Name: stereological estimation of cholinergic fiber length in the nucleus basalis of meynert of the mouse brain
Uploaded: 2020-02-05T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Stereological Estimation of Cholinergic Fiber Length in the Nucleus Basalis of Meynert of the Mouse Brain at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af tilskud til W.Z.S. fra Medical Research and Development Service, Department of Veterans Affairs (Merit Review 1I01 BX001067-01A2), Alzheimers Association (NPSPAD-11-202149), og ressourcer fra Midtvesten Biomedical Forskningsfond.

Alle procedurer for brug af disse dyr er blevet godkendt af Kansas City Veterans Affairs Medical Center Institutional Animal Care and Use Committee. Atten måneder gamle mus overudtrykker svenske mutant beta-amyloid prækursor protein (ApPswe) og deres C57/BL6 WT littermates blev brugt til forsøgene. Nærmere oplysninger om avl og genoyping er givet i He et al.8.
1. Perfusion og vævsbehandling
<ol><li>Bedøve mus ved hjælp af en intraperitoneal injektion med ketami...

<ol>
	<li>Mouton, P. R., Gokhale, A. M., Ward, N. L., West, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereological+length+estimation+using+spherical+probes.">Stereological length estimation using spherical probes.</a> Journal of Microscopy. 206, 54-64 (2002).</li><li>Whitehouse, P. J., Price, D. L., Clark, A. W., Long Coyle, J. T., DeLong, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alzheimer+disease:+evidence+for+selective+loss+of+cholinergic+neurons+in+the+nucleus+basalis.">Alzheimer disease: evidence for selective loss of cholinergic neurons in the nucleus basalis.</a> Annals of Neurology. 10 (2), 122-126 (1981).</li><li>Davies, P., Maloney, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+loss+of+central+cholinergic+neurons+in+Alzheimer's+disease.">Selective loss of central cholinergic neurons in Alzheimer's disease.</a> The Lancet. 2 (8000), 1403 (1976).</li><li>Bartus, R. T., Dean, R. L., Beer, B., Lippa, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cholinergic+hypothesis+of+geriatric+memory+dysfunction.">The cholinergic hypothesis of geriatric memory dysfunction.</a> Science. 217 (4558), 408-414 (1982).</li><li>Savonenko, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Episodic-like+memory+deficits+in+the+APPswe/PS1dE9+mouse+model+of+Alzheimer's+disease:+relationships+to+beta-amyloid+deposition+and+neurotransmitter+abnormalities.">Episodic-like memory deficits in the APPswe/PS1dE9 mouse model of Alzheimer's disease: relationships to beta-amyloid deposition and neurotransmitter abnormalities.</a> Neurobiology of Disease. 18 (3), 602-617 (2005).</li><li>Perez, S. E., Dar, S., Ikonomovic, M. D., DeKosky, S. T., Mufson, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholinergic+forebrain+degeneration+in+the+APPswe/PS1DeltaE9+transgenic+mouse.">Cholinergic forebrain degeneration in the APPswe/PS1DeltaE9 transgenic mouse.</a> Neurobiology of Disease. 28 (1), 3-15 (2007).</li><li>Stokin, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonopathy+and+transport+deficits+early+in+the+pathogenesis+of+Alzheimer's+disease.">Axonopathy and transport deficits early in the pathogenesis of Alzheimer's disease.</a> Science. 307 (5713), 1282-1288 (2005).</li><li>He, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GRK5+Deficiency+Leads+to+Selective+Basal+Forebrain+Cholinergic+Neuronal+Vulnerability.">GRK5 Deficiency Leads to Selective Basal Forebrain Cholinergic Neuronal Vulnerability.</a> Scientific Reports. 6, 26116 (2016).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lab+Animal+Research.+Anesthesia+Induction+and+Maintenance.">Lab Animal Research. Anesthesia Induction and Maintenance.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2019).