Name: stereological estimation of cholinergic fiber length in the nucleus basalis of meynert of the mouse brain
Uploaded: 2020-02-05T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Stereological Estimation of Cholinergic Fiber Length in the Nucleus Basalis of Meynert of the Mouse Brain at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door subsidies aan W.Z.S. van de Medical Research and Development Service, Department of Veterans Affairs (Merit Review 1I01 BX001067-01A2), de Alzheimer Association (NPSPAD-11-202149), en bronnen uit de Midwest Biomedical Stichting Onderzoek.

Alle procedures voor het gebruik van deze dieren zijn goedgekeurd door de Kansas City Veterans Affairs Medical Center Institutional Animal Care and Use Committee. Achttien maanden oude muizen overexpressing Zweedse mutant beta-amyloïde voorloper eiwit (APPswe) en hun C57/BL6 WT nestmates werden gebruikt voor de experimenten. Details van de fokkerij en genotyping wordt gegeven in He et al.8.
1. Perfusie en weefselverwerking
<ol><li>Verdovende muizen met behulp van een...

<ol>
	<li>Mouton, P. R., Gokhale, A. M., Ward, N. L., West, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereological+length+estimation+using+spherical+probes.">Stereological length estimation using spherical probes.</a> Journal of Microscopy. 206, 54-64 (2002).</li><li>Whitehouse, P. J., Price, D. L., Clark, A. W., Long Coyle, J. T., DeLong, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alzheimer+disease:+evidence+for+selective+loss+of+cholinergic+neurons+in+the+nucleus+basalis.">Alzheimer disease: evidence for selective loss of cholinergic neurons in the nucleus basalis.</a> Annals of Neurology. 10 (2), 122-126 (1981).</li><li>Davies, P., Maloney, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+loss+of+central+cholinergic+neurons+in+Alzheimer's+disease.">Selective loss of central cholinergic neurons in Alzheimer's disease.</a> The Lancet. 2 (8000), 1403 (1976).</li><li>Bartus, R. T., Dean, R. L., Beer, B., Lippa, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cholinergic+hypothesis+of+geriatric+memory+dysfunction.">The cholinergic hypothesis of geriatric memory dysfunction.</a> Science. 217 (4558), 408-414 (1982).</li><li>Savonenko, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Episodic-like+memory+deficits+in+the+APPswe/PS1dE9+mouse+model+of+Alzheimer's+disease:+relationships+to+beta-amyloid+deposition+and+neurotransmitter+abnormalities.">Episodic-like memory deficits in the APPswe/PS1dE9 mouse model of Alzheimer's disease: relationships to beta-amyloid deposition and neurotransmitter abnormalities.</a> Neurobiology of Disease. 18 (3), 602-617 (2005).</li><li>Perez, S. E., Dar, S., Ikonomovic, M. D., DeKosky, S. T., Mufson, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholinergic+forebrain+degeneration+in+the+APPswe/PS1DeltaE9+transgenic+mouse.">Cholinergic forebrain degeneration in the APPswe/PS1DeltaE9 transgenic mouse.</a> Neurobiology of Disease. 28 (1), 3-15 (2007).</li><li>Stokin, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonopathy+and+transport+deficits+early+in+the+pathogenesis+of+Alzheimer's+disease.">Axonopathy and transport deficits early in the pathogenesis of Alzheimer's disease.</a> Science. 307 (5713), 1282-1288 (2005).</li><li>He, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GRK5+Deficiency+Leads+to+Selective+Basal+Forebrain+Cholinergic+Neuronal+Vulnerability.">GRK5 Deficiency Leads to Selective Basal Forebrain Cholinergic Neuronal Vulnerability.</a> Scientific Reports. 6, 26116 (2016).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lab+Animal+Research.+Anesthesia+Induction+and+Maintenance.">Lab Animal Research. Anesthesia Induction and Maintenance.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2019).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents.">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).</li><li>Mouton, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Unbiased Stereology-A Concise Guide. , (2011).</li><li>West, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+started+in+stereology.">Getting started in stereology.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2013 (4), 287-297 (2013).</li><li>West, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Space+Balls+Revisited:+Stereological+Estimates+of+Length+With+Virtual+Isotropic+Surface+Probes.">Space Balls Revisited: Stereological Estimates of Length With Virtual Isotropic Surface Probes.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 12, 49 (2018).</li><li>Nikolajsen, G. N., Kotynski, K. A., Jensen, M. S., West, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+the+capillary+network+of+aged+APPswe/PS1dE9+transgenic+mice.">Quantitative analysis of the capillary network of aged APPswe/PS1dE9 transgenic mice.</a> Neurobiology of Aging. 36 (11), 2954-2962 (2015).</li><li>Gutierrez-Jimenez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disturbances+in+the+control+of+capillary+flow+in+an+aged+APP(swe)/PS1DeltaE9+model+of+Alzheimer's+disease.">Disturbances in the control of capillary flow in an aged APP(swe)/PS1DeltaE9 model of Alzheimer's disease.</a> Neurobiology of Aging. 62, 82-94 (2018).</li><li>Gundersen, H. J., Jensen, E. B., Kieu, K., Nielsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+efficiency+of+systematic+sampling+in+stereology--reconsidered.">The efficiency of systematic sampling in stereology--reconsidered.</a> Journal of Microscopy. 193, 199-211 (1999).</li><li>Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+study+of+the+capillaries+within+the+white+matter+of+the+Tg2576+mouse+model+of+Alzheimer's+disease.">Quantitative study of the capillaries within the white matter of the Tg2576 mouse model of Alzheimer's disease.</a> Brain and Behavior. 9 (4), 01268 (2019).</li><li>McNeal, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unbiased+Stereological+Analysis+of+Reactive+Astrogliosis+to+Estimate+Age-Associated+Cerebral+White+Matter+Injury.">Unbiased Stereological Analysis of Reactive Astrogliosis to Estimate Age-Associated Cerebral White Matter Injury.</a> Journal of Neuropathology Experimental Neurology. 75 (6), 539-554 (2016).</li><li>Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Passive+(amyloid-beta)+immunotherapy+attenuates+monoaminergic+axonal+degeneration+in+the+AbetaPPswe/PS1dE9+mice.">Passive (amyloid-beta) immunotherapy attenuates monoaminergic axonal degeneration in the AbetaPPswe/PS1dE9 mice.</a> Journal of Alzheimer's Disease. 23 (2), 271-279 (2011).</li><li>Gagnon, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+Sprouting+of+Dopamine+and+Serotonin+Axons+in+the+Pallidum+of+Parkinsonian+Monkeys.">Evidence for Sprouting of Dopamine and Serotonin Axons in the Pallidum of Parkinsonian Monkeys.</a> Frontiers of Neuroanatomy. 12, 38 (2018).</li><li>Boncristiano, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholinergic+changes+in+the+APP23+transgenic+mouse+model+of+cerebral+amyloidosis.">Cholinergic changes in the APP23 transgenic mouse model of cerebral amyloidosis.</a> Journal of Neuroscience. 22 (8), 3234-3243 (2002).</li></ol>

