Name: profiling ubiquitin and ubiquitin-like dependent post-translational modifications and identification of significant alterations
Uploaded: 2019-11-07T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Profiling Ubiquitin and Ubiquitin-like Dependent Post-translational Modifications and Identification of Significant Alterations at JoVE.com

Detta arbete stöddes av La Ligue contre le cancer till HV och MS, och ARC (Association pour la Recherche sur le cancer) till PS, INCa (Institute National du cancer) och Canceropole PACA till JI. Masspektrometrianläggningen i Marseille proteomik (marseille-proteomique.univ-amu.fr) med stöd av IBISA (infrastrukturer biologie santé et Agronomie), Plateforme Technologique Aix-Marseille, Cancéropôle PACA, Provence-Alpes-Côte d'Azur Région, institut Paoli-Calmettes och Centre de Recherche en Cancérologie de Marseille.

1. generering av stabila cellinjer uttrycker 6His-flagga-UBL
Obs: Co-transfektion av HEK-293T celler med pCCL-6HF-UBL, pVSVG och delta-Helper.
<ol><li>Dag 0: Seed 293t celler i en 6-brunn tallrik för att få 50-70% sammanflödet dagen efter.</li>
	<li>Dag 1: Co-transfect 50-70% konfluenta celler med en blandning av 1 μg pccl-6hf-UBL eller pccl-GFP, 1 μg pvsvg och 1 μg delta-Helper vektorer, med hjälp av en transfektion reagens och protokoll för lentivirus produktion. Efter 6 h av trans...

<ol>
	<li>Prabakaran, S., Lippens, G., Steen, H., Gunawardena, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-translational+modification:+Nature's+escape+from+genetic+imprisonment+and+the+basis+for+dynamic+information+encoding.">Post-translational modification: Nature's escape from genetic imprisonment and the basis for dynamic information encoding.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: Systems Biology and Medicine. , (2012).</li><li>Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+and+function+of+ubiquitin-like+proteins.">Origin and function of ubiquitin-like proteins.</a> Nature. 458 (7237), 422-429 (2009).</li><li>Kirkpatrick, D. S., Weldon, S. F., Tsaprailis, G., Liebler, D. C., Gandolfi, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+identification+of+ubiquitinated+proteins+from+human+cells+expressing+His-tagged+ubiquitin.">Proteomic identification of ubiquitinated proteins from human cells expressing His-tagged ubiquitin.</a> Proteomics. 5 (8), 2104-2111 (2005).</li><li>Peng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+proteomics+approach+to+understanding+protein+ubiquitination.">A proteomics approach to understanding protein ubiquitination.</a> Nature Biotechnology. 21 (8), 921-926 (2003).</li><li>Matsumoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+analysis+of+the+human+ubiquitin-related+proteome.">Large-scale analysis of the human ubiquitin-related proteome.</a> Proteomics. 5 (16), 4145-4151 (2005).</li><li>Hjerpe, R., Rodr&#237;guez, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+approaches+for+characterizing+ubiquitinated+proteins.">Efficient approaches for characterizing ubiquitinated proteins.</a> Biochemical Society Transactions. 36 (5), 823-827 (2008).</li><li>Bonacci, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+new+mechanisms+of+cellular+response+to+chemotherapy+by+tracking+changes+in+post-translational+modifications+by+ubiquitin+and+ubiquitin-like+proteins.">Identification of new mechanisms of cellular response to chemotherapy by tracking changes in post-translational modifications by ubiquitin and ubiquitin-like proteins.</a> Journal of Proteome Research. 13 (5), 2478-2494 (2014).</li><li>Bedford, L., Lowe, J., Dick, L. R., Mayer, R. J., Brownell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin-like+protein+conjugation+and+the+ubiquitin-proteasome+system+as+drug+targets.">Ubiquitin-like protein conjugation and the ubiquitin-proteasome system as drug targets.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 10 (1), 29-46 (2011).</li><li>Hoeller, D., Dikic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+ubiquitin+system+in+cancer+therapy.">Targeting the ubiquitin system in cancer therapy.</a> Nature. 458 (7237), 438-444 (2009).</li><li>Silva, J. C., Gorenstein, M. V., Li, G. Z. Z., Vissers, J. P. C., Geromanos, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absolute+quantification+of+proteins+by+LCMSE:+a+virtue+of+parallel+MS+acquisition.">Absolute quantification of proteins by LCMSE: a virtue of parallel MS acquisition.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. , (2006).</li><li>Kim, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+and+quantitative+assessment+of+the+ubiquitin-modified+proteome.">Systematic and quantitative assessment of the ubiquitin-modified proteome.</a> Molecular Cell. 44 (2), 325-340 (2011).</li></ol>

