Name: profiling ubiquitin and ubiquitin-like dependent post-translational modifications and identification of significant alterations
Uploaded: 2019-11-07T13:00:00
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Este trabajo fue apoyado por La Ligue Contre le Cancer a HV y MS, y el ARC (association pour la recherche sur le cancer) a PS, INCa (instituto nacional del cáncer) y Canceropole PACA a JI. La instalación de espectrometría de masas de Marsella Proteomics (marseille-proteomique.univ-amu.fr) con el apoyo de IBISA (Infrastructures Biologie Santé et Agronomie), Plateforme Technologique Aix-Marseille, la Cancéropéle PACA, la Provenza-Alpes-Costa Azul Région, el Institut Paoli-Calmettes y el Centre de Recherche en Cancérologie de Marseille.

1. Generación de líneas celulares estables que expresan 6His-Flag-Ubl
NOTA: Co-transfección de células HEK-293T con pCCL-6HF-Ubl, pVSVG y delta-Helper.
<ol><li>Día 0: Seed 293T células en una placa de 6 pocillos para obtener 50-70% de confluencia al día siguiente.</li>
	<li>Día 1: Células co-transfectas 50-70% de confluente con una mezcla de 1 g de pCCL-6HF-Ubl o pCCL-GFP, 1 g de pVSVG y 1 g de vectores delta-Helper, utilizando un reactivo de transfección y un protocolo para la pro...

<ol>
	<li>Prabakaran, S., Lippens, G., Steen, H., Gunawardena, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-translational+modification:+Nature's+escape+from+genetic+imprisonment+and+the+basis+for+dynamic+information+encoding.">Post-translational modification: Nature's escape from genetic imprisonment and the basis for dynamic information encoding.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: Systems Biology and Medicine. , (2012).</li><li>Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+and+function+of+ubiquitin-like+proteins.">Origin and function of ubiquitin-like proteins.</a> Nature. 458 (7237), 422-429 (2009).</li><li>Kirkpatrick, D. S., Weldon, S. F., Tsaprailis, G., Liebler, D. C., Gandolfi, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+identification+of+ubiquitinated+proteins+from+human+cells+expressing+His-tagged+ubiquitin.">Proteomic identification of ubiquitinated proteins from human cells expressing His-tagged ubiquitin.</a> Proteomics. 5 (8), 2104-2111 (2005).</li><li>Peng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+proteomics+approach+to+understanding+protein+ubiquitination.">A proteomics approach to understanding protein ubiquitination.</a> Nature Biotechnology. 21 (8), 921-926 (2003).</li><li>Matsumoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+analysis+of+the+human+ubiquitin-related+proteome.">Large-scale analysis of the human ubiquitin-related proteome.</a> Proteomics. 5 (16), 4145-4151 (2005).</li><li>Hjerpe, R., Rodr&#237;guez, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+approaches+for+characterizing+ubiquitinated+proteins.">Efficient approaches for characterizing ubiquitinated proteins.</a> Biochemical Society Transactions. 36 (5), 823-827 (2008).</li><li>Bonacci, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+new+mechanisms+of+cellular+response+to+chemotherapy+by+tracking+changes+in+post-translational+modifications+by+ubiquitin+and+ubiquitin-like+proteins.">Identification of new mechanisms of cellular response to chemotherapy by tracking changes in post-translational modifications by ubiquitin and ubiquitin-like proteins.</a> Journal of Proteome Research. 13 (5), 2478-2494 (2014).</li><li>Bedford, L., Lowe, J., Dick, L. R., Mayer, R. J., Brownell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin-like+protein+conjugation+and+the+ubiquitin-proteasome+system+as+drug+targets.">Ubiquitin-like protein conjugation and the ubiquitin-proteasome system as drug targets.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 10 (1), 29-46 (2011).</li><li>Hoeller, D., Dikic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+ubiquitin+system+in+cancer+therapy.">Targeting the ubiquitin system in cancer therapy.</a> Nature. 458 (7237), 438-444 (2009).</li><li>Silva, J. C., Gorenstein, M. V., Li, G. Z. Z., Vissers, J. P. C., Geromanos, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absolute+quantification+of+proteins+by+LCMSE:+a+virtue+of+parallel+MS+acquisition.">Absolute quantification of proteins by LCMSE: a virtue of parallel MS acquisition.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. , (2006).</li><li>Kim, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+and+quantitative+assessment+of+the+ubiquitin-modified+proteome.">Systematic and quantitative assessment of the ubiquitin-modified proteome.</a> Molecular Cell. 44 (2), 325-340 (2011).</li></ol>

Hemos desarrollado una metodología robusta y fiable para generar perfiles de proteínas modificados por los principales miembros de la familia ubiquitina. De hecho, hemos aplicado con éxito este protocolo para generar perfiles de PTM según ubiquitina, y también por SUMO y Nedd8, y para detectar alteraciones asociadas con un tratamiento7,en respuesta a la sobreexpresión o derribo de un determinado gen (datos no y en las células que adquirieron un fenotipo resistente a diversos fármacos quimi...

