Name: profiling ubiquitin and ubiquitin-like dependent post-translational modifications and identification of significant alterations
Uploaded: 2019-11-07T13:00:00
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Este trabalho foi apoiado por La Ligue Contre le Cancer para HV e MS, e a ARC (associação pour la recherche sur le cancer) para PS, INCa (institute national du cancer) e Canceropole PACA to JI. A instalação de espectrometria de massa de Marselha Proteomics (marseille-proteomique.univ-amu.fr) apoiada pela IBISA (Infrastructures Biologie Santé et Agronomie), Plateforme Technologique Aix-Marseille, o Cancéropôle PACA, provence-Alpes-Côte d'Azur Région, o Institut Paoli-Calmettes e o Centre de Recherche en Cancérologie de Marseille.

1. Geração de linhas celulares estáveis expressando 6His-Flag-Ubl
NOTA: Co-transfecção de células HEK-293T com pCCL-6HF-Ubl, pVSVG e delta-Helper.
<ol><li>Dia 0: Células de sementes 293T em uma placa de 6 poços para obter confluência de 50-70% no dia seguinte.</li>
	<li>Dia 1: Co-transfect 50-70% de células confluentbiáticas com uma mistura de 1 μg de pCCL-6HF-Ubl ou pCCL-GFP, 1 μg de pVSVG e 1 μg de vetores delta-Helper, usando um reagente de transfecção e protocolo para pro...

<ol>
	<li>Prabakaran, S., Lippens, G., Steen, H., Gunawardena, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-translational+modification:+Nature's+escape+from+genetic+imprisonment+and+the+basis+for+dynamic+information+encoding.">Post-translational modification: Nature's escape from genetic imprisonment and the basis for dynamic information encoding.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: Systems Biology and Medicine. , (2012).</li><li>Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+and+function+of+ubiquitin-like+proteins.">Origin and function of ubiquitin-like proteins.</a> Nature. 458 (7237), 422-429 (2009).</li><li>Kirkpatrick, D. S., Weldon, S. F., Tsaprailis, G., Liebler, D. C., Gandolfi, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+identification+of+ubiquitinated+proteins+from+human+cells+expressing+His-tagged+ubiquitin.">Proteomic identification of ubiquitinated proteins from human cells expressing His-tagged ubiquitin.</a> Proteomics. 5 (8), 2104-2111 (2005).</li><li>Peng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+proteomics+approach+to+understanding+protein+ubiquitination.">A proteomics approach to understanding protein ubiquitination.</a> Nature Biotechnology. 21 (8), 921-926 (2003).</li><li>Matsumoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+analysis+of+the+human+ubiquitin-related+proteome.">Large-scale analysis of the human ubiquitin-related proteome.</a> Proteomics. 5 (16), 4145-4151 (2005).</li><li>Hjerpe, R., Rodr&#237;guez, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+approaches+for+characterizing+ubiquitinated+proteins.">Efficient approaches for characterizing ubiquitinated proteins.</a> Biochemical Society Transactions. 36 (5), 823-827 (2008).</li><li>Bonacci, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+new+mechanisms+of+cellular+response+to+chemotherapy+by+tracking+changes+in+post-translational+modifications+by+ubiquitin+and+ubiquitin-like+proteins.">Identification of new mechanisms of cellular response to chemotherapy by tracking changes in post-translational modifications by ubiquitin and ubiquitin-like proteins.</a> Journal of Proteome Research. 13 (5), 2478-2494 (2014).</li><li>Bedford, L., Lowe, J., Dick, L. R., Mayer, R. J., Brownell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin-like+protein+conjugation+and+the+ubiquitin-proteasome+system+as+drug+targets.">Ubiquitin-like protein conjugation and the ubiquitin-proteasome system as drug targets.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 10 (1), 29-46 (2011).</li><li>Hoeller, D., Dikic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+ubiquitin+system+in+cancer+therapy.">Targeting the ubiquitin system in cancer therapy.</a> Nature. 458 (7237), 438-444 (2009).</li><li>Silva, J. C., Gorenstein, M. V., Li, G. Z. Z., Vissers, J. P. C., Geromanos, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absolute+quantification+of+proteins+by+LCMSE:+a+virtue+of+parallel+MS+acquisition.">Absolute quantification of proteins by LCMSE: a virtue of parallel MS acquisition.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. , (2006).</li><li>Kim, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+and+quantitative+assessment+of+the+ubiquitin-modified+proteome.">Systematic and quantitative assessment of the ubiquitin-modified proteome.</a> Molecular Cell. 44 (2), 325-340 (2011).</li></ol>

