Name: profiling ubiquitin and ubiquitin-like dependent post-translational modifications and identification of significant alterations
Uploaded: 2019-11-07T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Profiling Ubiquitin and Ubiquitin-like Dependent Post-translational Modifications and Identification of Significant Alterations at JoVE.com

Bu çalışma La Ligue Contre le Cancer tarafından HV ve MS'e ve ARC (dernek pour la recherche sur le cancer) tarafından PS, INCa (institute national du cancer) ve Canceropole PACA to JI tarafından desteklendi. IBISA (Infrastructures Biologie Santé et Agronomie), Plateforme Technologique Aix-Marseille, Cancéropôle PACA, Provence-Alpes-Côte d'Azur tarafından desteklenen Marsilya Proteomics (marseille-proteomique.univ-amu.fr) kütle spektrometresi tesisi Région, Institut Paoli-Calmettes ve Centre de Recherche en Cancérologie de Marseille.

1. 6His-Bayrak-Ubl ifade kararlı hücre hatları nesil
NOT: HEK-293T hücrelerinin pCCL-6HF-Ubl, pVSVG ve delta-Helper ile birlikte transfeksiyonu.
<ol><li>0. Gün: Tohum 293T hücreleri 6-iyi plaka elde etmek için 50-70% ertesi gün biraraya.</li>
	<li>1. Gün: Lentivirüs üretimi için transfeksiyon reaktifi ve protokolü kullanarak 1 μg pCCL-6HF-Ubl veya pCCL-GFP, 1 μg pVSVG ve 1 μg delta-Helper vektörleri karışımı ile co-transfect%50-70 konfluent hücreler. Transfeksiyon 6 saa...

<ol>
	<li>Prabakaran, S., Lippens, G., Steen, H., Gunawardena, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-translational+modification:+Nature's+escape+from+genetic+imprisonment+and+the+basis+for+dynamic+information+encoding.">Post-translational modification: Nature's escape from genetic imprisonment and the basis for dynamic information encoding.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: Systems Biology and Medicine. , (2012).</li><li>Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+and+function+of+ubiquitin-like+proteins.">Origin and function of ubiquitin-like proteins.</a> Nature. 458 (7237), 422-429 (2009).</li><li>Kirkpatrick, D. S., Weldon, S. F., Tsaprailis, G., Liebler, D. C., Gandolfi, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+identification+of+ubiquitinated+proteins+from+human+cells+expressing+His-tagged+ubiquitin.">Proteomic identification of ubiquitinated proteins from human cells expressing His-tagged ubiquitin.</a> Proteomics. 5 (8), 2104-2111 (2005).</li><li>Peng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+proteomics+approach+to+understanding+protein+ubiquitination.">A proteomics approach to understanding protein ubiquitination.</a> Nature Biotechnology. 21 (8), 921-926 (2003).</li><li>Matsumoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+analysis+of+the+human+ubiquitin-related+proteome.">Large-scale analysis of the human ubiquitin-related proteome.</a> Proteomics. 5 (16), 4145-4151 (2005).</li><li>Hjerpe, R., Rodr&#237;guez, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+approaches+for+characterizing+ubiquitinated+proteins.">Efficient approaches for characterizing ubiquitinated proteins.</a> Biochemical Society Transactions. 36 (5), 823-827 (2008).</li><li>Bonacci, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+new+mechanisms+of+cellular+response+to+chemotherapy+by+tracking+changes+in+post-translational+modifications+by+ubiquitin+and+ubiquitin-like+proteins.">Identification of new mechanisms of cellular response to chemotherapy by tracking changes in post-translational modifications by ubiquitin and ubiquitin-like proteins.</a> Journal of Proteome Research. 13 (5), 2478-2494 (2014).</li><li>Bedford, L., Lowe, J., Dick, L. R., Mayer, R. J., Brownell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin-like+protein+conjugation+and+the+ubiquitin-proteasome+system+as+drug+targets.">Ubiquitin-like protein conjugation and the ubiquitin-proteasome system as drug targets.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 10 (1), 29-46 (2011).</li><li>Hoeller, D., Dikic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+ubiquitin+system+in+cancer+therapy.">Targeting the ubiquitin system in cancer therapy.</a> Nature. 458 (7237), 438-444 (2009).</li><li>Silva, J. C., Gorenstein, M. V., Li, G. Z. Z., Vissers, J. P. C., Geromanos, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absolute+quantification+of+proteins+by+LCMSE:+a+virtue+of+parallel+MS+acquisition.">Absolute quantification of proteins by LCMSE: a virtue of parallel MS acquisition.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. , (2006).</li><li>Kim, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+and+quantitative+assessment+of+the+ubiquitin-modified+proteome.">Systematic and quantitative assessment of the ubiquitin-modified proteome.</a> Molecular Cell. 44 (2), 325-340 (2011).</li></ol>

