Name: profiling ubiquitin and ubiquitin-like dependent post-translational modifications and identification of significant alterations
Uploaded: 2019-11-07T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Profiling Ubiquitin and Ubiquitin-like Dependent Post-translational Modifications and Identification of Significant Alterations at JoVE.com

Эта работа была поддержана La Ligue Contre ле Рак В. И. и MS, и АРК (ассоциация за ла recherche сюр-ле-рак) для PS, INCa (институт национального рака) и Canceropole PACA в JI. Объект масс-спектрометрии Марсель Протеомика (marseille-proteomique.univ-amu.fr) при поддержке IBISA (Инфраструктура Биология Санте и Агрономия), Plateforme Technologique Aix-Марсель, Канцеропеле PACA, Прованс-Альпы-Кот-д'Азур "Ригион", Институт Паоли-Кальметтс и Центр Рехерче-ан-Кансьологи-де-Марсель.

1. Поколение стабильных клеточных линий, выражающих 6His-Flag-Ubl
ПРИМЕЧАНИЕ: Со-трансфекция HEK-293T клеток с pCCL-6HF-Ubl, pVSVG и дельта-Хелпер.
<ol><li>День 0: Семена 293T клетки в 6-хорошо пластины для получения 50-70% слияния на следующий день после.</li>
	<li>День 1: Со-трансфект 50-70% сопливых клеток ...

<ol>
	<li>Prabakaran, S., Lippens, G., Steen, H., Gunawardena, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-translational+modification:+Nature's+escape+from+genetic+imprisonment+and+the+basis+for+dynamic+information+encoding.">Post-translational modification: Nature's escape from genetic imprisonment and the basis for dynamic information encoding.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: Systems Biology and Medicine. , (2012).</li><li>Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+and+function+of+ubiquitin-like+proteins.">Origin and function of ubiquitin-like proteins.</a> Nature. 458 (7237), 422-429 (2009).</li><li>Kirkpatrick, D. S., Weldon, S. F., Tsaprailis, G., Liebler, D. C., Gandolfi, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+identification+of+ubiquitinated+proteins+from+human+cells+expressing+His-tagged+ubiquitin.">Proteomic identification of ubiquitinated proteins from human cells expressing His-tagged ubiquitin.</a> Proteomics. 5 (8), 2104-2111 (2005).</li><li>Peng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+proteomics+approach+to+understanding+protein+ubiquitination.">A proteomics approach to understanding protein ubiquitination.</a> Nature Biotechnology. 21 (8), 921-926 (2003).</li><li>Matsumoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+analysis+of+the+human+ubiquitin-related+proteome.">Large-scale analysis of the human ubiquitin-related proteome.</a> Proteomics. 5 (16), 4145-4151 (2005).</li><li>Hjerpe, R., Rodr&#237;guez, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+approaches+for+characterizing+ubiquitinated+proteins.">Efficient approaches for characterizing ubiquitinated proteins.</a> Biochemical Society Transactions. 36 (5), 823-827 (2008).</li><li>Bonacci, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+new+mechanisms+of+cellular+response+to+chemotherapy+by+tracking+changes+in+post-translational+modifications+by+ubiquitin+and+ubiquitin-like+proteins.">Identification of new mechanisms of cellular response to chemotherapy by tracking changes in post-translational modifications by ubiquitin and ubiquitin-like proteins.</a> Journal of Proteome Research. 13 (5), 2478-2494 (2014).</li><li>Bedford, L., Lowe, J., Dick, L. R., Mayer, R. J., Brownell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin-like+protein+conjugation+and+the+ubiquitin-proteasome+system+as+drug+targets.">Ubiquitin-like protein conjugation and the ubiquitin-proteasome system as drug targets.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 10 (1), 29-46 (2011).</li><li>Hoeller, D., Dikic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+ubiquitin+system+in+cancer+therapy.">Targeting the ubiquitin system in cancer therapy.</a> Nature. 458 (7237), 438-444 (2009).</li><li>Silva, J. C., Gorenstein, M. V., Li, G. Z. Z., Vissers, J. P. C., Geromanos, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absolute+quantification+of+proteins+by+LCMSE:+a+virtue+of+parallel+MS+acquisition.">Absolute quantification of proteins by LCMSE: a virtue of parallel MS acquisition.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. , (2006).</li><li>Kim, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+and+quantitative+assessment+of+the+ubiquitin-modified+proteome.">Systematic and quantitative assessment of the ubiquitin-modified proteome.</a> Molecular Cell. 44 (2), 325-340 (2011).</li></ol>