El método propuesto aquí está dedicado a estudiar los PTM mediados por los miembros de la familia ubiquitina a partir de células de mamíferos cultivadas con el fin de identificar posibles alteraciones asociadas con una condición específica (tratamiento, diferenciación, etc.). Los PPT representan el último paso de regulación de las funciones de las proteínas1. De hecho, una vez producidas por la maquinaria traslacional, la mayoría, si no todas las proteínas, se someten a diferentes tipos de MPT que modulan su actividad, interacciones moleculares y ubicación intracelular1. Entre las plétolas de LOS PTM se encuentran las mediadas por la familia de proteínas ubiquitina, la ubiquitina en sí y todas las ubiquitinas, tienen el potencial de regular todas las proteínas intracelulares o parcialmente citoplasmáticas2. Debido a que son en sí mismas proteínas, se pueden conjugar entre sí, formando cadenas homogéneas y heterogéneas de diversas topologías, cada una asociada con funciones reguladoras específicas2. Se necesitan herramientas para tratar de descifrar y comprender esta compleja maquinaria. Muchos enfoques fueron desarrollados en todo el mundo, teniendo sus propias ventajas y desventajas, y aquí proponemos uno con alto rendimiento adecuado para células cultivadas.
La principal ventaja de este método es su precisión. De hecho, la pureza de las proteínas modificadas aisladas se ve muy mejorada por el uso combinatorio de las dos etiquetas (6His y Flag) y los dos pasos-procedimiento y por lo tanto es mucho más selectivo que una sola fusión de etiqueta Ub/Ubl3,4. La presencia de la etiqueta 6His permite un primer paso de purificación en una condición de desnaturalización completa evitando así cualquier co-purificación de proteínas que contengan dominios de unión a ubiquitina u otras proteínas que se unen a los ubiquitinados. Este es un problema técnico encontrado por varios otros enfoques basados en la purificación de afinidad de proteomes ubiquitinados utilizando anticuerpos específicos5 o elementos de unión de ubiquitina en tándem (TUBEs)6. Es importante destacar que esta técnica no está sesgada a favor de la purificación de un determinado tipo de ubiquitinación, como podría ser el caso de algunos otros enfoques, ya que se identificaron tanto mono como diferentes tipos de poliubiquitinaciones7. En consecuencia, una vez que se encuentre, una alteración de la ubiquitinación tendrá que ser estudiada en más detalle por enfoques bioquímicos estándar con el fin de identificar el tipo exacto de ubiquitinación involucrada.
Por último, otra ventaja técnica de este protocolo es el uso de lentivirus, que crea fácil y rápidamente líneas celulares de expresión estables con un nivel razonable de expresiones de modificador etiquetado sin interferir con el comportamiento celular normal.
Mientras que un papel importante de la ubiquitinación es apuntar a las proteínas para la degradación proteasomal, ahora se sabe que tiene muchas otras propiedades reguladoras para potencialmente la mayoría de las proteínas intracelulares o parcialmente intracelulares1. El número de estas funciones se incrementa aún más por la existencia de muchas ubiquitinas como proteínas, formando una familia de proteínas que regulan casi todos los mecanismos celulares1. Sus alteraciones pueden tener un impacto drástico en la biología celular y pueden conducir o participar en situaciones patológicas8,como el cáncer9. Por lo tanto, se necesitan herramientas para explorar este vasto paisaje e identificar las alteraciones asociadas con una condición patológica que podría servir como nuevas dianas terapéuticas.
Este protocolo está dedicado a las células en el cultivo ya que necesitan ser transducidas para expresar exógena etiquetada Ub/Ubl. Una vez creadas, estas líneas celulares estables se pueden utilizar para generar perfiles Ubl a partir de cultivos en 2D o 3D o xenoinjertos, extendiendo así el horizonte de los diferentes modelos experimentales que se pueden aplicar para estudiar perfiles de PTM.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ANTI-FLAG M2 Affinity Gel</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2220-5ML</td>
			<td>binds all Flag tagged proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Flag M2 antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F3165</td>
			<td>to detect 6His-Flag tagged expression of ub/ubl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer 40 &#181;m</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td>to remove floating pellet from guanidine lysed cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flag peptide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F3290</td>
			<td>elute flag tagged proteins from anti-flag beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanidine hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>50933</td>
			<td>chaotropic agent used to denature all proteins in cell lysate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I5513</td>
			<td>eluates 6His bond proteins from Ni-NTA beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 3000</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>L3000015</td>
			<td>to transfect HEK-293T cells to produce lentiviruses</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lobind tubes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z666491</td>
			<td>avoids absorption of precious material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membrane Filter, 0.45 &#181;m</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>HAWP04700F1</td>
			<td>to filter the lentiviral supernantant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>30210</td>
			<td>purification of the 6His tag</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