Biz ana ubikitin aile üyeleri tarafından modifiye protein profilleri oluşturmak için sağlam ve güvenilir bir metodoloji geliştirdik. Nitekim, biz başarıyla ubiquitin tarafından PTMs profilleri oluşturmak için bu protokolü uyguladık, ve ayrıca SUMO ve Nedd8 tarafından, ve bir tedavi ile ilişkili değişiklikleri tespit etmekiçin 7, belirli bir genin aşırı ifade veya nakavt yanıt olarak (veri değil gösterilen) ve çeşitli kemoterapötik ilaçlara dirençli fenotip edinilen h...

Burada önerilen yöntem, belirli bir durumla ilişkili potansiyel değişiklikleri (tedavi, farklılaşma, vb.) belirlemek için kültürlü memeli hücrelerinden ubikitin aile üyeleri tarafından aracılık edilen PtM'leri incelemek için ayrılmıştır. Ptm'ler proteinlerin fonksiyonlarının düzenlenmesinin son adımını temsil eder1. Nitekim, bir kez çeviri makineleri tarafından üretilen, çoğu değilse tüm proteinler kendi aktivitesini modüle PTM'ler farklı türde uğrar, moleküler etkileşimleri, ve hücre içi konumu1. PtM bolluk arasında proteinlerin ubiquitin ailesi tarafından aracılık olanlar, ubiquitin kendisi ve tüm ubikitin benzeri, tüm hücre içi veya kısmen sitoplazmik proteinleri düzenlemek için potansiyele sahip2. Kendileri protein oldukları için, her biri belirli düzenleyici işlevlerle ilişkili homojen ve heterojen çeşitli topolojilerin homojen ve heterojen zincirlerini oluşturarak birbirlerine konjuge edilebilirler2. Bu karmaşık makineyi çözmek ve anlamak için araçlara ihtiyaç vardır. Birçok yaklaşımlar dünya çapında, kendi avantajları ve dezavantajları olan geliştirilmiştir ve burada kültürlü hücreler için uygun yüksek performanslı bir öneriyoruz.
Bu yöntemin en büyük avantajı doğruluğudur. Nitekim, izole modifiye proteinlerin saflığı son derece iki etiket (6His ve Bayrak) ve iki adım prosedürü kombinatoryal kullanımı ile geliştirilmiş ve bu nedenle tek bir etiket füzyon ub / Ubl3çok daha seçici olduğunu,4. 6His etiketinin varlığı, tamamen inkar eden bir durumda arınmanın ilk adımını sağlar ve böylelikle ubikitin bağlayıcı etki alanları veya her yerde bulunanlara bağlanan diğer proteinler içeren proteinlerin birlikte saflaştırılmasından kaçınır. Bu teknik bir sorun ya spesifik antikorlar5 veya tandem ubiquitin bağlayıcı elemanları (TUBEs)6kullanarak ubiquitinated proteomların yakınlık saflaştırma dayalı birçok diğer yaklaşımlar tarafından karşılaşılan bir teknik sorundur . Daha da önemlisi, bu teknik her yerde belirli bir tür arınma lehine önyargılı değildir, bu bazı diğer yaklaşımlar için durum olabilir gibi, poliubiquitinations hem mono ve farklı türde tespit edildi beri7. Sonuç olarak, bir kez bulundu, ubiquitination bir değişiklik ilgili her yerde tam türünü belirlemek için standart biyokimyasal yaklaşımlar tarafından daha ayrıntılı olarak incelenmesi gerekecektir.
Son olarak, bu protokolün bir diğer teknik avantajı, normal hücresel davranışa müdahale etmeden etiketli değiştiriciifadelerinin makul düzeyde olan kararlı ifade hücre çizgileri oluşturan lentivirüslerin kullanımıdır.
Ubikitinasyonun önemli bir rolü proteazomal bozulma için proteinleri hedeflemek ise, şimdi potansiyel olarak en hücre içi veya kısmen hücre içi proteinler için birçok düzenleyici özelliklere sahip olduğu bilinmektedir1. Bu fonksiyonların sayısı daha proteinler gibi birçok ubiquitin varlığı ile artar, proteinlerin hemen hemen her hücre mekanizması nı düzenleyen bir aile oluşturan1. Onların değişiklikler hücre biyolojisi üzerinde köklü etkisi olabilir ve yol açabilir veya patolojikdurumlarakatılabilir 8 , kanser gibi9. Bu nedenle, araçlar bu geniş manzara keşfetmek ve yeni terapötik hedefler olarak hizmet verebilir patolojik bir durum ile ilişkili değişiklikleri belirlemek için gereklidir.
Bu protokol, ub/Ubl etiketli eksojeni ifade etmek için transeksedilmesi gerektiğinden kültürdeki hücrelere adanmıştır. Oluşturulduktan sonra, bu kararlı hücre çizgileri 2D veya 3D veya ksenogreft kültüründen Ubl profilleri oluşturmak için kullanılabilir, böylelikle PTM profilleri çalışmak için uygulanabilir farklı deneysel modellerin ufkunu genişleterek.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ANTI-FLAG M2 Affinity Gel</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2220-5ML</td>
			<td>binds all Flag tagged proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Flag M2 antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F3165</td>
			<td>to detect 6His-Flag tagged expression of ub/ubl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer 40 &#181;m</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td>to remove floating pellet from guanidine lysed cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flag peptide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F3290</td>
			<td>elute flag tagged proteins from anti-flag beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanidine hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>50933</td>
			<td>chaotropic agent used to denature all proteins in cell lysate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I5513</td>
			<td>eluates 6His bond proteins from Ni-NTA beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 3000</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>L3000015</td>
			<td>to transfect HEK-293T cells to produce lentiviruses</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lobind tubes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z666491</td>
			<td>avoids absorption of precious material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membrane Filter, 0.45 &#181;m</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>HAWP04700F1</td>
			<td>to filter the lentiviral supernantant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>30210</td>
			<td>purification of the 6His tag</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

