Name: stereological estimation of cholinergic fiber length in the nucleus basalis of meynert of the mouse brain
Uploaded: 2020-02-05T12:00:00
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Ce travail a été appuyé par des subventions accordées à W.Z.S. par le Service de recherche et de développement médicaux, le ministère des Anciens Combattants (Examen du mérite 1I01 BX001067-01A2), l'Alzheimer's Association (NPSPAD-11-202149) et des ressources de la Midwest Biomedical Fondation de recherche.

Toutes les procédures d'utilisation de ces animaux ont été approuvées par le Kansas City Veterans Affairs Medical Center Institutional Animal Care and Use Committee. Des souris de dix-huit mois surexprimant la protéine bêta-amyloïde mutante suédoise (APPswe) et leurs compagnons de litière C57/BL6 WT ont été utilisés pour les expériences. Les détails de l'élevage et du génotypage sont donnés dans He et coll.8.
1. Perfusion et traitement des tissus
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	<li>Mouton, P. R., Gokhale, A. M., Ward, N. L., West, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereological+length+estimation+using+spherical+probes.">Stereological length estimation using spherical probes.</a> Journal of Microscopy. 206, 54-64 (2002).</li><li>Whitehouse, P. J., Price, D. L., Clark, A. W., Long Coyle, J. T., DeLong, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alzheimer+disease:+evidence+for+selective+loss+of+cholinergic+neurons+in+the+nucleus+basalis.">Alzheimer disease: evidence for selective loss of cholinergic neurons in the nucleus basalis.</a> Annals of Neurology. 10 (2), 122-126 (1981).</li><li>Davies, P., Maloney, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+loss+of+central+cholinergic+neurons+in+Alzheimer's+disease.">Selective loss of central cholinergic neurons in Alzheimer's disease.</a> The Lancet. 2 (8000), 1403 (1976).</li><li>Bartus, R. T., Dean, R. L., Beer, B., Lippa, A. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholinergic+forebrain+degeneration+in+the+APPswe/PS1DeltaE9+transgenic+mouse.">Cholinergic forebrain degeneration in the APPswe/PS1DeltaE9 transgenic mouse.</a> Neurobiology of Disease. 28 (1), 3-15 (2007).</li><li>Stokin, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonopathy+and+transport+deficits+early+in+the+pathogenesis+of+Alzheimer's+disease.">Axonopathy and transport deficits early in the pathogenesis of Alzheimer's disease.</a> Science. 307 (5713), 1282-1288 (2005).</li><li>He, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GRK5+Deficiency+Leads+to+Selective+Basal+Forebrain+Cholinergic+Neuronal+Vulnerability.">GRK5 Deficiency Leads to Selective Basal Forebrain Cholinergic Neuronal Vulnerability.</a> Scientific Reports. 6, 26116 (2016).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lab+Animal+Research.+Anesthesia+Induction+and+Maintenance.">Lab Animal Research. Anesthesia Induction and Maintenance.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2019).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents.">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).</li><li>Mouton, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Unbiased Stereology-A Concise Guide. , (2011).</li><li>West, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+started+in+stereology.">Getting started in stereology.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2013 (4), 287-297 (2013).</li><li>West, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Space+Balls+Revisited:+Stereological+Estimates+of+Length+With+Virtual+Isotropic+Surface+Probes.">Space Balls Revisited: Stereological Estimates of Length With Virtual Isotropic Surface Probes.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 12, 49 (2018).</li><li>Nikolajsen, G. N., Kotynski, K. A., Jensen, M. S., West, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+the+capillary+network+of+aged+APPswe/PS1dE9+transgenic+mice.">Quantitative analysis of the capillary network of aged APPswe/PS1dE9 transgenic mice.</a> Neurobiology of Aging. 36 (11), 2954-2962 (2015).</li><li>Gutierrez-Jimenez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disturbances+in+the+control+of+capillary+flow+in+an+aged+APP(swe)/PS1DeltaE9+model+of+Alzheimer's+disease.">Disturbances in the control of capillary flow in an aged APP(swe)/PS1DeltaE9 model of Alzheimer's disease.</a> Neurobiology of Aging. 62, 82-94 (2018).</li><li>Gundersen, H. J., Jensen, E. B., Kieu, K., Nielsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+efficiency+of+systematic+sampling+in+stereology--reconsidered.">The efficiency of systematic sampling in stereology--reconsidered.</a> Journal of Microscopy. 193, 199-211 (1999).</li><li>Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+study+of+the+capillaries+within+the+white+matter+of+the+Tg2576+mouse+model+of+Alzheimer's+disease.">Quantitative study of the capillaries within the white matter of the Tg2576 mouse model of Alzheimer's disease.</a> Brain and Behavior. 9 (4), 01268 (2019).</li><li>McNeal, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unbiased+Stereological+Analysis+of+Reactive+Astrogliosis+to+Estimate+Age-Associated+Cerebral+White+Matter+Injury.">Unbiased Stereological Analysis of Reactive Astrogliosis to Estimate Age-Associated Cerebral White Matter Injury.</a> Journal of Neuropathology Experimental Neurology. 75 (6), 539-554 (2016).</li><li>Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Passive+(amyloid-beta)+immunotherapy+attenuates+monoaminergic+axonal+degeneration+in+the+AbetaPPswe/PS1dE9+mice.">Passive (amyloid-beta) immunotherapy attenuates monoaminergic axonal degeneration in the AbetaPPswe/PS1dE9 mice.</a> Journal of Alzheimer's Disease. 23 (2), 271-279 (2011).</li><li>Gagnon, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+Sprouting+of+Dopamine+and+Serotonin+Axons+in+the+Pallidum+of+Parkinsonian+Monkeys.">Evidence for Sprouting of Dopamine and Serotonin Axons in the Pallidum of Parkinsonian Monkeys.</a> Frontiers of Neuroanatomy. 12, 38 (2018).</li><li>Boncristiano, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholinergic+changes+in+the+APP23+transgenic+mouse+model+of+cerebral+amyloidosis.">Cholinergic changes in the APP23 transgenic mouse model of cerebral amyloidosis.</a> Journal of Neuroscience. 22 (8), 3234-3243 (2002).</li></ol>