Desenvolvemos uma metodologia robusta e confiável para gerar perfis de proteínas modificadas pelos principais membros da família ubiquitina. Na verdade, aplicamos com sucesso esse protocolo para gerar perfis de PTMs por ubiquitina, e também pela SUMO e Nedd8, e para detectar alterações associadas a um tratamento7,em resposta à expressão excessiva ou knockdown de um determinado gene (dados não mostrado) e em células que adquiriram um fenótipo resistente a diversos medicamentos quimioter?...

O método aqui proposto é dedicado ao estudo de PTMs mediados pelos membros da família ubiquitina de células de mamíferos cultivadas, a fim de identificar potenciais alterações associadas a uma condição específica (tratamento, diferenciação, etc). Os PTMs representam o último passo da regulação das funções das proteínas1. De fato, uma vez produzido pelas máquinas translacionais, a maioria, se não todas as proteínas, passam por diferentes tipos de PTMs que modulam sua atividade, interações moleculares e localização intracelular1. Entre a pletora de PTMs estão os mediados pela família ubiquitinde de proteínas, ubiquitina em si e todos os ubiquitina-likes, têm o potencial de regular todas as proteínas intracelulares ou parcialmente citoplasmic2. Por serem proteínas, elas podem ser conjugadas entre si, formando cadeias homogêneas e heterogêneas de diversas topologias, cada uma associada a funções regulatórias específicas2. Ferramentas são necessárias para tentar decifrar e entender essa máquina complexa. Muitas abordagens foram desenvolvidas em todo o mundo, tendo suas próprias vantagens e desvantagens, e aqui propomos uma com alto desempenho adequado para células cultivadas.
A principal vantagem deste método é a sua precisão. Na verdade, a pureza das proteínas modificadas isoladas é altamente melhorada pelo uso combinatório das duas tags (6His e Flag) e os dois passos de procedimento e, portanto, é muito mais seletivo do que uma única marca de fusão Ub / Ubl3,4. A presença da tag 6Sua permite um primeiro passo de purificação em uma condição totalmente desativação, evitando assim qualquer co-purificação de proteínas contendo domínios de ligação ubiquitina ou outras proteínas que se ligam aos ubiquitinados. Este é um problema técnico encontrado por várias outras abordagens com base na purificação de afinidade de proteomas ubiquitinados usando anticorpos específicos5 ou elementos de ligação à ubiquitina tandem (TUBEs)6. Importante, esta técnica não é tendenciosa em favor da purificação de um certo tipo de ubiquitinação, como poderia ser o caso de algumas outras abordagens, uma vez que tanto mono e diferentes tipos de polionionciações foram identificados7. Consequentemente, uma vez encontrado, uma alteração da ubiquitinação terá que ser estudada em mais detalhes por abordagens bioquímicas padrão, a fim de identificar o tipo exato de ubiquitinação envolvida.
Finalmente, outra vantagem técnica deste protocolo é o uso de lentivírus, que cria facilmente e rapidamente linhas celulares expressantes estáveis com nível razoável de expressões de modificador marcado sem interferir com o comportamento celular normal.
Considerando que um papel importante da ubiquitinação é direcionar proteínas para degradação proteassômica, sabe-se agora que tem muitas outras propriedades regulatórias para proteínas potencialmente intracelulares ou parcialmente intracelulares1. O número dessas funções é ainda mais aumentado pela existência de muitas ubiquitinas como proteínas, formando uma família de proteínas que regulam quase todos os mecanismos celulares1. Suas alterações podem ter impacto drástico na biologia celular e podem levar ou participar de situações patológicas8,como o câncer9. Assim, são necessárias ferramentas para explorar esta vasta paisagem e identificar as alterações associadas a uma condição patológica que poderia servir como novos alvos terapêuticos.
Este protocolo é dedicado às células da cultura, uma vez que precisam ser transduzidas para expressar ub/Ubl marcados exógenos. Uma vez criadas, essas linhas celulares estáveis podem ser usadas para gerar perfis Ubl a partir da cultura em 2D ou 3D ou xenoenxertos, ampliando assim o horizonte dos diferentes modelos experimentais que podem ser aplicados para estudar perfis de PTMs.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ANTI-FLAG M2 Affinity Gel</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2220-5ML</td>
			<td>binds all Flag tagged proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Flag M2 antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F3165</td>
			<td>to detect 6His-Flag tagged expression of ub/ubl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer 40 &#181;m</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td>to remove floating pellet from guanidine lysed cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flag peptide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F3290</td>
			<td>elute flag tagged proteins from anti-flag beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanidine hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>50933</td>
			<td>chaotropic agent used to denature all proteins in cell lysate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I5513</td>
			<td>eluates 6His bond proteins from Ni-NTA beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 3000</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>L3000015</td>
			<td>to transfect HEK-293T cells to produce lentiviruses</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lobind tubes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z666491</td>
			<td>avoids absorption of precious material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membrane Filter, 0.45 &#181;m</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>HAWP04700F1</td>
			<td>to filter the lentiviral supernantant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>30210</td>
			<td>purification of the 6His tag</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