profiling ubiquitin and ubiquitin-like dependent post-translational modifications and identification of significant alterations

Proteinlerin ubikitin (ub) ve ubiquitin benzeri (ubl) bağımlı post-translational modifikasyonları protein stabilitesini, aktivitesini, etkileşimlerini ve hücre içi lokalizasyonunu kontrol ederek hücre içinde temel biyolojik düzenleyici rolleri oynar. Hücrenin sinyallere yanıt vermesine ve çevredeki değişikliklere uyum sağlamasına olanak sağlar. Bu mekanizmalar içinde değişiklikler nörodejeneratif hastalıklar ve kanserler gibi ciddi patolojik durumlara yol açabilir. Burada açıklanan tekniğin amacı, kültürlü hücre çizgilerinden ub/ubls bağımlı PTM profillerinin hızlı ve doğru bir şekilde oluşturulmasıdır. Farklı koşullardan elde edilen farklı profillerin karşılaştırılması, örneğin bir tedavi tarafından indüklenenler gibi belirli değişikliklerin tanımlanmasına olanak tanır. Lentiviral aracılı hücre transdüksiyonu, değiştiricinin (ubiquitin veya SUMO1 veya Nedd8 gibi bir ubl) iki tag (6His ve Bayrak) sürümünü ifade eden kararlı hücre çizgileri oluşturmak için gerçekleştirilir. Bu etiketler her yerde saflaştırma ve bu nedenle hücrelerden her yerde proteinlerin izin verir. Bu iki aşamalı bir arınma işlemi ile yapılır: İlki 6His etiketi kullanılarak denatüre koşullarında gerçekleştirilir ve ikincisi bayrak etiketi kullanılarak yerel koşullarda gerçekleştirilir. Bu, daha sonra sıvı kromatografi spektrografi ve tandem kütle spektrometresi (LC-MS/MS) teknolojisi ile tanımlanan ve yarı-nicelleştirilmiş modifiye proteinlerin son derece spesifik ve saf izolasyonuna yol açar. Excel yazılımını kullanarak MS verilerinin kolay enformatik analizi, arka plan sinyallerini ortadan kaldırarak PTM profillerinin oluşturulmasını sağlar. Bu profiller, standart biyokimya teknikleri ile doğrulanmalarından başlayarak, daha spesifik olarak incelenecek belirli değişiklikleri belirlemek için her durum arasında karşılaştırılır.