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents.">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).</li><li>Mouton, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Unbiased Stereology-A Concise Guide. , (2011).</li><li>West, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+started+in+stereology.">Getting started in stereology.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2013 (4), 287-297 (2013).</li><li>West, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Space+Balls+Revisited:+Stereological+Estimates+of+Length+With+Virtual+Isotropic+Surface+Probes.">Space Balls Revisited: Stereological Estimates of Length With Virtual Isotropic Surface Probes.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 12, 49 (2018).</li><li>Nikolajsen, G. N., Kotynski, K. A., Jensen, M. S., West, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+the+capillary+network+of+aged+APPswe/PS1dE9+transgenic+mice.">Quantitative analysis of the capillary network of aged APPswe/PS1dE9 transgenic mice.</a> Neurobiology of Aging. 36 (11), 2954-2962 (2015).</li><li>Gutierrez-Jimenez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disturbances+in+the+control+of+capillary+flow+in+an+aged+APP(swe)/PS1DeltaE9+model+of+Alzheimer's+disease.">Disturbances in the control of capillary flow in an aged APP(swe)/PS1DeltaE9 model of Alzheimer's disease.</a> Neurobiology of Aging. 62, 82-94 (2018).</li><li>Gundersen, H. J., Jensen, E. B., Kieu, K., Nielsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+efficiency+of+systematic+sampling+in+stereology--reconsidered.">The efficiency of systematic sampling in stereology--reconsidered.</a> Journal of Microscopy. 193, 199-211 (1999).</li><li>Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+study+of+the+capillaries+within+the+white+matter+of+the+Tg2576+mouse+model+of+Alzheimer's+disease.">Quantitative study of the capillaries within the white matter of the Tg2576 mouse model of Alzheimer's disease.</a> Brain and Behavior. 9 (4), 01268 (2019).</li><li>McNeal, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unbiased+Stereological+Analysis+of+Reactive+Astrogliosis+to+Estimate+Age-Associated+Cerebral+White+Matter+Injury.">Unbiased Stereological Analysis of Reactive Astrogliosis to Estimate Age-Associated Cerebral White Matter Injury.</a> Journal of Neuropathology Experimental Neurology. 75 (6), 539-554 (2016).</li><li>Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Passive+(amyloid-beta)+immunotherapy+attenuates+monoaminergic+axonal+degeneration+in+the+AbetaPPswe/PS1dE9+mice.">Passive (amyloid-beta) immunotherapy attenuates monoaminergic axonal degeneration in the AbetaPPswe/PS1dE9 mice.</a> Journal of Alzheimer's Disease. 23 (2), 271-279 (2011).</li><li>Gagnon, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+Sprouting+of+Dopamine+and+Serotonin+Axons+in+the+Pallidum+of+Parkinsonian+Monkeys.">Evidence for Sprouting of Dopamine and Serotonin Axons in the Pallidum of Parkinsonian Monkeys.</a> Frontiers of Neuroanatomy. 12, 38 (2018).</li><li>Boncristiano, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholinergic+changes+in+the+APP23+transgenic+mouse+model+of+cerebral+amyloidosis.">Cholinergic changes in the APP23 transgenic mouse model of cerebral amyloidosis.</a> Journal of Neuroscience. 22 (8), 3234-3243 (2002).</li></ol>

Her demonstrerer vi en metode til at vurdere tætheden af kolinerge fibre i NBM ved hjælp af en rumkugle (kugle) sonde. Denne sonde anslår den samlede fiberlængde i interesseområdet. Den samlede længde kan divideres med mængden af regionen for at få fibertætheden. For at anslå regionens volumen blev Kavalieri-pointtællingsmetoden anvendt. Cavalieri point count metoden er en upartisk og effektiv estimator af en 3D-referencevolumen for enhver region. Metoden beregner et skøn over arealet på en afskåret flade a...