profiling ubiquitin and ubiquitin-like dependent post-translational modifications and identification of significant alterations

Ubiquitina (ub) e ubiquitina-like (ubl) modificações pós-translacionais dependentes de proteínas desempenham papéis fundamentais de regulamentação biológica dentro da célula, controlando a estabilidade de proteínas, atividade, interações e localização intracelular. Eles permitem que a célula responda aos sinais e se adapte às mudanças em seu ambiente. Alterações nesses mecanismos podem levar a situações patológicas graves, como doenças neurodegenerativas e cânceres. O objetivo da técnica descrita aqui é estabelecer perfis de PTMs dependentes ub/ubls, de forma rápida e precisa, a partir de linhas celulares cultivadas. A comparação de diferentes perfis obtidos de diferentes condições permite a identificação de alterações específicas, como as induzidas por um tratamento, por exemplo. A transdução de células mediadas lentivirais é realizada para criar linhas celulares estáveis expressando uma versão de duas tags (6His e Flag) do modificador (ubiquitina ou um ubl como SUMO1 ou Nedd8). Essas marcas permitem a purificação da ubiquitina e, portanto, de proteínas ubiquitinadas das células. Isso é feito através de um processo de purificação de duas etapas: O primeiro é realizado em condições de desestruturação usando a tag 6His, e o segundo em condições nativas usando a tag Flag. Isso leva a um isolamento altamente específico e puro de proteínas modificadas que são posteriormente identificadas e semiquantificadas por cromatografia líquida seguida saqueade sem espectrometria de massa (LC-MS/MS) tecnologia. A análise de informática fácil dos dados de EM usando o software Excel permite o estabelecimento de perfis PTM eliminando sinais de fundo. Esses perfis são comparados entre cada condição, a fim de identificar alterações específicas que serão estudadas mais especificamente, começando com sua validação por técnicas de bioquímica padrão.

Transdução de células de mamíferos culturais para criar células expressantes GFP e 6HF-Ub Para produzir lentivírus que serão usados mais tarde para transduzir células MiaPaCa-2, 70% das células de confluentes HEK-293T são co-transfeccionadas com uma quantidade igual dos três vetores, pCCL-6HF-Ubiquitin ou GFP/Delta-Helper/pvSvG. Após 24 h de produção, o meio contendo partículas lentivirais é recuperado e filtrado. É possível neste momento controlar a ...

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Profiling Ubiquitin and Ubiquitin-like Dependent Post-translational Modifications and Identification of Significant Alterations

Este protocolo visa estabelecer proteomas específicos de ubiquitina (Ub) e ubiquitina (Ubls), a fim de identificar alterações desse tipo de modificações pós-translacional (PTMs), associadas a uma condição específica, como tratamento ou fenótipo.

Perfil de Ubiquitin e Ubiquitin-like Modificações pós-translacionais dependentes e identificação de alterações significativas

Ubiquitin (ub) and ubiquitin-like (ubl) dependent post-translational modifications of proteins play fundamental biological regulatory roles within the ...