GFP ve 6HF-Ub ifade hücreleri oluşturmak için kültür memeli hücrelerinin transdüksiyon Daha sonra MiaPaCa-2 hücrelerini nakletmek için kullanılacak lentivirüsler üretmek için, 70% confluent HEK-293T hücreleri üç vektör, pCCL-6HF-Ubiquitin veya GFP / Delta-Helper / pvSvG eşit miktarda transfected vardır. 24 saat üretimden sonra merceksi viral partiküller içeren ortam geri kazanılır ve süzülür. Bu noktada transfeksiyonun verimliliğini, ters bi...

Watch this Scientific Journal Video about Profiling Ubiquitin and Ubiquitin-like Dependent Post-translational Modifications and Identification of Significant Alterations at JoVE.com

Profiling Ubiquitin and Ubiquitin-like Dependent Post-translational Modifications and Identification of Significant Alterations

Bu protokol, bu tür çeviri sonrası modifikasyonların (PtM'ler) bir tedavi veya fenotip gibi belirli bir durumla ilişkili değişikliklerini belirlemek için ubiquitin (Ub) ve ubiquitin benzeri (Ubls) spesifik proteomların oluşturulmasını amaçlamaktadır.

Ubiquitin ve Ubiquitin benzeri Bağımlı Post-translational Modifikasyonlar ve Önemli Değişikliklerin Belirlenmesi Profilleme

Ubiquitin (ub) and ubiquitin-like (ubl) dependent post-translational modifications of proteins play fundamental biological regulatory roles within the ...