profiling ubiquitin and ubiquitin-like dependent post-translational modifications and identification of significant alterations

Las modificaciones post-traduccionales dependientes de la ubiquitina (ub) y la ubiquitina (ubl) dependientes de las proteínas desempeñan un papel regulador biológico fundamental dentro de la célula mediante el control de la estabilidad de las proteínas, la actividad, las interacciones y la localización intracelular. Permiten a la célula responder a las señales y adaptarse a los cambios en su entorno. Las alteraciones dentro de estos mecanismos pueden conducir a situaciones patológicas graves como enfermedades neurodegenerativas y cánceres. El objetivo de la técnica descrita aquí es establecer perfiles de PTF dependientes de ub/ubls, de forma rápida y precisa, a partir de líneas celulares cultivadas. La comparación de diferentes perfiles obtenidos a partir de diferentes condiciones permite la identificación de alteraciones específicas, como las inducidas por un tratamiento, por ejemplo. La transducción celular mediada por Lentiviral se realiza para crear líneas celulares estables que expresan una versión de dos etiquetas (6His y Flag) del modificador (ubiquitina o ubl como SUMO1 o Nedd8). Estas etiquetas permiten la purificación de la ubiquitina y por lo tanto de proteínas ubiquitinadas de las células. Esto se hace a través de un proceso de purificación de dos pasos: El primero se realiza en condiciones de desnaturalización utilizando la etiqueta 6His, y el segundo en condiciones nativas usando la etiqueta Flag. Esto conduce a un aislamiento muy específico y puro de proteínas modificadas que posteriormente se identifican y semicuantifican mediante cromatografía líquida seguida de tecnología de espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS). El fácil análisis informático de los datos de MS mediante el software Excel permite el establecimiento de perfiles PTM mediante la eliminación de señales de fondo. Estos perfiles se comparan entre cada condición con el fin de identificar alteraciones específicas que luego se estudiarán más específicamente, comenzando con su validación por técnicas de bioquímica estándar.

Transducción de células de mamíferos de cultivo para crear células de expresión de GFP y 6HF-Ub Para producir lentivirus que se utilizarán más adelante para transducir las células MiaPaCa-2, las células HEK-293T confluentes del 70% se co-transtan con la misma cantidad de los tres vectores, pCCL-6HF-Ubiquitin o GFP/Delta-Helper/pvSvG. Después de 24 h de producción, el medio que contiene partículas lentivirales se recupera y filtra. Es posible en este punto c...

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Profiling Ubiquitin and Ubiquitin-like Dependent Post-translational Modifications and Identification of Significant Alterations

Este protocolo tiene como objetivo establecer proteomes específicos de ubiquitina (Ub) y ubiquitinas (Ubls) con el fin de identificar alteraciones de este tipo de modificaciones post-traduccionales (PtM), asociadas a una condición específica como un tratamiento o un fenotipo.

Perfilado de Ubiquitina y Ubiquitina-como Modificaciones Post-traduccionales dependientes e Identificación de Alteraciones Significativas

Ubiquitin (ub) and ubiquitin-like (ubl) dependent post-translational modifications of proteins play fundamental biological regulatory roles within the ...