Ici, nous démontrons une méthode pour estimer la densité des fibres cholinergiques dans le NBM à l'aide d'une boule spatiale (sphère) sonde. Cette sonde estime la longueur totale de la fibre dans la région d'intérêt. La longueur totale peut être divisée par le volume de la région pour obtenir la densité de fibre. Pour estimer le volume de la région, la méthode de comptage des points Cavalieri a été utilisée. La méthode de comptage des points Cavalieri est un estimateur impartial et efficace d'un volume ...

Les estimations quantitatives de la longueur et/ou de la densité des fibres nerveuses dans le cerveau sont des paramètres importants des études neuropathologiques. La longueur des axones cholinergiques, dopaminergiques et sérotoninergiques dans diverses régions de cerveau sont souvent corrélées avec les fonctions spécifiques de la région. Étant donné que la distribution de ces axones est généralement hétérogène, la stéologie basée sur la conception est utilisée pour éviter les biais lors de l'échantillonnage. La sonde de boule d'espace de la stéréologie a été conçue pour fournir des mesures efficaces et fiables des structures de ligne-comme telles que les fibres neuronales dans une région d'intérêt1. La sonde fait une sphère virtuelle qui est imposée systématiquement dans le tissu pour mesurer les intersections de ligne avec la surface de la sonde. Parce qu'il est impossible de mettre des sondes de sphère dans le tissu pour analyse, le logiciel disponible dans le commerce fournit une sphère virtuelle en trois dimensions (3D), qui est essentiellement une série de cercles concentriques de différents diamètres qui représentent la surface de la sonde sphère.
La neurodégénérescence cholinergique sélective est l'une des caractéristiques constantes de la maladie d'Alzheimer (MA)2,3,4. La transmission cholinergique dysfonctionnelle est considérée comme un facteur causal pour le déclin cognitif dans la MA. Le dysfonctionnement cholinergique est également évident dans beaucoup d'autres désordres mentaux tels que Parkinson, dépendance, et schizophrénie. Différents aspects de la neurodégénérescence cholinergique sont étudiés dans les modèles animaux (par exemple, réduction de l'acétylcholine5, protéine ChAT6, neurodégénérescence des fibres cholinergiques à proximité des plaques amyloïdes6, et diminution des fibres cholinergiques et des varicosities synaptiques7,8). On croit que la dégénérescence des fibres a lieu plus tôt que la perte neuronale, parce que la perte neuronale cholinergique n'est pas toujours observée dans les études. La plupart des neurones cholinergiques sont dans le cerveau avant basal et le tronc cérébral, et leurs axones projettent à diverses régions du cerveau telles que les cortices et l'hippocampe. NBM est situé dans le cerveau avant basal et s'est avéré être l'une des zones cérébrales couramment affectées dans la MA.
La méthode fractionnée de la stérilologie est basée sur l'échantillonnage aléatoire systématique d'un tissu à plusieurs niveaux. La fraction d'échantillonnage de section (SSF) est l'échantillonnage systématique non informatisé des sections pour la méthode fractionnée de la stérilisation. La fraction d'échantillonnage de surface (ASF) est la fractionnement d'une zone de la région d'intérêt dans la section. La fraction d'échantillonnage d'épaisseur (TSF) est la fractionnement de l'épaisseur d'une section. La sonde de boules spatiales nous permet de quantifier les profils d'intérêt dans une sphère 3D à des endroits fractionnés. Ici, nous utilisons une sonde de boule d'espace pour l'estimation de la longueur totale des fibres cholinergiques dans le NBM du cerveau de souris pour illustrer les procédures. Le protocole actuel fournit des détails sur le traitement des tissus, les méthodes d'échantillonnage pour la stérilologie, la coloration immunohistochimique à l'aide de l'anticorps ChAT, et la stéréologie impartiale pour estimer la longueur des fibres cholinergiques et la densité des fibres dans le NBM du cerveau de souris.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ABC kit</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>PK6100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-ChAT Antibody</td>