Vi har utvecklat en robust och tillförlitlig metodik för att generera profiler av proteiner som modifierats av de viktigaste ubiquitin familjemedlemmarna. I själva verket har vi framgångsrikt tillämpat detta protokoll för att generera profiler av PTMs av ubiquitin, och även av SUMO och Nedd8, och för att upptäcka förändringar i samband med en behandling7, som svar på över uttryck eller knockdown av en viss gen (data inte som visats) och i celler som förvärvat en resistent fenotyp ti...

Den metod som föreslås här är tillägnad studera PTMs förmedlas av ubiquitin familjemedlemmar från odlade däggdjursceller för att identifiera potentiella förändringar i samband med ett visst tillstånd (behandling, differentiering, etc). PTMs representerar det sista steget i regleringen av proteiners funktioner1. Faktum är att en gång produceras av translationella maskiner, de flesta om inte alla proteiner genomgår olika typer av PTMs som modulera sin verksamhet, molekylära interaktioner, och intracellulära plats1. Bland de överflöd av PTMs är de som förmedlas av ubiquitin familjen av proteiner, ubiquitin själv och alla ubiquitin-likes, har potential att reglera alla intracellulära eller delvis cytoplasmiska proteiner2. Eftersom de själva är proteiner, de kan konjugeras till varandra, bildar homogena och heterogena kedjor av olika topologier, varje associerad med specifika reglerande funktioner2. Verktyg behövs för att försöka dechiffrera och förstå denna komplexa maskiner. Många metoder har utvecklats över hela världen, med sina egna fördelar och nackdelar, och här föreslår vi en med hög prestanda som lämpar sig för odlade celler.
Den största fördelen med denna metod är dess noggrannhet. Faktum är att renheten av isolerade modifierade proteiner är mycket bättre genom den kombinatoriska användningen av de två taggarna (6his och flagga) och de två steg-förfarande och därför är det mycket mer selektiv än en enda tagg fusion UB/UBL3,4. Närvaron av 6his tag möjliggör ett första steg i rening i ett helt denaturerande tillstånd därigenom undvika någon samrening av proteiner som innehåller ubiquitin bindande domäner eller andra proteiner som binder till de och sådana. Detta är ett tekniskt problem som uppstått på grund av flera andra tillvägagångssätt som bygger på affinitetsrening av ubiquitinerade proteomer med antingen specifika antikroppar5 eller tandem-bindningselement (rör)6. Viktigare är denna teknik inte partisk till förmån för rening av en viss typ av ubiquitination, eftersom det kan vara fallet för vissa andra metoder, eftersom både mono och olika typer av polyubiquitinations identifierades7. Följaktligen, en gång funnit, en förändring av ubiquitination kommer att behöva studeras i mer detaljer genom standard biokemiska metoder för att identifiera den exakta typen av ubiquitination inblandade.
Slutligen, en annan teknisk fördel med detta protokoll är användningen av lentivirus, som lätt och snabbt skapar stabila uttrycker cellinjer med rimlig nivå av uttryck för taggade modifierare utan att störa den normala cellulära beteende.
Medan en viktig roll ubiquitination är att rikta proteiner för proteasomen nedbrytning, är det nu känt att det har många andra reglerande egenskaper för potentiellt de flesta intracellulära eller delvis intracellulära proteiner1. Numrera av dessa fungerar förstärks vidare av existensen av många ubiquitin lika proteiner som bildar en familj av proteiner som reglerar nästan varje cellmekanism1. Deras förändringar kan få drastiska effekter på cellbiologi och kan leda eller delta i patologiska situationer8, såsom cancer9. Därför behövs verktyg för att utforska detta vidsträckta landskap och identifiera de förändringar som är förknippade med ett sjukdomstillstånd som kan fungera som nya terapeutiska mål.
Detta protokoll är tillägnad celler i kulturen eftersom de måste vara sensorik att uttrycka exogena taggade UB/UBL. När de har skapats kan dessa stabila cellinjer användas för att generera UBL-profiler från kulturen i 2D eller 3D eller xenografts, vilket utökar horisonten för de olika experimentella modellerna som kan användas för att studera PTMs-profiler.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ANTI-FLAG M2 Affinity Gel</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2220-5ML</td>
			<td>binds all Flag tagged proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Flag M2 antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F3165</td>
			<td>to detect 6His-Flag tagged expression of ub/ubl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer 40 &#181;m</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td>to remove floating pellet from guanidine lysed cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flag peptide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F3290</td>
			<td>elute flag tagged proteins from anti-flag beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanidine hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>50933</td>
			<td>chaotropic agent used to denature all proteins in cell lysate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I5513</td>
			<td>eluates 6His bond proteins from Ni-NTA beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 3000</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>L3000015</td>
			<td>to transfect HEK-293T cells to produce lentiviruses</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lobind tubes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z666491</td>
			<td>avoids absorption of precious material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membrane Filter, 0.45 &#181;m</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>HAWP04700F1</td>
			<td>to filter the lentiviral supernantant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>30210</td>
			<td>purification of the 6His tag</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