Este protocolo es una manera fácil de generar los perfiles de modificaciones post-traduccionales similares a la ubiquitina mediante la identificación y seminificación de proteínas identificadas específicas. La principal ventaja de esta técnica es el uso de lentivirus para crear una línea de expresión celular estable dentro de una semana, y el uso de dos etiquetas para purificar específicamente las proteínas. De hecho, este tipo de modificaciones post-traduccionales están involucradas en la mayoría de las funciones biológicas, y las alteraciones de este mecanismo se encuentran en la mayoría de las enfermedades.Por lo tanto, la identificación de estas alteraciones puede servir como un pronóstico y / o diagnóstico y, por supuesto, como dianas moleculares. La ubiquitina es una de las proteínas más conservadas en las células eucariotas y esta esencial para su supervivencia. Por lo tanto, este tipo de método podría aplicarse a cualquier modelo eucariota, desde mamíferos hasta levaduras.Sin embargo, nuestro sistema lentiviral está restringido al estudio de las células. Dado que todo el procedimiento es bastante largo con a veces largo tiempo de incubación, es posible hacerlo durante dos días en lugar de uno. El eluido de las cuentas de níquel se puede congelar en menos 20 y antes de agregar las cuentas de la bandera.Este protocolo contiene muchos pasos entre los cuales algunos son críticos para garantizar el éxito final de la purificación, y por lo tanto el establecimiento preciso del perfil de modificación post-traduccional. La demostración del procedimiento será realizada por Mirna Swayden y Aurelie Dobric, dos estudiantes de doctorado del laboratorio. Para empezar, agregue 0,5 veces 10 a la sexta de las células HEK 293T en una placa de seis pozos con dos mililitros por pozo de DMEM con 10%FBS a la semilla, e incubar a 37 grados Celsius, 5% dióxido de carbono y 100% de humedad.Al día siguiente, se logra una confluencia del 50 al 70%. Cotransfect las células con una mezcla de un microgramo de pCCL-6HF similar a la ubiquitina o pCCL-GFP, un microgramo de PBS VG y un microgramo de vectores auxiliares delta utilizando un reactivo de transfección y protocolo para la producción de lentivirus. Después de seis horas de transfección, cambie el medio a uno fresco correspondiente al medio de las células a transducir.Siembra las células a transducir en una placa de seis pozos con sus medios de cultivo estándar con el fin de obtener 10 a 20% de confluencia el día después. 24 horas después de la transfección, recuperar el medio que contiene partículas lentivirales y filtrar utilizando filtros de 0,45 micras. Sustituya el medio de las células que se van a transducir por el medio filtrado que contiene lentivirus.Incubar las células con lentivirus durante 24 a 72 horas en una incubadora a 37 grados Celsius y 5%dióxido de carbono, y luego cambiar el medio con uno fresco y estándar. Compruebe la expresión de GFP utilizando un microscopio fluorescente invertido para evaluar la eficiencia de la transducción. Si no se detecta fluorescencia, espere de dos a tres días adicionales.Si el control de la GFP es positivo con fluorescencia verde, haga crecer todas las células hasta tener suficiente para realizar un control de expresión de 6-His-FLAG similar a la ubiquitina por inmunofluorescencia, como se muestra aquí, y la mancha occidental usando anticuerpo anti-FLAG. Después de cultivar las células en platos de 15 centímetros, lave los platos de cultivo al menos una vez con solución salina tamponada con fosfato a temperatura ambiente. Para comenzar la lelisis celular, agregue dos mililitros de tampón uno en cada plato de 15 centímetros a temperatura ambiente.Utilice un rascador de células para recuperar todos los lysates en tubos de centrífugo cónico de 50 mililitros. Sonicar los lystates tres veces durante 30 segundos, separados por una pausa de un minuto. Centrifugar los lysates sonicados a 15.000 veces g durante 15 minutos.Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo a través de un colador celular de 40 micras. Es muy importante filtrar los lysates después de la sonicación y la centrifugación. No hacer esto puede resultar en la copurificación de muchas proteínas no específicas, aumentando así el fondo y reduciendo fuertemente el tamaño del perfil PTM.Transfiera una cantidad igual de proteína entre 50 y 100 miligramos a los nuevos tubos Falcon. Agregue cuentas NTA de iones de níquel en cada tubo con la cantidad de dos microlitros de cuentas por un miligramo de proteína. Coloque los tubos sobre un rotador para girar a 30 rpm durante 2 horas y media a temperatura ambiente.A continuación, pele el cordón a 500 veces g durante cinco minutos. Lave las cuentas con un mililitro de tampón uno y transfiera las muestras a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Coloque el tubo sobre hielo.Lavar dos veces con un mililitro de tampón helado dos que contengan imidazol de diez