Bu protokol, spesifik tanımlanmış proteinleri tanımlayarak ve yarı nicelleştirerek ubiquitin ve ubiquitin benzeri post-translational modifikasyonların profillerini oluşturmanın kolay bir yoludur. Bu tekniğin en büyük avantajı, lentivirüslerin bir hafta içinde kararlı bir ifade hücresi hattı oluşturmak için kullanılması ve proteinleri özel olarak arındırmak için iki etiket in kullanılmasıdır. Aslında, bu tür post-çevirisel değişiklikler çoğu biyolojik fonksiyonlarda yer alır ve bu mekanizmanın değişiklikleri çoğu hastalıkta bulunur.Bu nedenle, bu değişikliklerin belirlenmesi prognostik ve/veya tanı ve tabii ki moleküler hedefler olarak kullanılabilir. Ubiquitin ökaryotik hücrelerde en korunmuş protein biridir ve bu onların hayatta kalmak için gerekli. Bu nedenle, bu tür bir yöntem memelilerden mayaya kadar her ökaryotik modele uygulanabilir.Ancak, bizim lentiviral sistem hücrelerin çalışma ile sınırlıdır. Tüm işlem bazen uzun kuluçka süresi ile oldukça uzun olduğundan, bir yerine iki gün içinde bunu yapmak mümkündür. Nikel boncuklardan elde edilen ler eksi 20'de ve Bayrak boncuklarını eklemeden önce dondurulabilir.Bu protokol, arınmanın nihai başarısını garanti altına almak ve böylece çeviri sonrası modifikasyon profilinin doğru kurulmasını garanti etmek için aralarında bazılarının kritik olduğu birçok adım içerir. Prosedürün gösterilmesi mirna Swayden ve Aurelie Dobric, laboratuvar iki doktora öğrencileri tarafından yapılacaktır. Başlamak için, tohuma% 10 FBS ile DMEM kuyusu başına iki mililitre ile altı iyi bir plaka HEK 293T hücrelerinin altıncı 0,5 kez 10 ekleyin ve 37 derece santigrat, % 5 karbondioksit ve% 100 nem kuluçka.Ertesi gün, 50-70% biraraya elde edilir. Kolör hücreleri pCCL-6HF ubiquitin benzeri veya pCCL-GFP bir mikrogram, PBS VG bir mikrogram ve lentivirus üretimi için bir transfeksiyon reaktifi ve protokol kullanarak delta yardımcı vektörlerin bir mikrogram karışımı ile hücreleri. Altı saatlik transfeksiyondan sonra, ortamı, transekedilecek hücrelerin ortamına karşılık gelen yeni bir ortama dönüştürün.%10-20'lik bir gün birleşimini elde etmek için, standart kültür ortamları ile altı kuyulu bir plaka içinde geçirilecek hücreleri tohumlayın. Transfeksiyondan 24 saat sonra, merceksi viral partiküller içeren ortamı geri alın ve 0,45 mikronfiltre kullanarak filtre uygulayın. Lentivirüsler içeren filtrelenmiş ortam tarafından transe edilecek hücrelerin orta sını değiştirin.Hücreleri 37 santigrat derece ve %5 karbondioksit le bir kuluçka makinesinde 24 ila 72 saat boyunca lentivirüslerle kuluçkaya yatırın ve sonra ortamı taze, standart bir maddeyle değiştirin. Transdüksiyonun verimliliğini değerlendirmek için ters floresan mikroskop kullanarak GFP ifadesini kontrol edin. Floresan algılanmamışsa, iki ila üç gün daha bekleyin.GFP kontrolü yeşil floresan ile pozitif ise, burada gösterildiği gibi, immünofloresan tarafından 6-His-FLAG ubiquitin gibi bir ifade kontrolü gerçekleştirmek için yeterli olana kadar tüm hücreleri büyümek, ve batı leke anti-FLAG antikor kullanarak. Hücreleri 15 santimetrelik tabaklarda büyüttükten sonra, kültür yemeklerini en az bir kez oda sıcaklığında fosfat tamponlu tuzlu ile yıkayın. Hücre lisis başlamak için, oda sıcaklığında her 15 santimetrelik çanak içine tampon bir iki mililitre ekleyin.50 mililitrelik konik santrifüj tüpler içine tüm lysates kurtarmak için bir hücre kazıyıcı kullanın. 30 saniye boyunca üç kez listates sonicate, bir dakikalık bir duraklama ile ayrılmış. 15 dakika boyunca 15, 000 kez g sonicated lysates santrifüj.Süpernatantı 40 mikronluk bir süzgeçle yeni bir tüpe aktarın. Sonication ve santrifüj den sonra lysates filtre lemek çok önemlidir. Bunu yapmamak birçok spesifik olmayan proteinin saflaştırılmasına neden olabilir, böylece arka planı artırabilir ve PTM profilinin boyutunu güçlü bir şekilde azaltabilir.50 ile 100 miligram arasında eşit miktarda proteini yeni Falcon tüplerine aktarın. Protein bir miligram başına boncuk iki mikrolitre miktarı ile her tüp içine nikel iyon NTA boncuk ekleyin. Tüpleri oda sıcaklığında 2,5 saat boyunca 30 rpm'de döndürmek için bir rotator üzerine yerleştirin.Sonra boncukları 5dakika boyunca 500 kez g'ye alın. Boncukları bir mililitre tampon tüple yıkayın ve numuneleri 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Tüpü buza yerleştirin.On milimolar imidazol içeren bir mililitre buz gibi tampon iki ile iki kez yıkayın. Elute bağlı proteinler