Мы разработали надежную и надежную методологию для генерации профилей белков, модифицированных основными членами семьи убиквитин. Действительно, мы успешно применили этот протокол для генерации профилей ПТМ по убиквитину, а также SUMO и Nedd8, а также для обнаружения изменений, связанных ?...

Предложенный здесь метод предназначен для изучения ПТМ при посредничестве членов семьи убиквитин из культивированных клеток млекопитающих, с тем чтобы определить потенциальные изменения, связанные с конкретным условием (лечение, дифференциация и т.д.). ПТМ представляют собой последний этап регуляции функций белков1. Действительно, когда-то производится переводного механизма, большинство, если не все белки проходят различные виды ПТМ, которые модулируют их активность, молекулярные взаимодействия, и внутриклеточного расположения1. Среди множества ПТМ являются те, опосредовано семьи убиквитин белков, убиквитин себя и все убиквитин-любит, имеют потенциал для регулирования всех внутриклеточных или частично цитоплазматических белков2. Потому что они сами белки, они могут быть сопряжены друг с другом, образуя однородные и неоднородные цепи различных топологий, каждый из которых связан с конкретными регулятивными функциями2. Инструменты необходимы, чтобы попытаться расшифровать и понять этот сложный механизм. Многие подходы были разработаны во всем мире, имея свои преимущества и недостатки, и здесь мы предлагаем один с высокой производительностью подходит для культивированных клеток.
Основным преимуществом этого метода является его точность. Действительно, чистота изолированных модифицированных белков значительно улучшилась за счет комбинаторного использования двух тегов (6His и Flag) и двух шагов-процедур, и поэтому он гораздо более избирательным, чем один тег слияния Ub/Ubl3,4. Наличие тега 6His позволяет первый шаг очистки в полностью денатурации состоянии тем самым избегая каких-либо совместной очистки белков, содержащих убиквитин связывания доменов или других белков, связывающихся с вездесущими. Это техническая проблема, с которой сталкиваются несколько других подходов, основанных на сродстве очистки убиквитинаированных протеомсов с использованием либо конкретных антител5 или тандема убиквитин связывающих элементов (TUBEs)6. Важно отметить, что этот метод не является предвзятым в пользу очищения определенного типа вездесущности, как это может быть в случае некоторых других подходов, так как как моно и различные виды полиубичинаций были определены7. Следовательно, как только будет установлено, что изменение убиквитинации должно быть изучено более подробно с помощью стандартных биохимических подходов, с тем чтобы определить точный вид убиквитина.
Наконец, еще одним техническим преимуществом этого протокола является использование лентивирусов, которые легко и быстро создают стабильные экспрессионные клеточные линии с разумным уровнем выражений помеченного модификатора, не мешая нормальному клеточному поведению.
В то время как одна важная роль повсеместновиления заключается в целевой белков для протеасомальной деградации, в настоящее время известно, что он имеет много других регуляторных свойств для потенциально наиболее внутриклеточных или частично внутриклеточных белков1. Количество этих функций еще больше усиливается существованием многих убиквитин, как белки, образуя семейство белков, регулирующих почти каждый клеточный механизм1. Их изменения могут иметь резкое влияние на биологию клеток и может привести или участвовать в патологических ситуациях8, таких как рак9. Таким образом, инструменты необходимы для изучения этого обширного ландшафта и определить изменения, связанные с патологическим состоянием, которое может служить в качестве новых терапевтических целей.
Этот протокол предназначен для клеток в культуре, так как они должны быть трансуктором, чтобы выразить экзогенные помечены Ub / Ubl. После создания эти стабильные клеточные линии могут быть использованы для генерации профилей Ubl из культуры в 2D или 3D или xenografts, тем самым расширяя горизонт различных экспериментальных моделей, которые могут быть применены для изучения профилей PTMs.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ANTI-FLAG M2 Affinity Gel</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2220-5ML</td>
			<td>binds all Flag tagged proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Flag M2 antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F3165</td>
			<td>to detect 6His-Flag tagged expression of ub/ubl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer 40 &#181;m</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td>to remove floating pellet from guanidine lysed cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flag peptide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F3290</td>
			<td>elute flag tagged proteins from anti-flag beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanidine hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>50933</td>
			<td>chaotropic agent used to denature all proteins in cell lysate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I5513</td>
			<td>eluates 6His bond proteins from Ni-NTA beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 3000</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>L3000015</td>
			<td>to transfect HEK-293T cells to produce lentiviruses</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lobind tubes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z666491</td>
			<td>avoids absorption of precious material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membrane Filter, 0.45 &#181;m</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>HAWP04700F1</td>
			<td>to filter the lentiviral supernantant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>30210</td>
			<td>purification of the 6His tag</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