profiling ubiquitin and ubiquitin-like dependent post-translational modifications and identification of significant alterations

Ubiquitin (UB) och ubiquitin-liknande (UBL) beroende post-translationella modifieringar av proteiner spelar grundläggande biologiska reglerande roller i cellen genom att kontrollera protein stabilitet, aktivitet, interaktioner, och intracellulär lokalisering. De gör det möjligt för cellen att reagera på signaler och att anpassa sig till förändringar i sin omgivning. Förändringar inom dessa mekanismer kan leda till svåra patologiska situationer såsom neurodegenerativa sjukdomar och cancer. Syftet med den teknik som beskrivs här är att etablera UB/ubls beroende PTMs profiler, snabbt och korrekt, från odlade cellinjer. Jämförelsen av olika profiler som erhålls från olika förhållanden gör det möjligt att identifiera specifika förändringar, såsom de som induceras av exempelvis en behandling. Lentiviral medierad celltransduktion utförs för att skapa stabila cellinjer som uttrycker en två-Tags (6His och flagga) version av modifieraren (ubiquitin eller en UBL som SUMO1 eller Nedd8). Dessa taggar tillåter rening av ubiquitin och därför av och proteiner från cellerna. Detta görs genom en två-stegs reningsprocess: den första utförs i denatureringsförhållanden med hjälp av 6His tagg, och den andra i inhemska förhållanden med hjälp av flaggan taggen. Detta leder till en mycket specifik och ren isolering av modifierade proteiner som därefter identifieras och semikvantifieras genom vätskekromatografi följt av tandem-masspektrometri (LC-MS/MS)-teknik. Enkel informatikanalys av MS-data med Excel-programvara gör det möjligt att etablera PTM-profiler genom att eliminera bakgrunds signaler. Dessa profiler jämförs mellan varje villkor för att identifiera specifika förändringar som sedan kommer att studeras mer specifikt, börjar med deras validering av vanliga biokemiska tekniker.

Transduktion av kultur däggdjursceller för att skapa GFP och 6HF-UB som uttrycker celler För att producera lentivirus som kommer att användas senare för att transduce miapaca-2 celler, 70% konfluenta hek-293t celler Co-transfected med en lika stor del av de tre vektorer, pccl-6hf-ubiquitin eller GFP/delta-Helper/pvsvg. Efter 24 h produktion, mediet innehållande lentivirala partiklar återvinns och filtreras. Det är möjligt på denna punkt att kontrollera effekt...

Watch this Scientific Journal Video about Profiling Ubiquitin and Ubiquitin-like Dependent Post-translational Modifications and Identification of Significant Alterations at JoVE.com

Profiling Ubiquitin and Ubiquitin-like Dependent Post-translational Modifications and Identification of Significant Alterations

Detta protokoll syftar till att upprätta ubiquitin (UB) och ubiquitin-likes (ubls) specifika proteom för att identifiera förändringar av denna typ av posttranslationella modifieringar (ptms), associerade med ett specifikt tillstånd såsom en behandling eller en fenotyp.