Kvantitative skøn over længden og/eller tætheden af nervefibre i hjernen er vigtige parametre for neuropatologiske undersøgelser. Længden af kolinerge, dopaminerge, og serotonerge axoner i forskellige hjerneregioner er ofte korreleret med de specifikke funktioner i regionen. Fordi fordelingen af disse axoner er generelt heterogen, design-baseret stereologi bruges til at undgå bias under prøveudtagning. Rumkuglesonden af stereologi er designet til at give effektive og pålidelige foranstaltninger af linjelignende strukturer såsom neuronale fibre i en region af interesse1. Sonden gør en virtuel kugle, der pålægges systematisk i vævet til at måle linje skæringspunkter med overfladen af sonden. Fordi det er umuligt at sætte sfære sonder i vævet til analyse, den kommercielt tilgængelige software giver en virtuel tre-dimensionelle (3D) kugle, som er dybest set en række koncentriske cirkler af forskellige diametre, der repræsenterer overfladen af kuglesonden.
Selektiv kolinerge neurodegeneration er en af de konsekvente træk ved Alzheimers sygdom (AD)2,3,4. Dysfunktionel kolinerge transmission betragtes som en årsagsfaktor for kognitiv tilbagegang i AD. Kolinerge dysfunktion er også tydeligt i mange andre psykiske lidelser såsom Parkinsons, afhængighed, og skizofreni. Forskellige aspekter af kolinerge neurodegeneration er undersøgt i dyremodeller (f.eks reduktion i acetylcholin5, ChAT protein6, kolinerge fiber neurodegeneration i nærheden af amyloid plaques6, og fald i kolinerge fibre og synaptic varicosities7,8). Fiber degeneration menes at finde sted tidligere end neuronal tab, fordi kolinerge neuronal tab ikke altid observeres i undersøgelser. De fleste af de kolinerge neuroner er i de basale forhjernen og hjernestammen, og deres axoner projekt til forskellige hjerneregioner såsom korticeer og hippocampus. NBM er beliggende i basal forhjernen og viser sig at være en af de almindeligt ramte hjerneområder i AD.
Den fraktioneret metode stereologi er baseret på systematisk stikprøveaf et væv på flere niveauer. Sektionsprøvefraktion (SSF) er den ikke-computerbaserede systematiske prøveudtagning af sektioner til fraktionerets tenologiske metode. Arealprøvetagningsfraktion (ASF) er fraktionering af et område i området af interesse for sektionen. Tykkelse sprøveudtagning fraktion (TSF) er fraktioneringen af tykkelsen af en sektion. Rumkuglesonden giver os mulighed for at kvantificere interesseprofiler i en 3D-kugle på fraktionerede steder. Her bruger vi en rumkuglesonde til estimering af den samlede længde af kolinerge fibre i NBM af musehjernen til at illustrere procedurerne. Den nuværende protokol indeholder oplysninger om vævsbehandling, prøvetagningsmetoder til stereologi, immunhistokemisk farvning ved hjælp af ChAT antistof, og upartisk stereologi til at vurdere kolinerge fiber længde og fibertæthed i NBM af musen shjerne.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ABC kit</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>PK6100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-ChAT Antibody</td>
			<td>Millipore, MA, USA</td>
			<td>AB144P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine anti-goat IgG-B</td>
			<td>Santacruz Biotechnology</td>
			<td>SC-2347</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum, Adult</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>B9433</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Lieca Microsystems, Buffalo Grove, IL, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>D5652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene Glycol</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>324558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>G2025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>H1009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immpact-DAB kit</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>SK4105</td>
			<td>Enhanced DAB peroxidase substrate solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Westward Pharmaceuticals, NJ, USA</td>
			<td>0143-9509-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Lieca Microsystems, Buffalo Grove, IL, USA</td>
			<td>AF6000</td>
			<td>Equipped with motorized stage and IMI-tech color digital camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optimum cutting temperature (O.C.T.) embedding medium</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences, PA, USA</td>
			<td>62550-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permount mounting medium</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences, PA, USA</td>
			<td>17986-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereologer Software</td>
			<td>Stereology Resource Center, Inc. St. Petersburg, FL, USA</td>
			<td>Stereologer2000</td>
			<td>Installed on a Dell Desktop computer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma Base</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>T1503</td>
			<td>Tris base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>T5941</td>
			<td>Tris hydrochloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Bayer, Leverkusen, Germany</td>
			<td>Rompun</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylenes, Histological grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>534056</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stereological estimation of cholinergic fiber length in the nucleus basalis of meynert of the mouse brain