profiling ubiquitin and ubiquitin-like dependent post-translational modifications and identification of significant alterations

Убиквитин (уб) и убиквитин-подобные (убл) зависимые посттрансляционные изменения белков играют фундаментальную биологическую регулятивную роль в клетке, контролируя стабильность белка, активность, взаимодействия и внутриклеточную локализацию. Они позволяют клетке реагировать на сигналы и адаптироваться к изменениям в ее среде. Изменения в этих механизмах могут привести к тяжелым патологическим ситуациям, таким как нейродегенеративные заболевания и раковые заболевания. Цель описанного здесь метода состоит в том, чтобы установить ub/ubls зависимые профили ПТМ, быстро и точно, от культивированных клеточных линий. Сравнение различных профилей, полученных из различных условий, позволяет выявить конкретные изменения, такие, как, например, те, которые были вызваны лечением. Лентивирная опосредованного клеточной трансдукции выполняется для создания стабильных клеточных линий, выражающих двухметки (6His и Флаг) версия модификатора (убиквитин или ubl, таких как SUMO1 или Nedd8). Эти метки позволяют очищать убиквитин и, следовательно, убиквитина белков из клеток. Это делается через двухэтапный процесс очистки: первый выполняется в условиях денатурации с использованием тега 6His, а второй в родных условиях с помощью тега Флага. Это приводит к высокоспецифической и чистой изоляции модифицированных белков, которые впоследствии идентифицируются и полуколичественно определяются жидкой хроматографией с последующей тандемной масс-спектрометрией (LC-MS/MS) технологии. Легкий анализ информатики данных MS с использованием программного обеспечения Excel позволяет создавать профили PTM, устраняя фоновые сигналы. Эти профили сравниваются между каждым условием для того, чтобы определить конкретные изменения, которые затем будут изучены более конкретно, начиная с их проверки стандартными методами биохимии.

Трансдукция культурных клеток млекопитающих для создания GFP и 6HF-Ub экспрессирующих клеток Для производства лентивирусов, которые будут использоваться позже для преобразить клетки MiaPaCa-2, 70% конфлирующих клеток HEK-293T совместно трансфицируются с равным количе...

Watch this Scientific Journal Video about Profiling Ubiquitin and Ubiquitin-like Dependent Post-translational Modifications and Identification of Significant Alterations at JoVE.com

Profiling Ubiquitin and Ubiquitin-like Dependent Post-translational Modifications and Identification of Significant Alterations

Этот протокол направлен на создание убиквитин (Ub) и убиквитин-лайков (Ubls) конкретных протеомов для выявления изменений такого рода посттрансляционных изменений (ПТМ), связанных с конкретным условием, таким как лечение или фенотип.

Профилирование убиквитин и убиквитин-подобных зависимых посттрансляционных модификаций и выявление значительных изменений

Ubiquitin (ub) and ubiquitin-like (ubl) dependent post-translational modifications of proteins play fundamental biological regulatory roles within the ...