Profilering ubiquitin och ubiquitin-liknande beroende post-translationella modifieringar och identifiering av betydande förändringar

Ubiquitin (ub) and ubiquitin-like (ubl) dependent post-translational modifications of proteins play fundamental biological regulatory roles within the ...

Detta protokoll är ett enkelt sätt att generera profiler av ubiquitin och ubiquitin-liknande post-translationella modifieringar genom att identifiera och semi-kvantifiera specifika identifierade proteiner. Den största fördelen med denna teknik är användningen av lentivirus för att skapa stabil cellinje av uttryck inom en vecka, och användningen av två taggar för att specifikt rena proteiner. I själva verket är denna typ av post-translationella ändringar involverade i de flesta biologiska funktioner, och förändringar av denna mekanism finns i de flesta sjukdomar.Därför kan identifiera dessa ändringar fungera som en prognostisk och/eller diagnos och naturligtvis som molekylära mål. Ubiquitin är en av de mest bevarade protein i eukaryota celler och detta viktigt för deras överlevnad. Därför skulle denna typ av metod kunna tillämpas på någon eukaryota modell, från däggdjur till jäst.Vårt lentiviralsystem är dock begränsat till studier av celler. Eftersom hela förfarandet är ganska lång med ibland lång inkubationstid, är det möjligt att göra det under två dagar i stället för en. Eluatet från nickelpärlor kan frysas vid minus 20 och innan flaggpärlorna läggs till.Detta protokoll innehåller många steg bland vilka vissa är kritiska för att garantera den slutliga framgången för reningen, och så den korrekta inrättandet av post-translational modifiering profil. Demonstrerande av proceduren kommer att utföras av Mirna Swayden och Aurelie Dobric, två doktorander i labbet. Till att börja med, tillsätt 0,5 gånger 10 till den sjätte av HEK 293T celler i en sex-brunnsplatta med två milliliter per brunn av DMEM med 10%FBS till utsäde, och inkubera vid 37 grader Celsius, 5%koldioxid och 100%luftfuktighet.Nästa dag uppnås 50 till 70%sammanflödet. Cotransfect cellerna med en blandning av ett mikrogram pCCL-6HF ubiquitin-liknande eller pCCL-GFP, ett mikrogram PBS VG, och ett mikrogram av delta helper vektorer med hjälp av en transfection reagens och protokoll för lentivirus produktion. Efter sex timmars transfection, ändra mediet till en färsk en som motsvarar media av celler som skall transduced.Utsäde cellerna som skall förledas i en sex-brunns platta med deras standard odlingsmedia för att få 10 till 20% sammanflödet dagen efter. 24 timmar efter transfektion, återvinna det medium som innehåller lentiviral partiklar, och filtrera med hjälp av 0,45-mikron filter. Byt ut mediet för de celler som ska transduceds av det filtrerade mediet som innehåller lentivirus.Inkubera cellerna med lentivirus i 24 till 72 timmar i en inkubator vid 37 grader Celsius och 5%koldioxid, och sedan ändra mediet med färsk, standard en. Kontrollera GFP uttryck med hjälp av en inverterad fluorescerande mikroskop för att utvärdera effektiviteten av transduktion. Om ingen fluorescens upptäcks, vänta på ytterligare två till tre dagar.Om GFP-kontrollen är positiv med grön fluorescens, odla alla celler tills de har tillräckligt för att utföra ett uttryck kontroll av 6-His-FLAG ubiquitin-liknande av immunofluorescens, som visas här, och västra blot med hjälp av anti-FLAG antikropp. Efter att ha odlat cellerna i 15-centimeters rätter, diska kulturfaten minst en gång med fosfatbuffrad koksaltlösning vid rumstemperatur. För att börja celllys, tillsätt två milliliter buffert en i varje 15-centimeters maträtt vid rumstemperatur.Använd en cellskrapa för att återvinna alla lysater i 50-milliliter koniska centrifugrör. Sonikera lystates tre gånger i 30 sekunder, åtskilda av en minut paus. Centrifugera den sonicated lysates på 15, 000 gånger g i 15 minuter.Överför supernatanten till ett nytt rör genom en 40-mikron cellsil. Det är mycket viktigt att filtrera lysates efter ultraljudsbehandling och centrifugeringen. Att inte göra detta kan resultera i copurification av många icke-specifika proteiner, vilket ökar bakgrunden och starkt minska storleken på PTM profil.