Hier demonstreren we een methode om de dichtheid van cholinerge vezels in de NBM te schatten met behulp van een ruimtebal (bol) sonde. Deze sonde schat de totale vezellengte in het gebied van belang. De totale lengte kan worden gedeeld door het volume van de regio om de vezeldichtheid te krijgen. Om het volume van de regio te schatten, werd de Methode van het puntentellingsaantal Cavalieri gebruikt. De Cavalieri-punttellingsmethode is een onpartijdige en efficiënte schatter van een 3D-referentievolume voor elke regio. D...

Kwantitatieve schattingen van lengte en/of dichtheid van zenuwvezels in de hersenen zijn belangrijke parameters van neuropathologische studies. De lengte van cholinerge, dopaminerge, en serotonergic axonen in verschillende hersengebieden zijn vaak gecorreleerd met de specifieke functies van de regio. Omdat de verdeling van deze axonen over het algemeen heterogeen is, wordt op het ontwerp gebaseerde stereologie gebruikt om bias tijdens de bemonstering te voorkomen. De ruimtesonde van stereologie is ontworpen om efficiënte en betrouwbare maatregelen van lijn-achtige structuren zoals neuronale vezels in een regio van belang1. De sonde maakt een virtuele bol die systematisch in het weefsel wordt opgelegd om lijnkruisingen met het oppervlak van de sonde te meten. Omdat het onmogelijk is om bolsondes in het weefsel te plaatsen voor analyse, biedt de commercieel beschikbare software een virtuele driedimensionale (3D) bol, wat in feite een reeks concentrische cirkels is van verschillende diameters die het oppervlak van de bolsonde vertegenwoordigen.
Selectieve cholinerge neurodegeneratie is een van de consistente kenmerken van de ziekte van Alzheimer (AD)2,3,4. Disfunctionele cholinerge transmissie wordt beschouwd als een oorzakelijke factor voor cognitieve achteruitgang in AD. Cholinerge disfunctie is ook duidelijk in vele andere psychische stoornissen zoals Parkinson, verslaving, en schizofrenie. Verschillende aspecten van cholinerge neurodegeneratie worden bestudeerd in diermodellen (bijvoorbeeld, vermindering van acetylcholine5, ChAT eiwit6, cholinerge vezel neurodegeneratie in de buurt van amyloïde plaques6, en afname van cholinerge vezels en synaptische spataderen7,8). Vezeldegeneratie wordt verondersteld plaats te vinden eerder dan neuronale verlies, omdat cholinerge neuronale verlies niet altijd wordt waargenomen in studies. De meeste cholinerge neuronen zijn in de basale voorhersenen en de hersenstam, en hun axonen project naar verschillende hersengebieden zoals de cortices en hippocampus. NBM is gelegen in de basale voorhersenen en bleek een van de meest getroffen hersengebieden in AD.
De fractionatormethode van stereologie is gebaseerd op systematische willekeurige bemonstering van een weefsel op meerdere niveaus. Sectiebemonsteringsfractie (SSF) is de niet-computergebaseerde systematische bemonstering van secties voor de fractionatormethode van stereologie. De zonebemonsteringsfractie (AF) is een breuk van een gebied in de regio van belang in de sectie. Dikte bemonstering sfractie (TSF) is de fractionatie van de dikte van een sectie. De ruimtesonde stelt ons in staat om profielen van belang in een 3D-bol te kwantificeren op gefractioneerde locaties. Hier gebruiken we een ruimtesonde voor de schatting van de totale lengte van cholinerge vezels in de NBM van muishersenen om de procedures te illustreren. Het huidige protocol bevat details over weefselverwerking, bemonsteringsmethoden voor stereologie, immunohistochemische kleuring met behulp van het ChAT-antilichaam en onbevooroordeelde stereologie om cholinerge vezellengte en vezeldichtheid in de NBM van de muishersenen te schatten.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ABC kit</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>PK6100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-ChAT Antibody</td>
			<td>Millipore, MA, USA</td>
			<td>AB144P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine anti-goat IgG-B</td>
			<td>Santacruz Biotechnology</td>
			<td>SC-2347</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum, Adult</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>B9433</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Lieca Microsystems, Buffalo Grove, IL, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>D5652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene Glycol</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>324558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>G2025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>H1009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immpact-DAB kit</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>SK4105</td>
			<td>Enhanced DAB peroxidase substrate solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Westward Pharmaceuticals, NJ, USA</td>
			<td>0143-9509-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Lieca Microsystems, Buffalo Grove, IL, USA</td>
			<td>AF6000</td>
			<td>Equipped with motorized stage and IMI-tech color digital camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optimum cutting temperature (O.C.T.) embedding medium</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences, PA, USA</td>
			<td>62550-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permount mounting medium</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences, PA, USA</td>
			<td>17986-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereologer Software</td>
			<td>Stereology Resource Center, Inc. St. Petersburg, FL, USA</td>
			<td>Stereologer2000</td>
			<td>Installed on a Dell Desktop computer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma Base</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>T1503</td>
			<td>Tris base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>T5941</td>
			<td>Tris hydrochloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Bayer, Leverkusen, Germany</td>
			<td>Rompun</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylenes, Histological grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>534056</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stereological estimation of cholinergic fiber length in the nucleus basalis of meynert of the mouse brain