Længden af kolinerge eller andre neuronal axoner i forskellige hjerneregioner er ofte korreleret med den specifikke funktion af regionen. Stereologi er en nyttig metode til at kvantificere neuronale profiler af forskellige hjernestrukturer. Her leverer vi en software-baseret stereologi protokol til at vurdere den samlede længde af kolinerge fibre i kernen basalis af Meynert (NBM) af basal forhjernen. Metoden bruger en rumkuglesonde til længdeestimater. De kolinerge fibre visualiseres ved cholin acetyltransferase (ChAT) immunfarvning med peberrod peroxidase-diaminobenzidin (HRP-DAB) detektionssystem. Farvningsprotokollen gælder også for fiber- og cellenummerestimering i forskellige hjerneområder ved hjælp af stereologisoftware. Stereologi protokollen kan bruges til estimering af eventuelle lineære profiler såsom kolinoceptive fibre, dopaminerge/catecholaminergic fibre, serotonergic fibre, astrocyt processer, eller endda vaskulære profiler.

Repræsentative resultater er vist i tabel 1 og figur 5. Gruppe C, som blev afkodet som ApPswe gruppe (APP), havde betydeligt lavere fiberlængde(Figur 5B)og fiber længdetæthed (Figur 5C) i forhold til deres vilde type (WILD) littermates. Resultaterne viste, at der ikke var nogen signifikant forskel i nbm-mængden mellem de to analyserede grupper (figur 5</str...

Watch this Scientific Journal Video about Stereological Estimation of Cholinergic Fiber Length in the Nucleus Basalis of Meynert of the Mouse Brain at JoVE.com

Stereological Estimation of Cholinergic Fiber Length in the Nucleus Basalis of Meynert of the Mouse Brain

Neuronal fiber længde inden for en tre-dimensionel struktur i en hjerne region er en pålidelig parameter til at kvantificere specifikke neuronal strukturel integritet eller degeneration. Denne artikel beskriver en stereologisk kvantificeringsmetode til måling af kolinerge fiberlængde i meynerts kernebasalis i mus som et eksempel.

Stereologisk vurdering af kolinerge fiberlængde i Nucleus Basalis af Meynert af Mouse Brain

The length of cholinergic or other neuronal axons in various brain regions are often correlated with the specific function of the region. Stereology is a ...