Este protocolo é uma maneira fácil de gerar os perfis de ubiquitina e modificações pós-translacionais semelhantes à ubiquidade, identificando e semi-quantificando proteínas identificadas específicas. A principal vantagem dessa técnica é o uso de lentivírus para criar uma linha de expressão celular estável dentro de uma semana, e o uso de duas tags para purificar especificamente proteínas. De fato, esse tipo de modificações pós-translacionais estão envolvidas na maioria das funções biológicas, e alterações desse mecanismo são encontradas na maioria das doenças.Portanto, a identificação dessas alterações pode servir como prognóstico e/ou diagnóstico e, claro, como alvos moleculares. A ubiquitina é uma das proteínas mais conservadas em células eucarióticas e isso é essencial para sua sobrevivência. Portanto, esse tipo de método poderia ser aplicado a qualquer modelo eucariótico, de mamíferos a leveduras.No entanto, nosso sistema lentiviral está restrito ao estudo das células. Como todo o procedimento é bastante longo com tempo de incubação às vezes longo, é possível fazê-lo ao longo de dois dias em vez de um. O elunato de contas de níquel pode ser congelado a menos 20 e antes de adicionar as contas de bandeira.Este protocolo contém muitas etapas entre as quais alguns são críticos para garantir o sucesso final da purificação e, portanto, o estabelecimento preciso do perfil de modificação pós-translacional. A demonstração do procedimento será realizada por Mirna Swayden e Aurelie Dobric, duas alunas de doutorado do laboratório. Para começar, adicione 0,5 vezes 10 ao sexto das células HEK 293T em uma placa de seis poços com dois mililitros por poço de DMEM com 10% de FBS à semente, e incubar a 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono e 100% de umidade.No dia seguinte, 50 a 70% de confluência é alcançada. Cotransfeito as células com uma mistura de um micrograma de pCCL-6HF semelhante a ubiquitina ou pCCL-GFP, um micrograma de PBS VG, e um micrograma de vetores de ajudante delta usando um reagente de transfecção e protocolo para produção de lentivírus. Após seis horas de transfecção, mude o meio para um novo correspondente à mídia das células a serem transduzidas.Semear as células a serem transduzidas em uma placa de seis poços com seus meios de cultura padrão, a fim de obter confluência de 10 a 20% no dia seguinte. 24 horas após a transfecção, recupere o meio contendo partículas lentivirais e filtre usando filtros de 0,45 mícrons. Substitua o meio das células a serem transduzidas pelo meio filtrado contendo lentivírus.Incubar as células com lentivírus por 24 a 72 horas em uma incubadora a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono, e depois alterar o meio com um fresco e padrão. Verifique a expressão GFP usando um microscópio fluorescente invertido para avaliar a eficiência da transdução. Se não for detectada fluorescência, espere mais dois ou três dias.Se o controle GFP for positivo com fluorescência verde, cresça todas as células até ter o suficiente para realizar um controle de expressão de ubiquitina 6-His-FLAG por imunofluorescência, como mostrado aqui, e mancha ocidental usando anticorpo anti-FLAG. Depois de cultivar as células em pratos de 15 centímetros, lave os pratos da cultura pelo menos uma vez com soro fisco tamponado a temperatura ambiente. Para começar a lise celular, adicione dois mililitros de tampão um em cada prato de 15 centímetros à temperatura ambiente.Use um raspador de células para recuperar todos os linfits em tubos de centrífuga cônica de 50 mililitros. Sonicar os estados três vezes por 30 segundos, separados por uma pausa de um minuto. Centrifugar os lises sônicas a 15.000 vezes g durante 15 minutos.Transfira o supernante para um novo tubo através de um coador de células de 40 mícrons. É muito importante filtrar lises após sônica e centrifugação. Não fazer isso pode resultar na copurificação de muitas proteínas não específicas, aumentando assim o fundo e reduzindo fortemente o tamanho do perfil PTM.Transfira uma quantidade igual de proteína entre 50 e 100 miligramas para novos tubos Falcon. Adicione contas de íons de níquel em cada tubo com a quantidade de dois microliters de contas por um miligrama de proteína. Coloque os tubos em um rotador para girar a 30 rpm durante 2 horas e meia em temperatura ambiente.Em seguida, pelota as contas a 500 vezes g por cinco minutos. Lave as contas com um mililitro de tampão um, e transfira as amostras para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Coloque o tubo no gelo.Lave duas vezes com um mililitro de tampão gelado dois contendo imidazol de dez milimiliar. Às proteínas ligadas ao elto, adicione 