De lengte van cholinerge of andere neuronale axonen in verschillende hersengebieden zijn vaak gecorreleerd met de specifieke functie van de regio. Stereologie is een nuttige methode om neuronale profielen van verschillende hersenstructuren te kwantificeren. Hier bieden we een software-gebaseerde stereologie protocol om de totale lengte van cholinerge vezels in de kern basalis van Meynert (NBM) van de basale voorhersenen schatten. De methode maakt gebruik van een ruimtesonde voor lengteschattingen. De cholinerge vezels worden gevisualiseerd door choline acetyltransferase (ChAT) immunostaining met de mierikswortel peroxidase-diaminobenzidine (HRP-DAB) detectiesysteem. Het kleuringsprotocol is ook geldig voor vezel- en celnummerschatting in verschillende hersengebieden met behulp van stereologiesoftware. Het stereologieprotocol kan worden gebruikt voor de schatting van lineaire profielen zoals cholinoceptieve vezels, dopaminerge/catecholaminere vezels, serotonergic vezels, astrocyteprocessen of zelfs vasculaire profielen.

Representatieve resultaten worden weergegeven in tabel 1 en figuur 5. Groep C, dat werd gedecodeerd als APPswe group (APP), had een aanzienlijk lagere vezellengte (figuur 5B) en vezellengtedichtheid(figuur 5C)in vergelijking met hun wilde type (WILD) nestmaatjes. Uit de resultaten bleek dat er geen significant verschil was in het volume van de NBM tussen de twee geanalyseerde groepe...

Watch this Scientific Journal Video about Stereological Estimation of Cholinergic Fiber Length in the Nucleus Basalis of Meynert of the Mouse Brain at JoVE.com

Stereological Estimation of Cholinergic Fiber Length in the Nucleus Basalis of Meynert of the Mouse Brain

Neuronale vezel lengte binnen een driedimensionale structuur van een hersengebied is een betrouwbare parameter om specifieke neuronale structurele integriteit of degeneratie te kwantificeren. Dit artikel beschrijft een stereologische kwantificeringsmethode om cholinerge vezellengte binnen de kernbasisvan Meynert bij muizen als voorbeeld te meten.

Stereologische schatting van cholinerge vezel lengte in de kern Basalis van Meynert van de muis hersenen

The length of cholinergic or other neuronal axons in various brain regions are often correlated with the specific function of the region. Stereology is a ...