Neurodenegration i mange neurologiske lidelser er en kronisk proces, hvoraf neuronal fiber tab ofte opstår før cellen krop tab. Den stereologiske kvantificering af neuronal fibre i tre dimensioner giver en følsom og præcis metode til påvisning af tidlig neurodegenerative forandringer. Denne teknologi udnytter den pålidelige og effektive computerbaserede upartiske fraktionering af rumkugler til at måle længden af linjelignende strukturer såsom neuronal fibre i 3D.Demonstration af proceduren vil blive udført af Prabhakar Singh, en post-doc og vores ekspert i stereologi, og David Peng, forskningsassistent i mit laboratorium. Efter at have bekræftet manglende reaktion på pedalrefleks i den bedøvede mus, transcardially perfuse med ca 50 milliliter iskold 0,1 molar DPBS, efterfulgt af ca 25 milliliter 4% PFA i 0,1 molar PBS. I slutningen af perfusion, post-fix hjernen i en beholder med frisk 4% PFA i 24 timer ved fire grader Celsius.Den næste dag, vaske hjernen med tre et til to minutters vasker i frisk DPBS per vask og overføre hjernen til en 15% saccharose i 0,1 DPBS løsning natten over. Den næste morgen, placere hjernen i en 30% saccharose opløsning og 0,1 molar DPBS i 48 timer ved fire grader Celsius. I slutningen af inkubationen, overføre hjernen til en kryotomi kammer forudindstillet til minus 20 grader Celsius.Hjerner kan opbevares i forseglede rør og opbevares på minus 80 grader Celsius. Til sektionsskæring skal vævsprøven integreres i det optimale skæretemperatursaflejringsmedium, og prøven monteres på en prøveskive. Derefter erhverve serielle 30 mikrometer tykke sektioner i en koronal plan i kryotomet, overføre hver sektion i individuelle brønde af en 24-brønd kultur plade, der indeholder kryobeskyttende opløsning som forberedelse til minus 20 grader Celsius opbevaring.For at identificere de første og sidste afsnit af hver hjerne, sammenligne de morfologiske funktioner med en standard mus hjerne atlas. NBM begynder ved bregma minus 0,0 millimeter og slutter ved minus 1,6 millimeter. Udvælgelsen af hver ottende sektion giver i alt seks til syv sektioner og giver mulighed for en passende fejlkoefficient for både en volumen og fiber længde estimering.For immunhisemisk mærkning af vævssektionerne skal sektionerne med det primære antistof af interesse mærkes i 48 timer ved fire grader Celsius, når vævssektionerne er blokeret for en uspecifikke binding med 10 % normalt kvægserum i 0,1 %, i Tris-bufferet saltvand. Ved inkubationens afslutning vaskes sektionerne tre gange i tre minutter i frisk Tris-bufferet saltvand pr. vask efterfulgt af inkubation med et passende biotinyleret sekundært antistof i en time ved stuetemperatur. Ved inkubationens afslutning vaskes sektionerne tre gange i frisk tris-bufferet saltvand som påvist, efterfulgt af farvning med Avidin biotinperoxidasekompleks og DAB-peroxidasesubstratopløsning i henhold til fabrikantens protokoller.Efter vask monteres alle sektionerne fra en hjernevævsprøve på et gelatineret dias, og lad prøverne lufttørre. For at dehydrere sektionerne nedsænkes prøverne to gange i fem minutter pr. fortynding i sekventielle opstigende ethanolopløsninger som angivet efterfulgt af rydning med to 10-minutters xylenvask. Brug derefter et passende monteringsmedium til at placere dækslip på objektglassene.For stereologi, åbne en ny undersøgelse i softwaren. Der åbnes en dialogboks for initialisering af undersøgelser. Udfyld undersøgelsesoplysningerne, og bekræft, at der er valgt en brøkbaseret på flere niveauer.Dobbeltklik på lydstyrken for at åbne dialogboksen for lydstyrken. Navnd funktionen af interesse og vælge området punkt tælle sonden og klik næste. Dobbeltklik på længden, og angiv et navn på funktionen.Vælg kuglesonde, og klik derefter. I feltet initialiseringsboks angives det samlede antal sektioner, der starter fra det første afsnit, der indeholder det pågældende område, til det sidste afsnit, der indeholder interesseområdet, og intervallet for udtagning af prøver til otte. Klik ved siden af for at åbne dialogboksen med at initialisere sonden, som automatisk angiver den laveste forstørrelse for områdevalget og volumenestimering og bekræfter indstillingerne.Klik på eksempel for at kontrollere, om det område, der er interesseområde, kan identificeres ved den valgte lavere forstørrelse. Indtast 50.000 mikrometerkube pr. punkt for områdevolumenfraktionen, og klik på eksempel og udført. Under objekt høj forstørrelse, skal du indstille længden til 63X og dobbeltklik længde for at åbne længden kugle dialog boks.Indstil diameteren af denne kugle til 10 mikrometer og klik gjort. Angiv passende værdier for rammeområdet, rammehøjden, beskyttelseszonen og rammeafstanden. Klik derefter på næste gang, og følg vejledningen i softwaren.Hvis du vil indsætte den første sektion, skal du placere diaset på mikroskopets stade under en 5X-målsætning og klikke på den grønne pil for at tegne en vilkårlig grænse omkring NBM for at definere interesseområdet. Klik på den grønne pil og gjort for at ændre 63X målsætningen for at opnå fiber målinger af den aktuelle fraktion. Dialogboksen med sektionstykkelse vises.Indstil sektionens øverste og nederste overflade for at måle sektionens faktiske tykkelse ved hjælp af den manuelle z-aksefokusknap, og klik på udført. Flyt langsomt z-aksen fra top til bund i rammens højde for sektionen for at markere alle de krydsende fibre på overfladen af den virtuelle kuglesonde. Når alle fibrene er markeret, skal du klikke ved siden af for at gå videre til næste placering.Når alle brøker er fuldført, skal du klikke på den grønne pil. Softwaren vil bede om at få det næste afsnit indsat. Bring den næste prøve på diaset i fokus ved hjælp af 5X objektivet og gentag fibermålingen som netop påvist.Når alle sektionerne er blevet målt, genererer softwaren et resultat for sagen, der viser fejlværdierne. Hvis fejlkoefficienten er acceptabel, skal du gå videre til næste sag. Hvis fejlkoefficienten ikke er acceptabel, vil softwaren give anbefalinger til at ændre nogle af parametrene.Når alle sagerne er fuldført, skal der genereres resultater for hver sag og gruppe. I dette repræsentative eksperiment viste den svenske mutant beta amyloid precursor proteingruppe en betydeligt lavere fiberlængde og fiberlængdetæthed sammenlignet med deres vilde kattegrussere. Resultaterne viste også, at der ikke var nogen signifikant forskel i mængden af NBM mellem de to analyserede grupper.Denne teknik kræver korrekt erhvervelse i den korrekte orientering og en god farvning metode med inkubationstiden. Den stereologi protokol kan bruges til estimering af eventuelle lineære profiler såsom andre neuronal fibre, astrocyt processer, eller endda vaskulære profiler.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