için, tampon iki 250 milimolar imidazol içeren 600 mikrolitre ekleyin ve dört santigrat derece iki saat döndürün. Bir dakika için 500 kez g santrifüj ile boncuk peletleme sonra, yeni bir önceden soğutulmuş 1.5 mililitretüp supernatant aktarın ve anti-FLAG M2 antikor konjuge boncuk 50 mikrolitre ekleyin.4 santigrat derecede 2,5 saat boyunca 30 rpm'de döndürün. Sonra tampon iki 500 mikrolitre ile iki kez yıkayın, sonra tampon üç 500 mikrolitre ile iki kez. Son elüsyon için, mikrolitre başına 0,01 mikrogram da FLAG peptid içeren tampon üç 100 mikrolitre ekleyin ve 1 1/2 saat boyunca dört santigrat derecede döndürün.Bir dakika için 500 kez g santrifüj sonra, yeni bir önceden soğutulmuş tüp için supernatant aktarın. SDS-PAGE'e yüklemek için 10 mikrolitre alın ve arıtma kalitesini kontrol etmek için jelin gümüş boyamasını gerçekleştirin. Arınma iyi görünüyorsa, LC-MS tarafından bırakılan %90'ı analiz edin.Normalleştirme gerçekleştirmek için, ubiquitin ve GFP için ilaç tedavi hücreleri ve tedavi edilmemiş hücreler arasındaki değerleri normalleştirmek için formülleri kullanın. Arka planı kaldırmak için, her iki durumda da tanımlanan her protein için belirli değerler elde etmek için, kontrol numunesi GFP değerlerini ubikitin örneklemlerinde değerlerden çıkarın. Her yerde bulunan varyasyonu elde etmek için, bir ilaç tarafından indüklenen PtM'lerin pozitif ve negatif varyasyonları için eksi 100 ile artı 100 arasında bir puan alın.İşlenen ve işlenmemiş örneklerin belirli değerleri arasındaki fark, kontroldekiler de dahil olmak üzere tüm değerlerin toplamına bölünür ve 100 ile çarpılır. PTM'nin baskıyı temsil eden eksi 50'nin altındaki veya PTM'nin indüksiyonuna neden olan 50'nin üzerindeki varyasyonlar anlamlı kabul edilir. 50'nin üzerindeki sıfır ve %100 değerleri arasında bir güven değeri elde etmek için bu formülü kullanın genellikle emin olarak kabul edilir.İndüksiyon ve bastırma değerlerinin daha güzel bir dağılımını elde etmek ve hem varyasyon hem de güven parametrelerini göz önünde bulundurmak için varyans ve güven değerlerini çarpmak için bu formülü kullanın. Bu çalışmada, kültür memeli hücrelerinin transdüksiyonu GFP ve 6-histidin FLAG ubiquitin ifade hücreleri oluşturmak için elde edilmiştir. Lentiviral transdüksiyonun etkinliği ilk olarak GFP'ye bağlı hücrelerin GFP floresansı inceleyerek kontrol edildi.FLAG-ubikitin ekspresyonu, transekte hücrelerin yüzdesini gösteren bir anti-FLAG antikor kullanılarak immünoresans boyama ile yapıldı. Eksojen FLAG-ubiquitin ekspresyon düzeyini kontrol etmek için transeksed hücrelerden lysates SDS-PAGE tarafından analiz edildi ve ardından anti-FLAG antikorlu batı lekesi incelendi. Her yerde bulunan proteinlerin saflaştırılmasından sonra, son elüsyonun %10'u SDS-PAGE ve jelin gümüş boyama sıyrıklarının miktarını ve bütünlüğünü kontrol etmek için kullanılmıştır.Arka plan GFP örnek çıkarma tespit 364 proteinler önemli ölçüde üzerinde bir skor ile her yerde 50%A gen seti zenginleştirme analizi bu ubikitinated proteinlerin dahil oldukları biyolojik süreçleri vurgulamak için yapılmıştır. Her yerde gemsitaten indüklenen değişikliklerden oluşan potansiyel etkileşim ağları. Bu, ilgili proteinlerin artmış veya azalmış her yerde bulunan etkilerinden güçlü bir şekilde etkilenen işlevsel etkileşim ağlarının tanımlanmasına yol açmıştır.Ayrıca gemsitain tedavisinden sonra PCNA'nın her yerde arttığı doğrulandı. Her iki elution adımından sonra bazı boncukların aktarılmasını önlemek çok önemlidir, çünkü arka planda önemli bir artışa neden olabilir. Bu yordam, farklı koşulları karşılaştırarak, belirli değişikliklerin tanımlanmasını sağlayacak belirli çeviri sonrası değişiklikler üretecektir.İlk sonraki adım biyokimyasal yaklaşımlara dayalı ilgi değişiklikleri en azından doğrulamak olacaktır. Biz pankreas kanseri hücrelerinin yeni yolları ve mekanizmaları belirlemek için ubiquitin tabanlı, post-çevirisel değişiklikler keşfetmek için bu yöntemi geliştirdi. Bu protokol ve dünya çapında geliştirilen diğer yana farklı biyolojik süreçleri deşifre etmek için başarıyla istihdam edilmiştir.Lentivirüsler en azından BL-2 laboratuvarında kullanılmalıdır. Guanidin güçlü bir denaturing ajanıdır ve dikkatli kullanılmalıdır. Sonicator da kulaklar için zararlı olabilir ve aşağıdaki öneriler in kullanılması gerekir.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Method for Measuring RNA N6-methyladenosine Modifications in Cells and Tissues