Этот протокол является простым способом для создания профилей убиквитина и убиквитина, как пост-трансляционных модификаций путем выявления и полу-количественной конкретных выявленных белков. Основным преимуществом этого метода является использование лентивирусов для создания стабильной клеточной линии выражения в течение недели, а также использование двух тегов для специальной очистки белков. На самом деле, такого рода пост-трансляционные изменения участвуют в большинстве биологических функций, и изменения этого механизма находятся в большинстве заболеваний.Таким образом, выявление этих изменений может служить в качестве прогностический и / или диагностики и, конечно, в качестве молекулярных целей. Убиквитин является одним из самых консервативных белков в эукариотических клетках, и это необходимо для их выживания. Таким образом, этот метод может быть применен к любой эукариотической модели, от млекопитающих до дрожжей.Тем не менее, наша лентивирусная система ограничивается изучением клеток. Так как вся процедура довольно длинная с иногда долгим инкубационный период, можно сделать это в течение двух дней, а не один. Элуат из никеля шарики могут быть заморожены при температуре минус 20 и перед добавлением флага бисера.Этот протокол содержит много шагов, некоторые из которых имеют решающее значение для того, чтобы гарантировать окончательный успех очищения, и, таким образом, точное создание профиля пост-трансляционной модификации. Демонстрацию процедуры будут выполнять Мирна Суэйден и Аурели Добрич, два аспиранта лаборатории. Для начала добавьте 0,5 раза 10 к шестой части heK 293T клеток в шесть хорошо пластины с двумя миллилитров на колодец DMEM с 10%FBS семян, и инкубировать при 37 градусов по Цельсию, 5%углекислого газа, и 100% влажности.На следующий день достигается от 50 до 70% слияния. Сотрансфект клеток с сочетанием одного микрограмма pCCL-6HF убиквитин-как или pCCL-GFP, один микрограмм PBS VG, и один микрограмм дельта-помощник векторов с использованием трансинфекционных реагентов и протокол для производства лентивируса. После шести часов трансфекции, изменить среду на новую, соответствующую средствам массовой информации клеток, которые будут трансуцированы.Семя клетки, которые будут трансуцированы в шесть хорошо пластины с их стандартной культуры средств массовой информации для того, чтобы получить от 10 до 20% слияния на следующий день после этого. Через 24 часа после трансфекции, восстановить среды, содержащие лентивирусные частицы, и фильтр с помощью 0,45-микрон фильтров. Замените среду клеток, которые будут трансуцированы фильтрованной средой, содержащей лентивирусы.Инкубировать клетки с лентивирусами в течение 24 до 72 часов в инкубаторе при 37 градусах по Цельсию и 5%углекислого газа, а затем изменить среду со свежим, стандартный. Проверьте выражение GFP с помощью перевернутого флуоресцентного микроскопа для оценки эффективности трансдукции. Если флуоресценция не обнаружена, подождите еще два-три дня.Если контроль GFP положительный с зеленой флуоресценцией, расти все клетки, пока не достаточно, чтобы выполнить контроль выражения 6-His-FLAG убиквитин-как по иммунофторесценции, как показано здесь, и западной пятно с использованием анти-FLAG антитела. После выращивания клеток в 15-сантиметровых блюдах, мыть посуду культуры по крайней мере один раз с фосфат-буфером солевого раствора при комнатной температуре. Чтобы начать клеточныйлиз, добавьте два миллилитров буфера по одному в каждое 15-сантиметровое блюдо при комнатной температуре.Используйте сотовый скребок, чтобы восстановить все лисаты в 50-миллилитровые конические центрифуги труб. Sonicate lystates три раза в течение 30 секунд, разделенных на одну минуту паузы. Центрифуга sonicated лисирует при 15 000 раз г в течение 15 минут.Перенесите супернатант в новую трубку через 40-микрон-клеточный ситечко. Очень важно фильтровать лисаты после звуковой и центрифугации. Не делать этого может привести к копурификации многих неспецифических белков, тем самым увеличивая фон и сильно уменьшая размер профиля PTM.Перенесите равное количество белка между 50 и 100 миллиграммами в новые трубки Falcon. Добавьте никель-ионный бисер NTA в каждую трубку с количеством двух микролитров бисера на один миллиграмм белка. Поместите трубки на ротатор, чтобы повернуть при 30 об/мин в течение 2 1 / 2 часа при комнатной температуре.Затем гранулы бисера на 500 раз г в течение пяти минут. Вымойте бусины одним миллилитровом буфера и перенесите образцы в 1,5-миллилитровую микроцентрифугную трубку. Поместите трубку на лед.