Neurodenegratie bij veel neurologische aandoeningen is een chronisch proces waarvan neuronale vezelverlies vaak optreedt voorafgaand aan het verlies van het cellichaam. De stereologische kwantificering van neuronale vezels in drie dimensies biedt een gevoelige en nauwkeurige methode voor het detecteren van vroege neurodegeneratieve verandering. Deze technologie maakt gebruik van de betrouwbare en efficiënte computer-gebaseerde onpartijdige fractionatie van de ruimte ballen om de lengtes van lijn-achtige structuren zoals neuronale vezels in 3D te meten.Het aantonen van de procedure zal worden gedaan door Prabhakar Singh, een post-doc en onze expert in stereologie, en David Peng, de onderzoeksassistent in mijn lab. Na bevestiging van een gebrek aan reactie op pedaalreflex in de verdoofde muis, transcardially doornemen met ongeveer 50 milliliter ijskoud 0,1 molaire DPBS, gevolgd door ongeveer 25 milliliter van 4%PFA in 0,1 molaire PBS. Aan het einde van de perfusie, post-fix de hersenen in een container van verse 4%PFA gedurende 24 uur op vier graden Celsius.De volgende dag, was de hersenen met drie een tot twee minuten wast in verse DPBS per wasbeurt en breng de hersenen in een 15% sacharose in 0,1 DPBS oplossing 's nachts. De volgende ochtend, plaats de hersenen in een 30% sacharose oplossing en 0,1 molaire DPBS voor 48 uur op vier graden Celsius. Breng aan het einde van de incubatie de hersenen over naar een cryotomekamer die vooraf is ingesteld op min 20 graden Celsius.Hersenen kunnen worden bewaard in verzegelde buizen en opgeslagen bij min 80 graden Celsius. Voor de doorsnede, insluiten van het weefsel monster in een optimale snijtemperatuur inbedding medium en monteer het monster op een monster schijf. Dan verwerven seriële 30 micrometer dikke secties in een coronale vlak in de cryotoom, de overdracht van elke sectie in individuele putten van een 24-well cultuur plaat met cryoprotectant oplossing ter voorbereiding van min 20 graden Celsius opslag.Om de eerste en laatste delen van elk brein te identificeren, vergelijkt u de morfologische kenmerken met een standaard muishersenenatlas. NBM begint bij bregma minus 0,0 millimeter en eindigt bij min 1,6 millimeter. De selectie van elke achtste sectie levert in totaal zes tot zeven secties op en maakt een passende foutcoëfficiënt mogelijk voor zowel een schatting van de volume- als de vezellengte.Voor immunohistochemische etikettering van de weefselsecties, na het blokkeren van een niet-specifieke binding met 10%normaal runderserum in 0,1%Triton X-100 in tris-gebufferde zoutoplossing, etiketteren de secties met het primaire antilichaam van belang gedurende 48 uur bij vier graden Celsius. Aan het einde van de incubatie was je de secties drie maal drie minuten in verse Tris-gebufferde zoutoplossing per wasbeurt, gevolgd door incubatie met een passend biotinylated secundair antilichaam gedurende een uur bij kamertemperatuur. Aan het einde van de incubatie, was de secties drie keer in verse Tris-gebufferde zoutoplossing zoals aangetoond, gevolgd door vlekken met Avidin biotine peroxidase complex en DAB peroxidase substraat oplossing volgens de protocollen van de fabrikant.Na het wassen, monteer alle secties van een hersenweefsel monster op een gelatineiseerde dia en laat de monsters aan de lucht drogen. Om de secties te dehydrateren, dompel de monsters twee keer gedurende vijf minuten per verdunning onder in sequentiële opgaande ethanoloplossingen zoals aangegeven, gevolgd door clearing met twee xyleenwasbeurten van 10 minuten. Gebruik vervolgens een geschikt montagemedium om coverslips op de dia's te plaatsen.Open voor stereologie een nieuwe