Överför en lika stor mängd protein mellan 50 och 100 milligram till nya Falcon-rör. Tillsätt nickeljon NTA pärlor i varje rör med mängden av två microliters av pärlor per ett milligram protein. Placera rören på en rotator för att rotera vid 30 rpm i 2 1/2 timme vid rumstemperatur.Pelleta sedan pärlorna vid 500 gånger g i fem minuter. Tvätta pärlorna med en milliliter buffert ett, och överför proverna till ett 1,5-milliliter mikrocentrifugrör. Placera röret på is.Tvätta två gånger med en milliliter iskall buffert två innehållande tio millimolar imidazol. För att elute-bundna proteiner, tillsätt 600 mikroliter buffert två som innehåller 250-millimolar imidazol, och rotera i två timmar vid fyra grader Celsius. Efter pelletering av pärlorna genom centrifugeringen vid 500 gånger g i en minut, överför supernatanten till ett nytt förkylt 1,5 milliliterrör och tillsätt 50 mikroliter anti-FLAG M2-antikroppskonjugerade pärlor.Rotera med 30 rpm i 2 1/2 timmar vid fyra grader Celsius. Tvätta sedan två gånger med 500 mikroliter av buffert två, sedan två gånger med 500 mikroliter av buffert tre. För den slutliga elueringen, tillsätt 100 mikroliter av buffert tre som innehåller en FLAG peptid på 0,01 mikrogram per mikroliter, och rotera i fyra grader Celsius i 1 1/2 timmar.Efter centrifugeringen vid 500 gånger g i en minut överför du supernatanten till ett nytt färdigkylt rör. Ta 10 mikroliter att ladda på SDS-PAGE, och utföra en silverfärgning av gelen för att styra reningskvaliteten. Om reningen ser bra ut, analysera 90%vänster av LC-MS.För att utföra normalisering, använd formlerna för att normalisera värden mellan läkemedelsbehandlade celler och obehandlade celler för ubiquitin och GFP. För att ta bort bakgrund, subtrahera värden i kontrollprovet GFP från värden i ubiquitinproverna, för att erhålla specifika värden för varje identifierat protein i båda villkoren. För att erhålla variationen av ubiquitination, erhålla en poäng mellan minus 100 och plus 100 för positiva och negativa variationer av PTMs induceras av ett läkemedel.Skillnaden mellan de specifika värdena för behandlade och obehandlade prover divideras med summan av alla värden, även de i kontrollen, och multipliceras med 100. Variationer under minus 50, som representerar förtryck av PTM, eller över 50, som representerar induktion av PTM, anses vara betydande. Använd den här formeln för att få ett konfidensvärde mellan noll och 100%Värden över 50 anses vanligtvis vara säkra.För att få en trevligare fördelning av induktions- och förtrycksvärden, och för att överväga både variation och konfidensparametrar, använd denna formel för att multiplicera varians- och förtroendevärdena. I denna studie uppnåddes transduktion av odlings däggdjur celler för att skapa GFP och 6-histidin FLAG ubiquitin uttrycker celler. Effekten av lentiviraltransduktion kontrollerades först genom att titta på GFP-fluorescensen av GFP-transduced celler.Uttrycket av FLAG-ubiquitin gjordes genom immunofluorescens färgning med hjälp av en anti-FLAG antikroppar, som visar andelen transduced celler. För att styra uttrycksnivån för exogena FLAG-ubiquitin, var lysates från transduced celler analyseras av SDS-PAGE följt av västra blot med anti-FLAG antikroppar. Efter rening av de ubiquitinated proteinerna, 10%av den slutliga eluering användes för att kontrollera mängden och integriteten av renat material genom SDS-PAGE och silver färgning av gelen.Bakgrund GFP prov subtraktion identifierat 364 proteiner betydligt ubiquitinated med en poäng över 50%A genuppsättning anrikning analys av dessa ubiquitinated proteiner utfördes i syfte att belysa de biologiska processer som de var inblandade. Potentiella samverkande nätverk som bildas av gemcitabin-inducerad ändringar av ubiquitination. Detta ledde till identifiering av funktionella interagerande nätverk som påverkas starkt av ökad eller minskad ubiquitination av de inblandade proteiner.Det bekräftades också att ubiquitination av PCNA ökade efter gemcitabin behandling. Det är mycket viktigt att undvika överföring av vissa pärlor efter båda eulution steg, eftersom det kan resultera i en betydande ökning av bakgrunden. Detta förfarande kommer att generera specifika ändringar efter översättning, som genom att jämföra olika villkor kommer att möjliggöra identifiering av specifika ändringar.Det första nästa steget kommer att validera åtminstone förändringar av intresse baserat på biokemiska metoder. Vi utvecklade denna metod för att utforska ubiquitin-baserade, post-translationella ändringar för att identifiera nya sätt och mekanismer för cancer i bukspottskörteln cancerceller. Eftersom detta protokoll och andra som utvecklats över hela världen har använts framgångsrikt för att dechiffrera olika biologiska processer.Lentivirusen måste användas åtminstone i BL-2 laboratorium. Guanidin är ett starkt denatureringsmedel och måste användas försiktigt. Den sonicator kan också vara skadligt för öron och måste användas efter rekommendationer.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Method for Measuring RNA N6-methyladenosine Modifications in Cells and Tissues