Вымойте дважды с одним миллилитров ледяного буфера два, содержащие десять миллимолярный имидазол. Чтобы улют-связанных белков, добавить 600 микролитров буфера два, содержащие 250-миллимолярный имидазол, и вращаться в течение двух часов при четырех градусах по Цельсию. После гранулирования бисера центрифугой при 500 г в течение одной минуты, перенесите супернатант в новую предварительно охлаждено 1,5-миллилитровую трубку и добавьте 50 микролитров антител анти-FLAG M2.Поверните при 30 об/мин в течение 2 1 /2 часов при четырех градусах по Цельсию. Затем мыть дважды с 500 микролитров буфера два, а затем дважды с 500 микролитров буфера три. Для окончательного элюции добавьте 100 микролитров буфера 3, содержащих пептид FLAG по 0,01 микрограмма на микролитер, и поверните при четырех градусах Цельсия в течение 1 1/2 часов.После центрифугации в 500 раз г в течение одной минуты, перенесите супернатант в новую предварительно охлажденую трубку. Возьмите 10 микролитров для загрузки на SDS-PAGE, и выполнить серебряное окрашивание геля для контроля качества очистки. Если очистка выглядит хорошо, проанализируйте 90%, оставленные LC-MS.Для выполнения нормализации используйте формулы для нормализации значений между обработанными наркотиками клетками и необработанными клетками для убиквитина и GFP. Чтобы удалить фон, вычесть значения в контрольной выборке GFP из значений в образцах убиквитина, чтобы получить конкретные значения для каждого идентифицированного белка в обоих условиях. Чтобы получить вариацию убиквитина, получить балл от минус 100 до плюс 100 для положительных и отрицательных вариаций ПТМ, вызванных препаратом.Разница между конкретными значениями обработанных и необработанных образцов делится на сумму всех значений, включая те, которые находятся под контролем, и умножается на 100. Существенные считаются вариации ниже минус 50, представляющие собой подавление PTM, или выше 50, представляющие индукцию PTM. Используйте эту формулу, чтобы получить значение доверия между нулем и 100%Значения выше 50, как правило, считаются уверенными.Чтобы получить более хорошее распределение индукционных и репрессийных значений, а также рассмотреть как параметры изменения, так и параметры доверия, используйте эту формулу, чтобы умножить различия и значения доверия. В этом исследовании, трансдукция клеток млекопитающих культуры была достигнута для создания GFP и 6-гистидин FLAG убиквитин экспрессии клеток. Эффективность лентивирусной трансдукции была впервые контролируется путем глядя на GFP флуоресценции GFP-трансдуцированных клеток.Выражение FLAG-убиквитина было сделано путем окрашивания иммунофлюоресценции с помощью антитела анти-FLAG, которое показывает процент трансдуцированных клеток. Для того, чтобы контролировать уровень экспрессии экзогенного FLAG-убиквитина, лизаты из трансдуцированных клеток были проанализированы SDS-PAGE с последующим западным пятном с антителами анти-FLAG. После очищения убиквитинированных белков, 10% окончательного элауляции было использовано для контроля количества и целостности очищенного материала SDS-PAGE и окрашивания геля серебром.Фон GFP образца вычитания определены 364 белков значительно ubiquitinated с баллом выше 50%A гена набор обогащения анализ этих убиквитинированных белков было выполнено для того, чтобы подчеркнуть биологические процессы, в которых они были вовлечены. Потенциальные взаимодействующие сети, образованные гемцитабин-индуцированными изменениями убиквитина. Это привело к выявлению функциональных взаимодействующих сетей, сильно пострадавших от увеличения или снижения убиквитинации участвующих белков.Было также подтверждено, что убиквитина ПХНА увеличилось после лечения гемцитабином. Это очень важно, чтобы избежать передачи некоторых шариков после обоих шагов elution, так как это может привести к значительному увеличению фона. Эта процедура приведет к конкретным пост-трансляционным изменениям, которые, сравнивая различные условия, позволят идентифицировать конкретные изменения.Первым следующим шагом будет проверка по крайней мере изменений интереса, основанных на биохимических подходах. Мы разработали этот метод для изучения убиквитин основе, после перевода модификаций для того, чтобы определить новые способы и механизмы раковых клеток поджелудочной железы. С тех пор этот протокол и другие разработанные во всем мире были успешно использованы для расшифровки различных биологических процессов.Лентивирусы должны быть использованы по крайней мере в лаборатории BL-2. Гуанидин является сильным денатурации агента и должен быть использован тщательно. Соникатор также может быть вредным для ушей и должны быть использованы в соответствии с рекомендациями.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Method for Measuring RNA N6-methyladenosine Modifications in Cells and Tissues