A Method for Measuring RNA N6-methyladenosine Modifications in Cells and Tissues

RNA ölçülmesi için bir yöntem<em&gt; K</em<sup&gt; 6</supHücre ve dokularda&gt; -methyladenosine Değişiklikler

N6-Methyladenosine (m6A) modifications of RNA are diverse and ubiquitous amongst eukaryotes. They occur in mRNA, rRNA, tRNA, and microRNA. Recent studies ...

Isolation of Intermediate Filament Proteins from Multiple Mouse Tissues to Study Aging-associated Post-translational Modifications

Yaşlanmaya Bağlı Translasyon Sonrası Değişiklikleri İncelemek İçin Birden Fazla Fare Dokusundan Ara Filament Proteinlerinin İzolasyonu

Intermediate filaments (IFs), together with actin filaments and microtubules, form the cytoskeleton &#8211; a critical structural element of every cell. ...

Utilizing a Comprehensive Immunoprecipitation Enrichment System to Identify an Endogenous Post-translational Modification Profile for Target Proteins

Bir endojen translasyonel modifikasyon profil hedef proteinler için tanımlamak için bir kapsamlı Immunoprecipitation zenginleştirme sistemi kullanan

It is now well-appreciated that post-translational modifications (PTMs) play an integral role in regulating a protein&#39;s structure and function, which ...

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

Polysome LEISHMANIA, insan hücreleri ve fare Testis profil oluşturma

Proper protein expression at the right time and in the right amounts is the basis of normal cell function and survival in a fast-changing environment. For ...

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Siklin bağımlı kinaz 1 tanımlaması belirli fosforilasyon siteleri bir Vitro kinaz tarafından tahlil

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

Anjiyotensin II tarafından gösterilen nitropeptid profil oluşturma ve tanımlama

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

Functional Characterization of RING-Type E3 Ubiquitin Ligases In Vitro and In Planta

Ring Tipi E3 Ubiquitin Ligases In Vitro ve Planta Fonksiyonel Karakterizasyonu

Ubiquitination, as a posttranslational modification of proteins, plays an important regulatory role in homeostasis of eukaryotic cells. The covalent ...

Ubiquitin Chain Analysis by Parallel Reaction Monitoring

Paralel Reaksiyon İzleme ile Ubiquitin Zincir Analizi

Assessment of the global profile of ubiquitin chain topologies within a proteome is of interest to answer a wide range of biological questions. The ...

Purification of Tubulin with Controlled Posttranslational Modifications and Isotypes from Limited Sources by Polymerization-Depolymerization Cycles

Tubulin'in Kontrollü Posttranslational Modifikasyonlar ve Sınırlı Kaynaklardan İzotiplerle Polimerizasyon-Depolimerizasyon Döngüleri ile Saflaştırılması

One important aspect of studies of the microtubule cytoskeleton is the investigation of microtubule behavior in in vitro reconstitution experiments. They ...

Ganglioside Extraction, Purification and Profiling

Ganglioside Ekstraksiyonu, Saflaştırma ve Profilleme

Gangliosides are glycosphingolipids that contain one or more sialic acid residues. They are found on all vertebrate cells and tissues but are especially ...