måling av RNA<em&gt; N</em<sup&gt; 6</sup&gt; -methyladenosine Endringer i celler og vev

N6-Methyladenosine (m6A) modifications of RNA are diverse and ubiquitous amongst eukaryotes. They occur in mRNA, rRNA, tRNA, and microRNA. Recent studies ...

Isolation of Intermediate Filament Proteins from Multiple Mouse Tissues to Study Aging-associated Post-translational Modifications

Isolering av mellomproduktfilamentproteiner fra flere musvæsker til studie aldringsassosierte posttranslatoriske modifikasjoner

Intermediate filaments (IFs), together with actin filaments and microtubules, form the cytoskeleton &#8211; a critical structural element of every cell. ...

Utilizing a Comprehensive Immunoprecipitation Enrichment System to Identify an Endogenous Post-translational Modification Profile for Target Proteins

Bruker en omfattende Immunoprecipitation berikelse System for å identifisere en endogen post-translasjonell modifikasjon profil for målet proteiner

It is now well-appreciated that post-translational modifications (PTMs) play an integral role in regulating a protein&#39;s structure and function, which ...

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

Polysome profilering i Leishmania, menneskelige celler og mus testikkel

Proper protein expression at the right time and in the right amounts is the basis of normal cell function and survival in a fast-changing environment. For ...

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Identifikasjon av Cyclin-avhengige Kinase 1 bestemt fosforylering områder av en In Vitro Kinase analysen

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

Nitropeptide profilering og identifisering illustrert av angiotensin II

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

Functional Characterization of RING-Type E3 Ubiquitin Ligases In Vitro and In Planta

Funksjonell karakterisering av RING-type E3 Ubiquitin Ligases in vitro og i planta

Ubiquitination, as a posttranslational modification of proteins, plays an important regulatory role in homeostasis of eukaryotic cells. The covalent ...

Ubiquitin Chain Analysis by Parallel Reaction Monitoring

Ubiquitin-kjedeanalyse ved parallell reaksjonsovervåking

Assessment of the global profile of ubiquitin chain topologies within a proteome is of interest to answer a wide range of biological questions. The ...

Purification of Tubulin with Controlled Posttranslational Modifications and Isotypes from Limited Sources by Polymerization-Depolymerization Cycles

Rensing av Tubulin med kontrollerte posttranslasjonelle modifikasjoner og isotyper fra begrensede kilder ved polymerisering-depolymeriseringssykluser

One important aspect of studies of the microtubule cytoskeleton is the investigation of microtubule behavior in in vitro reconstitution experiments. They ...

Ganglioside Extraction, Purification and Profiling

Ganglioside utvinning, rensing og profilering

Gangliosides are glycosphingolipids that contain one or more sialic acid residues. They are found on all vertebrate cells and tissues but are especially ...