A Method for Measuring RNA N6-methyladenosine Modifications in Cells and Tissues

En metod för mätning av RNA<em&gt; N</em<sup&gt; 6</sup&gt; -methyladenosine Ändringar i celler och vävnader

N6-Methyladenosine (m6A) modifications of RNA are diverse and ubiquitous amongst eukaryotes. They occur in mRNA, rRNA, tRNA, and microRNA. Recent studies ...

Isolation of Intermediate Filament Proteins from Multiple Mouse Tissues to Study Aging-associated Post-translational Modifications

Isolering av intermediära filamentproteiner från flera musvävnader för att studera åldringsrelaterade posttranslationella modifieringar

Intermediate filaments (IFs), together with actin filaments and microtubules, form the cytoskeleton &#8211; a critical structural element of every cell. ...

Utilizing a Comprehensive Immunoprecipitation Enrichment System to Identify an Endogenous Post-translational Modification Profile for Target Proteins

Använda ett omfattande Immunoprecipitation berikning System för att identifiera en endogen posttranslationella modifieringen profil för målproteiner

It is now well-appreciated that post-translational modifications (PTMs) play an integral role in regulating a protein&#39;s structure and function, which ...

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

Polysome profilering i Leishmania, mänskliga celler och mus Testis

Proper protein expression at the right time and in the right amounts is the basis of normal cell function and survival in a fast-changing environment. For ...

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Identifiering av cyklin-beroende Kinase 1 särskilda fosforylering platser av ett In Vitro -Kinas Assay

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

Nitropeptid profilering och identifiering illustrerad av angiotensin II

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

Functional Characterization of RING-Type E3 Ubiquitin Ligases In Vitro and In Planta

Funktionell karaktärisering av RINGTYP E3 ubiquitin Ligaser in vitro och i planta

Ubiquitination, as a posttranslational modification of proteins, plays an important regulatory role in homeostasis of eukaryotic cells. The covalent ...

Ubiquitin Chain Analysis by Parallel Reaction Monitoring

Ubiquitin kedjeanalys genom parallell reaktionsövervakning

Assessment of the global profile of ubiquitin chain topologies within a proteome is of interest to answer a wide range of biological questions. The ...

Purification of Tubulin with Controlled Posttranslational Modifications and Isotypes from Limited Sources by Polymerization-Depolymerization Cycles

Rening av tubulin med kontrollerade posttranslational modifieringar och isotyper från begränsade källor genom polymerisation-depolymeriseringscykler

One important aspect of studies of the microtubule cytoskeleton is the investigation of microtubule behavior in in vitro reconstitution experiments. They ...

Ganglioside Extraction, Purification and Profiling

Utvinning, rening och profilering av gangliosid

Gangliosides are glycosphingolipids that contain one or more sialic acid residues. They are found on all vertebrate cells and tissues but are especially ...