Live-Imaging mitosens i udviklingslandene mus embryonale Cortex

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol (TRAP) Assay

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol TRAP Assay

Telomeraseaktivitet i de forskellige regioner i Mouse Brain: Ikke-radioaktivt Telomerase Gentag Amplifikationsprotokol (TRAP) Indhold

Telomerase, a ribonucleoprotein, is responsible for maintaining the telomere length and therefore promoting genomic integrity, proliferation, and ...

Analysis of Gene Expression Changes in the Rat Hippocampus After Deep Brain Stimulation of the Anterior Thalamic Nucleus

Analyse af genekspression Ændringer i rottehippocampus Efter Deep Brain Stimulation af den forreste thalamiske Nucleus

Deep brain stimulation (DBS) surgery, targeting various regions of the brain such as the basal ganglia, thalamus, and subthalamic regions, is an effective ...

Stereotaxic Infusion of Oligomeric Amyloid-beta into the Mouse Hippocampus

Stereotaktisk Infusion af Oligomert amyloid-beta i musen Hippocampus

Alzheimer&#8217;s disease is a neurodegenerative disease affecting the aging population. A key neuropathological feature of the disease is the ...

Live Imaging of the Ependymal Cilia in the Lateral Ventricles of the Mouse Brain

Live-Imaging af ependymale Cilia i laterale ventrikler af Mouse Brain

Multiciliated ependymal cells line the ventricles in the adult brain. Abnormal function or structure of ependymal cilia is associated with various ...

Microelectrode Guided Implantation of Electrodes into the Subthalamic Nucleus of Rats for Long-term Deep Brain Stimulation

Mikroelektrode Guidet Implantation af elektroder ind i nucleus subthalamicus af rotter for Langsigtet Deep Brain Stimulation

Deep brain stimulation (DBS) is a widely used and effective therapy for several neurologic disorders, such as idiopathic Parkinson&#8217;s disease, ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Optagelse synaptisk plasticitet i akut hippocampus skiver vedligeholdes i en lille-volumen genanvendelse - Perfusion- og neddykning-type kammer System

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

Stereological Estimation of Dopaminergic Neuron Number in the Mouse Substantia Nigra Using the Optical Fractionator and Standard Microscopy Equipment

Stereological vurdering af dopaminerge Neuron antallet i mus Substantia Nigra ved hjælp af optisk fraktioneringskolonne og Standard mikroskopi udstyr

In pre-clinical Parkinson&#39;s disease research, analysis of the nigrostriatal tract, including quantification of dopaminergic neuron loss within the ...