			<td>Millipore, MA, USA</td>
			<td>AB144P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine anti-goat IgG-B</td>
			<td>Santacruz Biotechnology</td>
			<td>SC-2347</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum, Adult</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>B9433</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Lieca Microsystems, Buffalo Grove, IL, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>D5652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene Glycol</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>324558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>G2025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>H1009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immpact-DAB kit</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>SK4105</td>
			<td>Enhanced DAB peroxidase substrate solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Westward Pharmaceuticals, NJ, USA</td>
			<td>0143-9509-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Lieca Microsystems, Buffalo Grove, IL, USA</td>
			<td>AF6000</td>
			<td>Equipped with motorized stage and IMI-tech color digital camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optimum cutting temperature (O.C.T.) embedding medium</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences, PA, USA</td>
			<td>62550-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permount mounting medium</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences, PA, USA</td>
			<td>17986-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereologer Software</td>
			<td>Stereology Resource Center, Inc. St. Petersburg, FL, USA</td>
			<td>Stereologer2000</td>
			<td>Installed on a Dell Desktop computer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma Base</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>T1503</td>
			<td>Tris base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>T5941</td>
			<td>Tris hydrochloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Bayer, Leverkusen, Germany</td>
			<td>Rompun</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylenes, Histological grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>534056</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stereological estimation of cholinergic fiber length in the nucleus basalis of meynert of the mouse brain

La longueur des axones cholinergiques ou autres neurones dans diverses régions du cerveau sont souvent corrélées avec la fonction spécifique de la région. La stéréologie est une méthode utile pour quantifier les profils neuronaux de diverses structures cérébrales. Ici, nous fournissons un protocole de stéréologie basé sur un logiciel pour estimer la longueur totale des fibres cholinergiques dans le noyau basalis de Meynert (NBM) du cerveau avant basal. La méthode utilise une sonde de boule d'espace pour des estimations de longueur. Les fibres cholinergiques sont visualisées par l'immunostaining d'acétyltransferase de choline (ChAT) avec le système de détection de peroxidase-diaminobenzidine de raifort (HRP-DAB). Le protocole de coloration est également valide pour l'estimation des fibres et des numéros de cellules dans diverses régions du cerveau à l'aide d'un logiciel de stéréologie. Le protocole de stéréologie peut être employé pour l'estimation de n'importe quels profils linéaires tels que les fibres cholinoceptives, les fibres dopaminergiques/catécholaminergiques, les fibres sérotonergiques, les processus d'astrocyte, ou même les profils vasculaires.

Les résultats représentatifs sont présentés dans le tableau 1 et la figure 5. Le groupe C, qui a été décodé en tant que groupe APPswe (APP), avait une longueur de fibre significativement inférieure (figure 5B) et la densité de longueur de fibre (figure 5C) par rapport à leurs compagnons de litière de type sauvage (WILD). Les résultats ont montré qu'il n'y avait pas de ...