studie in de software. Er wordt een studieinitialiseringsdialoogbox geopend. Vul de studie-informatie in en bevestig dat er op meerdere niveaus fractiegebaseerde gegevens zijn geselecteerd.Dubbelklik op volume om het volumedialoogvak te openen. Geef de functie van belang een naam en selecteer de gebiedspunttellingssonde en klik vervolgens. Dubbelklik op de lengte en geef een naam van de functie op.Selecteer de bollensonde en klik vervolgens. In het vak caseinitialisatie, om de groepen te coderen voordat u met de studie begint, stelt u het totale aantal secties in dat begint vanaf het eerste gedeelte met het interessegebied tot het laatste gedeelte met het interessegebied en het sectiebemonsteringsinterval op acht. Klik naast om het dialoogvenster initialisatiedialoog van de sonde te openen, waarin automatisch de laagste vergroting voor de gebiedsselectie en volumeschatting wordt ingesteld en de instellingen wordt bevestigd.Klik op voorbeeld om te controleren of het interessegebied kan worden geïdentificeerd bij de geselecteerde lagere vergroting. Voer 50,000 micrometerkubus per punt in voor de regiovolumefractie en klik op voorbeeld en gedaan. Stel onder object hoge vergroting de lengte in op 63x en dubbelkliklengte om het vak met de lengteboldialoog te openen.Stel de diameter van deze bol in op 10 micrometer en klik op gedaan. Stel de juiste waarden in voor het framegebied, de framehoogte, de beveiligingszone en de frameafstand. Klik vervolgens op de volgende en volg de instructies van de software.Als u het eerste gedeelte wilt invoegen, plaatst u de dia op het stadium van de microscoop onder een doelstelling van 5X en klikt u op de groene pijl om een willekeurige grens rond de NBM te tekenen om het interessegebied te definiëren. Klik op de groene pijl en gedaan om de 63X doelstelling te wijzigen om de vezelmetingen van de huidige fractie te verkrijgen. De sectie dikte dialoog doos zal verschijnen.Stel het boven- en onderkant van de sectie in om de werkelijke dikte van de sectie te meten met behulp van de handmatige z-as focusknop en klik op gereed. Verplaats de z-as langzaam van boven naar beneden in de framehoogte van de sectie om alle kruisende vezels op het oppervlak van de virtuele bolsonde te markeren. Wanneer alle vezels zijn gemarkeerd, klikt u naast om door te gaan naar de volgende locatie.Wanneer alle breuken zijn voltooid, klikt u op de groene pijl. De software zal vragen om de volgende sectie ingevoegd. Breng het volgende monster op de dia in beeld met behulp van de 5X doelstelling en herhaal de vezel meting zoals net aangetoond.Wanneer alle secties zijn gemeten, genereert de software een resultaat voor de case met de foutcoëfficiënt. Als de foutcoëfficiënt aanvaardbaar is, gaat u naar het volgende geval. Als de foutcoëfficiënt niet aanvaardbaar is, zal de software aanbevelingen doen om een aantal parameters te wijzigen.Wanneer alle aanvragen zijn voltooid, genereert u resultaten voor elk geval en elke groep. In dit representatieve experiment, de Zweedse mutant beta amyloïde precursor eiwit groep toonde een aanzienlijk lagere vezel lengte en vezel lengte dichtheid in vergelijking met hun wild-type nest stuurlieden. De resultaten toonden ook aan dat er geen significant verschil in het volume van de NBM tussen de twee geanalyseerde groepen.Deze techniek vereist de juiste verwerving in de juiste oriëntatie en een goede kleuringsmethode met de incubatietijd. Het stereologieprotocol kan worden gebruikt voor de schatting van lineaire profielen zoals andere neuronale vezels, astrocytenprocessen of zelfs vasculaire profielen.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