A Method for Measuring RNA N6-methyladenosine Modifications in Cells and Tissues

Метод для измерения РНК<em&gt; N</em<sup&gt; 6</sup&gt; -methyladenosine Изменения в клетках и тканях

N6-Methyladenosine (m6A) modifications of RNA are diverse and ubiquitous amongst eukaryotes. They occur in mRNA, rRNA, tRNA, and microRNA. Recent studies ...

Isolation of Intermediate Filament Proteins from Multiple Mouse Tissues to Study Aging-associated Post-translational Modifications

Выделение промежуточных белков-нитей из множественных мышечных тканей для изучения связанных со старением пост-трансляционных модификаций

Intermediate filaments (IFs), together with actin filaments and microtubules, form the cytoskeleton &#8211; a critical structural element of every cell. ...

Utilizing a Comprehensive Immunoprecipitation Enrichment System to Identify an Endogenous Post-translational Modification Profile for Target Proteins

Используя систему обогащения всеобъемлющего иммунопреципитации для определения профиля эндогенных столб-поступательные изменения целевых белков

It is now well-appreciated that post-translational modifications (PTMs) play an integral role in regulating a protein&#39;s structure and function, which ...

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

Полисома профилирование лейшманий, клетки человека и мыши яичка

Proper protein expression at the right time and in the right amounts is the basis of normal cell function and survival in a fast-changing environment. For ...

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Идентификация Циклин зависимая киназа 1 сайты конкретных фосфорилирование киназы в Vitro пробирного

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

НитропептидНое профилирование и идентификация Иллюстрировано Ангиотензином II

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

Functional Characterization of RING-Type E3 Ubiquitin Ligases In Vitro and In Planta

Функциональная характеристика РИНГ-типа E3 Ubiquitin Ligases in Vitro и В Планте

Ubiquitination, as a posttranslational modification of proteins, plays an important regulatory role in homeostasis of eukaryotic cells. The covalent ...

Ubiquitin Chain Analysis by Parallel Reaction Monitoring

Убиквитин Цепной Анализ параллельным мониторингом реакции

Assessment of the global profile of ubiquitin chain topologies within a proteome is of interest to answer a wide range of biological questions. The ...

Purification of Tubulin with Controlled Posttranslational Modifications and Isotypes from Limited Sources by Polymerization-Depolymerization Cycles

Очистка Тубулина с контролируемыми посттрансляционными модификациями и изотипами из ограниченных источников по циклам полимеризации-деполимеризации

One important aspect of studies of the microtubule cytoskeleton is the investigation of microtubule behavior in in vitro reconstitution experiments. They ...

Ganglioside Extraction, Purification and Profiling

Экстракция, очистка и профилирование ганглиозидов

Gangliosides are glycosphingolipids that contain one or more sialic acid residues. They are found on all vertebrate cells and tissues but are especially ...