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Stereological Estimation of Cholinergic Fiber Length in the Nucleus Basalis of Meynert of the Mouse Brain

La longueur de fibre neuronale dans une structure tridimensionnelle d'une région de cerveau est un paramètre fiable pour quantifier l'intégrité structurale neuronale spécifique ou la dégénérescence. Cet article détaille une méthode de quantification stéréologique pour mesurer la longueur de fibre cholinergique dans le basalis de noyau de Meynert chez les souris comme exemple.

Estimation stéréologique de la longueur de la fibre cholinergique dans le noyau Basalis de Meynert du cerveau de souris

The length of cholinergic or other neuronal axons in various brain regions are often correlated with the specific function of the region. Stereology is a ...

La neurodengration dans de nombreux troubles neurologiques est un processus chronique dont la perte de fibres neuronales se produit souvent avant la perte du corps cellulaire. La quantification stéréologique des fibres neuronales en trois dimensions fournit une méthode sensible et précise pour détecter les changements neurodégénératifs précoces. Cette technologie utilise la fractionnement impartial fiable et efficace par ordinateur des boules d’espace pour mesurer les longueurs des structures en forme de ligne telles que les fibres neuronales en 3D.La démonstration de la procédure sera effectuée par Prabhakar Singh, un post-doc et notre expert en stéréologie, et David Peng, l’assistant de recherche dans mon laboratoire. Après avoir confirmé un manque de réponse au réflexe de pédale chez la souris anesthésiée, transcardially perfuser avec environ 50 millilitres de glace froide 0,1 molaire DPBS, suivie d’environ 25 millilitres de 4%PFA dans 0,1 molaire PBS. À la fin de la perfusion, post-fixer le cerveau dans un récipient de frais 4%PFA pendant 24 heures à quatre degrés Celsius.Le lendemain, lavez le cerveau avec trois lavages d’une à deux minutes dans le DPBS frais par lavage et transférez le cerveau dans un saccharose de 15% dans la solution 0.1 DPBS pendant la nuit. Le lendemain matin, placez le cerveau dans une solution de saccharose de 30% et 0,1 DPBS molaire pendant 48 heures à quatre degrés Celsius. À la fin de l’incubation, transférer le cerveau dans une chambre cryotome préédée à moins 20 degrés Celsius.Les cerveaux peuvent être conservés dans des tubes scellés et stockés à moins 80 degrés Celsius. Pour le sectioning, intégriez l’échantillon de tissu dans le milieu optimal d’intégration de température de coupe et montez l’échantillon sur un disque d’échantillon. Ensuite, acquérir des sections épaisses de 30 micromètres en série dans un plan coronal dans le cryotome, en transférant chaque section dans des puits individuels d’une plaque de culture de 24 puits contenant une solution cryoprotectrice en préparation d’un stockage de moins 20 degrés Celsius.Pour identifier les première et dernière sections de chaque cerveau, comparez les caractéristiques morphologiques avec un atlas standard du cerveau de la souris. NBM commence à bregma moins 0,0 millimètres et se termine à moins 1,6 millimètres. La sélection de chaque huitième section donne un total de six à sept sections et permet un coefficient d’erreur approprié pour une estimation du volume et de la longueur de la fibre.Pour l’étiquetage immunohistochimique des sections tissulaires, après avoir bloqué toute liaison non spécifique avec le sérum bovin 10% normal dans 0,1%Triton X-100 dans la solution saline tamponnée par Tris, étiquetez les sections avec l’anticorps primaire d’intérêt pendant 48 heures à quatre degrés Celsius. À la fin de l’incubation, laver les sections trois fois pendant trois minutes dans une solution saline fraîche tamponnée par lavage, suivie de l’incubation avec un anticorps secondaire biotinylé approprié pendant une heure à température ambiante. À la fin de l’incubation, lavez les sections trois fois dans une solution saline fraîche tamponnée par Tris, comme démontré, suivie d’une coloration avec le complexe de peroxydse de biotine Avidin et la solution de substrat de peroxyde DAB selon les protocoles du fabricant.Après le lavage, monter toutes les sections à partir d’un échantillon de tissu cérébral sur une lame gélatincisée et laisser sécher l’air des échantillons. Pour déshydrater les sections, immerger les échantillons deux fois pendant cinq minutes par dilution dans des solutions d’éthanol ascendantes séquentielles comme indiqué, puis déblayer avec deux lavages de xylène de 10 minutes. Utilisez ensuite un support de