600 microliters de tampão dois contendo imidazol de 250 mililitros, e gire por duas horas a quatro graus Celsius. Depois de pelotizar as contas por centrifugação a 500 vezes g por um minuto, transfira o supernante para um novo tubo pré-resfriado de 1,5 mililitro, e adicione 50 microliters de contas conjugadas anti-FLAG M2.Gire a 30 rpm por 2 horas e meia a quatro graus Celsius. Em seguida, lave duas vezes com 500 microliters de tampão dois, depois duas vezes com 500 microliters de buffer três. Para a eluição final, adicione 100 microliters de buffer três contendo um peptídeo FLAG a 0,01 micrograma por microliter, e gire a quatro graus Celsius por 1 1/2 horas.Após centrifugação a 500 vezes g por um minuto, transfira o supernatante para um novo tubo pré-refrigerado. Leve 10 microliters para carregar no SDS-PAGE, e realize uma coloração prateada do gel para controlar a qualidade da purificação. Se a purificação parecer boa, analise os 90% deixados pela LC-MS.Para realizar a normalização, use as fórmulas para normalizar valores entre células tratadas com drogas e células não tratadas para ubiquitina e GFP. Para remover o fundo, subtraia valores na amostra de controle GFP de valores nas amostras de ubiquitina, para obter valores específicos para cada proteína identificada em ambas as condições. Para obter a variação da ubiquização, obtenha um escore entre menos 100 e mais 100 para variações positivas e negativas de PTMs induzidos por uma droga.A diferença entre os valores específicos das amostras tratadas e não tratadas é dividida pela soma de todos os valores, incluindo os do controle, e multiplicada por 100. Variações abaixo de menos 50, representando a repressão do PTM, ou acima de 50, representando a indução do PTM, são consideradas significativas. Use esta fórmula para obter um valor de confiança entre zero e 100% Valores acima de 50 são geralmente considerados confiantes.Para obter uma distribuição mais agradável dos valores de indução e repressão, e considerar tanto os parâmetros de variação quanto de confiança, use essa fórmula para multiplicar os valores de variância e confiança. Neste estudo, a transdução de células de mamíferos culturais foi alcançada para criar células de ubiquitina GFP e 6-histidinas. A eficácia da transdução lentiviral foi primeiramente controlada olhando para a fluorescência GFP das células transduzidas pelo GFP.A expressão da FLAG-ubiquitina foi feita por manchas de imunofluorescência usando um anticorpo anti-FLAG, que mostra a porcentagem de células transduzidas. Para controlar o nível de expressão da exógena FLAG-ubiquitina, os lysates de células transduzidas foram analisados por SDS-PAGE seguido de mancha ocidental com anticorpo antiflamato. Após a purificação das proteínas ubiquitinadas, 10% da elução final foi utilizada para controlar a quantidade e integridade do material purificado pela SDS-PAGE e pela coloração de prata do gel.Subtração amostra GFP de fundo identificou 364 proteínas significativamente ubiquitinadas com pontuação acima de 50%Uma análise de enriquecimento de conjunto genético dessas proteínasubiquitinadas foi realizada para destacar os processos biológicos em que estavam envolvidos. Potenciais redes de interação formadas por alterações induzidas por gemcitabina de ubiquização. Isso levou à identificação de redes de interação funcional fortemente afetadas pelo aumento ou diminuição da ubiquização das proteínas envolvidas.Também foi confirmado que a ubiquização da PCNA aumentou após o tratamento gemcitabina. É muito importante evitar a transferência de algumas contas após ambas as etapas de eluição, uma vez que pode resultar em um aumento significativo de fundo. Este procedimento gerará modificações pós-translacionais específicas que, ao comparar diferentes condições, permitirão a identificação de alterações específicas.O primeiro próximo passo será validar pelo menos as alterações de interesse com base em abordagens bioquímicas. Desenvolvemos este método para explorar modificações pós-translacionais baseadas em ubiquína, a fim de identificar novas formas e mecanismos de células cancerígenas pancreáticas. Desde este protocolo e outros desenvolvidos em todo o mundo têm sido empregados com sucesso para decifrar diferentes processos biológicos.Os lentivírus devem ser usados pelo menos no laboratório BL-2. Guanidine é um agente forte de desnaturação e tem que ser usado com cuidado. O sonicator também pode ser prejudicial para os ouvidos e deve ser usado seguindo recomendações.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

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Bioquímica

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