mililitrolares. Para elit-bound proteínas, añadir 600 microlitros de tampón dos que contienen imidazol 250 mililitros, y rotar durante dos horas a cuatro grados Centígrados. Después de peletizar las perlas por centrifugación a 500 veces g durante un minuto, transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo pre-enfriado de 1,5 mililitros, y agregue 50 microlitros de perlas conjugadas con anticuerpos anti-FLAG M2.Gire a 30 rpm durante 2 horas y media a cuatro grados centígrados. A continuación, lave dos veces con 500 microlitros de tampón dos, luego dos veces con 500 microlitros de tampón tres. Para la elución final, agregue 100 microlitros de tampón tres que contengan un péptido FLAG a 0,01 microgramos por microlitro, y gire a cuatro grados centígrados durante 1 1/2 horas.Después de la centrifugación a 500 veces g durante un minuto, transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo preenfriado. Tome 10 microlitros para cargar en SDS-PAGE, y realizar una tinción de plata del gel para controlar la calidad de purificación. Si la purificación se ve bien, analice el 90% dejado por LC-MS.Para realizar la normalización, utilice las fórmulas para normalizar los valores entre las células tratadas con fármacos y las células no tratadas para la ubiquitina y la GFP. Para eliminar el fondo, reste los valores de la GFP de la muestra de control de los valores de las muestras de ubiquitina, para obtener valores específicos para cada proteína identificada en ambas condiciones. Para obtener la variación de la ubiquitinación, obtener una puntuación entre menos 100 y más 100 para variaciones positivas y negativas de LAS PTM inducidas por un medicamento.La diferencia entre los valores específicos de las muestras tratadas y no tratadas se divide por la suma de todos los valores, incluidos los del control, y se multiplica por 100. Las variaciones inferiores a menos 50, que representan la represión de la PTM, o superiores a 50, que representan la inducción de la PTM, se consideran significativas. Utilice esta fórmula para obtener un valor de confianza entre cero y 100%Los valores por encima de 50 generalmente se consideran seguros.Para obtener una mejor distribución de los valores de inducción y represión, y para considerar los parámetros de variación y confianza, utilice esta fórmula para multiplicar los valores de varianza y confianza. En este estudio, se logró la transducción de células de mamíferos de cultivo para crear células expresantes de ubiquitina GFP y 6-histidina FLAG. La eficacia de la transducción lentiviral se controló primero examinando la fluorescencia GFP de las células transducidas por GFP.La expresión de FLAG-ubiquitina se realizó mediante la tinción por inmunofluorescencia utilizando un anticuerpo anti-FLAG, que muestra el porcentaje de células transducidas. Con el fin de controlar el nivel de expresión de FLAG-ubiquitina exógena, los lysates de las células transducidas fueron analizados por SDS-PAGE seguido de mancha occidental con anticuerpo anti-FLAG. Después de la purificación de las proteínas ubiquitinadas, el 10% de la elución final se utilizó para controlar la cantidad e integridad del material purificado por SDS-PAGE y la tinción de plata del gel.La resta de muestras de GFP de fondo identificó 364 proteínas significativamente ubiquitinadas con una puntuación superior al 50%A del gen conjunto de análisis de enriquecimiento de estas proteínas ubiquitinadas se realizó con el fin de resaltar los procesos biológicos en los que estaban involucradas. Posibles redes de interacción formadas por alteraciones de la ubiquitinación inducidas por gemcitabina. Esto condujo a la identificación de redes funcionales de interacción fuertemente afectadas por el aumento o disminución de la ubiquitinación de las proteínas involucradas.También se confirmó que la ubiquitinación de PCNA aumentó después del tratamiento con gemcitabina. Es muy importante evitar la transferencia de algunas cuentas después de ambos pasos de elución, ya que puede resultar en un aumento significativo del fondo. Este procedimiento generará modificaciones post-traduccionales específicas que, comparando diferentes condiciones, permitirán la identificación de alteraciones específicas.El primer paso siguiente será validar al menos las alteraciones de interés basadas en enfoques bioquímicos. Desarrollamos este método para explorar modificaciones post-traduccionales basadas en ubiquitina con el fin de identificar nuevas formas y mecanismos de las células cancerosas pancreáticas. Desde este protocolo y otros desarrollados en todo el mundo se han empleado con éxito para descifrar diferentes procesos biológicos.Los lentivirus deben utilizarse al menos en laboratorio BL-2. Guanidine es un agente desnatural. El sonicador también puede ser perjudicial para los oídos y tiene que ser utilizado siguiendo las recomendaciones.

Research

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