montage approprié pour placer des coverslips sur les toboggans.Pour la stéréologie, ouvrez une nouvelle étude dans le logiciel. Une boîte de dialogue d’initialisation d’étude s’ouvrira. Remplissez l’information de l’étude et confirmez que la fraction à plusieurs niveaux est sélectionnée.Double-cliquez sur le volume pour ouvrir la boîte de dialogue de volume. Nommez la fonctionnalité d’intérêt et sélectionnez la sonde de comptage des points de la région et cliquez ensuite. Double-cliquez sur la longueur et de fournir un nom de la fonctionnalité.Sélectionnez la sonde de sphère et cliquez ensuite. Dans la case initialisation, pour coder les groupes avant de commencer l’étude, fixez le nombre total de sections à partir de la première section contenant la zone d’intérêt à la dernière section contenant la zone d’intérêt et l’intervalle d’échantillonnage de la section à huit. Cliquez à côté pour ouvrir la boîte de dialogue d’initialisation de la sonde qui définira automatiquement le grossissement le plus bas pour la sélection de la région et l’estimation du volume et confirmera les paramètres.Cliquez sur aperçu pour vérifier si la région d’intérêt peut être identifiée lors du grossissement inférieur sélectionné. Entrez 50 000 micromètres cube par point pour la fraction de volume de la région et cliquez sur aperçu et fait. Sous le grossissement élevé de l’objet, réglez la longueur à 63X et double-cliquez sur la longueur pour ouvrir la boîte de dialogue de sphère de longueur.Réglez le diamètre de cette sphère à 10 micromètres et cliquez dessus. Définissez les valeurs appropriées pour la zone du cadre, la hauteur du cadre, la zone de garde et l’espacement du cadre. Cliquez ensuite et suivez les instructions fournies par le logiciel.Pour insérer la première section, placez la diapositive sur la scène du microscope sous un objectif 5X et cliquez sur la flèche verte pour tracer une limite arbitraire autour de la NBM pour définir la région d’intérêt. Cliquez sur la flèche verte et fait pour changer l’objectif 63X pour obtenir les mesures de fibre de la fraction actuelle. La boîte de dialogue d’épaisseur de section apparaîtra.Réglez la surface supérieure et inférieure de la section pour mesurer l’épaisseur réelle de la section à l’aide du bouton de mise au point manuel z-axe et cliquez sur fait. Déplacez lentement l’axe z de haut en bas dans la hauteur du cadre de la section pour marquer toutes les fibres qui se croisent à la surface de la sonde de sphère virtuelle. Lorsque toutes les fibres ont été marquées, cliquez à côté pour passer à l’emplacement suivant.Lorsque toutes les fractions ont été complétées, cliquez sur la flèche verte. Le logiciel demandera l’insérer dans la section suivante. Mettre l’échantillon suivant sur la diapositive au point en utilisant l’objectif 5X et répéter la mesure de la fibre comme vient de le démontrer.Lorsque toutes les sections ont été mesurées, le logiciel générera un résultat pour le cas montrant le coefficient de valeurs d’erreur. Si le coefficient d’erreur est acceptable, passez au cas suivant. Si le coefficient d’erreur n’est pas acceptable, le logiciel fournira des recommandations pour modifier certains paramètres.Lorsque tous les cas ont été terminés, générer des résultats pour chaque cas et groupe. Dans cette expérience représentative, le groupe suédois mutant de protéine précurseur bêta-amyloïde a démontré une longueur significativement inférieure de fibre et densité de longueur de fibre comparée à leurs compagnons de litière sauvages-type. Les résultats ont également montré qu’il n’y avait pas de différence significative dans le volume de la NBM entre les deux groupes analysés.Cette technique nécessite une bonne acquisition dans la bonne orientation et une bonne méthode de coloration avec la période d’incubation. Le protocole stéréologie peut être utilisé pour l’estimation de tous les profils linéaires tels que d’autres fibres neuronales, processus des astrocytes, ou même des profils vasculaires.

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Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

Stereological Estimation of Dopaminergic Neuron Number in the Mouse Substantia Nigra Using the Optical Fractionator and Standard Microscopy Equipment

Stéréologique Estimation du nombre de neurones dopaminergiques dans la Substantia Nigra de souris à l’aide de l’optique fractionnateur et l’équipement de microscopie Standard

In pre-clinical Parkinson&#39;s disease research, analysis of the nigrostriatal tract, including quantification of dopaminergic neuron loss within the ...