Live-Imaging van mitose in het ontwikkelen van muis embryonale Cortex

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol (TRAP) Assay

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol TRAP Assay

Telomerase activiteit in de verschillende regio&#39;s van de hersenen van muizen: Non-Radioactive Telomerase Herhaal Amplification Protocol (TRAP) Assay

Telomerase, a ribonucleoprotein, is responsible for maintaining the telomere length and therefore promoting genomic integrity, proliferation, and ...

Analysis of Gene Expression Changes in the Rat Hippocampus After Deep Brain Stimulation of the Anterior Thalamic Nucleus

Analyse van genexpressie Veranderingen in het Rat Hippocampus Na Deep Brain Stimulation van de Anterior Thalamic Nucleus

Deep brain stimulation (DBS) surgery, targeting various regions of the brain such as the basal ganglia, thalamus, and subthalamic regions, is an effective ...

Stereotaxic Infusion of Oligomeric Amyloid-beta into the Mouse Hippocampus

Stereotaxische Infusion van Oligomere amyloid-beta in de Mouse Hippocampus

Alzheimer&#8217;s disease is a neurodegenerative disease affecting the aging population. A key neuropathological feature of the disease is the ...

Live Imaging of the Ependymal Cilia in the Lateral Ventricles of the Mouse Brain

Live-Imaging van de Ependymale Cilia in de laterale ventrikels van de hersenen van muizen

Multiciliated ependymal cells line the ventricles in the adult brain. Abnormal function or structure of ependymal cilia is associated with various ...

Microelectrode Guided Implantation of Electrodes into the Subthalamic Nucleus of Rats for Long-term Deep Brain Stimulation

Micro-elektrode Begeleide Implantatie van elektroden in de nucleus subthalamicus van Rats naar Lange termijn Deep Brain Stimulation

Deep brain stimulation (DBS) is a widely used and effective therapy for several neurologic disorders, such as idiopathic Parkinson&#8217;s disease, ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Synaptische plasticiteit opnemen in Acute Hippocampal plakjes onderhouden in een kleine volumes Recycling-, perfusie-, en onderdompeling-type kamer systeem

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

Stereological Estimation of Dopaminergic Neuron Number in the Mouse Substantia Nigra Using the Optical Fractionator and Standard Microscopy Equipment

Stereological raming van de Dopaminerge Neuron nummer in de muis Substantia Nigra met behulp van de optische Fractionator en standaard microscopie apparatuur

In pre-clinical Parkinson&#39;s disease research, analysis of the nigrostriatal tract, including quantification of dopaminergic neuron loss within the ...