Name: stereological estimation of cholinergic fiber length in the nucleus basalis of meynert of the mouse brain
Uploaded: 2020-02-05T12:00:00
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Diese Arbeit wurde durch Stipendien an W.Z.S. vom Medical Research and Development Service, Department of Veterans Affairs (Merit Review 1I01 BX001067-01A2), die Alzheimer es Association (NPSPAD-11-202149) und Ressourcen aus dem Midwest Biomedical unterstützt. Forschungsstiftung.

Alle Verfahren zur Verwendung dieser Tiere wurden vom Kansas City Veterans Affairs Medical Center Institutional Animal Care and Use Committee genehmigt. Für die Experimente wurden 18 Monate alte Mäuse verwendet, die das schwedische Mutamyloid-Vorläuferprotein (APPswe) und ihre C57/BL6-WT-Wurfmate überexpressionierten. Einzelheiten zur Zucht und Genotypisierung finden Sie in He et al.8.
1. Perfusion und Gewebeverarbeitung
<ol><li>Anästhesisieren Sie Mäuse mit ein...

<ol>
	<li>Mouton, P. R., Gokhale, A. M., Ward, N. L., West, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereological+length+estimation+using+spherical+probes.">Stereological length estimation using spherical probes.</a> Journal of Microscopy. 206, 54-64 (2002).</li><li>Whitehouse, P. J., Price, D. L., Clark, A. W., Long Coyle, J. T., DeLong, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alzheimer+disease:+evidence+for+selective+loss+of+cholinergic+neurons+in+the+nucleus+basalis.">Alzheimer disease: evidence for selective loss of cholinergic neurons in the nucleus basalis.</a> Annals of Neurology. 10 (2), 122-126 (1981).</li><li>Davies, P., Maloney, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+loss+of+central+cholinergic+neurons+in+Alzheimer's+disease.">Selective loss of central cholinergic neurons in Alzheimer's disease.</a> The Lancet. 2 (8000), 1403 (1976).</li><li>Bartus, R. T., Dean, R. L., Beer, B., Lippa, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cholinergic+hypothesis+of+geriatric+memory+dysfunction.">The cholinergic hypothesis of geriatric memory dysfunction.</a> Science. 217 (4558), 408-414 (1982).</li><li>Savonenko, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Episodic-like+memory+deficits+in+the+APPswe/PS1dE9+mouse+model+of+Alzheimer's+disease:+relationships+to+beta-amyloid+deposition+and+neurotransmitter+abnormalities.">Episodic-like memory deficits in the APPswe/PS1dE9 mouse model of Alzheimer's disease: relationships to beta-amyloid deposition and neurotransmitter abnormalities.</a> Neurobiology of Disease. 18 (3), 602-617 (2005).</li><li>Perez, S. E., Dar, S., Ikonomovic, M. D., DeKosky, S. T., Mufson, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholinergic+forebrain+degeneration+in+the+APPswe/PS1DeltaE9+transgenic+mouse.">Cholinergic forebrain degeneration in the APPswe/PS1DeltaE9 transgenic mouse.</a> Neurobiology of Disease. 28 (1), 3-15 (2007).</li><li>Stokin, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonopathy+and+transport+deficits+early+in+the+pathogenesis+of+Alzheimer's+disease.">Axonopathy and transport deficits early in the pathogenesis of Alzheimer's disease.</a> Science. 307 (5713), 1282-1288 (2005).</li><li>He, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GRK5+Deficiency+Leads+to+Selective+Basal+Forebrain+Cholinergic+Neuronal+Vulnerability.">GRK5 Deficiency Leads to Selective Basal Forebrain Cholinergic Neuronal Vulnerability.</a> Scientific Reports. 6, 26116 (2016).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lab+Animal+Research.+Anesthesia+Induction+and+Maintenance.">Lab Animal Research. Anesthesia Induction and Maintenance.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2019).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents.">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).</li><li>Mouton, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Unbiased Stereology-A Concise Guide. , (2011).</li><li>West, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+started+in+stereology.">Getting started in stereology.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2013 (4), 287-297 (2013).</li><li>West, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Space+Balls+Revisited:+Stereological+Estimates+of+Length+With+Virtual+Isotropic+Surface+Probes.">Space Balls Revisited: Stereological Estimates of Length With Virtual Isotropic Surface Probes.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 12, 49 (2018).</li><li>Nikolajsen, G. N., Kotynski, K. A., Jensen, M. S., West, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+the+capillary+network+of+aged+APPswe/PS1dE9+transgenic+mice.">Quantitative analysis of the capillary network of aged APPswe/PS1dE9 transgenic mice.</a> Neurobiology of Aging. 36 (11), 2954-2962 (2015).</li><li>Gutierrez-Jimenez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disturbances+in+the+control+of+capillary+flow+in+an+aged+APP(swe)/PS1DeltaE9+model+of+Alzheimer's+disease.">Disturbances in the control of capillary flow in an aged APP(swe)/PS1DeltaE9 model of Alzheimer's disease.</a> Neurobiology of Aging. 62, 82-94 (2018).</li><li>Gundersen, H. J., Jensen, E. B., Kieu, K., Nielsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+efficiency+of+systematic+sampling+in+stereology--reconsidered.">The efficiency of systematic sampling in stereology--reconsidered.</a> Journal of Microscopy. 193, 199-211 (1999).</li><li>Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+study+of+the+capillaries+within+the+white+matter+of+the+Tg2576+mouse+model+of+Alzheimer's+disease.">Quantitative study of the capillaries within the white matter of the Tg2576 mouse model of Alzheimer's disease.</a> Brain and Behavior. 9 (4), 01268 (2019).</li><li>McNeal, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unbiased+Stereological+Analysis+of+Reactive+Astrogliosis+to+Estimate+Age-Associated+Cerebral+White+Matter+Injury.">Unbiased Stereological Analysis of Reactive Astrogliosis to Estimate Age-Associated Cerebral White Matter Injury.</a> Journal of Neuropathology Experimental Neurology. 75 (6), 539-554 (2016).</li><li>Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Passive+(amyloid-beta)+immunotherapy+attenuates+monoaminergic+axonal+degeneration+in+the+AbetaPPswe/PS1dE9+mice.">Passive (amyloid-beta) immunotherapy attenuates monoaminergic axonal degeneration in the AbetaPPswe/PS1dE9 mice.</a> Journal of Alzheimer's Disease. 23 (2), 271-279 (2011).</li><li>Gagnon, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+Sprouting+of+Dopamine+and+Serotonin+Axons+in+the+Pallidum+of+Parkinsonian+Monkeys.">Evidence for Sprouting of Dopamine and Serotonin Axons in the Pallidum of Parkinsonian Monkeys.</a> Frontiers of Neuroanatomy. 12, 38 (2018).</li><li>Boncristiano, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholinergic+changes+in+the+APP23+transgenic+mouse+model+of+cerebral+amyloidosis.">Cholinergic changes in the APP23 transgenic mouse model of cerebral amyloidosis.</a> Journal of Neuroscience. 22 (8), 3234-3243 (2002).</li></ol>

Hier zeigen wir eine Methode zur Abschätzung der Dichte cholinerger Fasern in der NBM mit einer Raumkugelsonde ( Kugel). Diese Sonde schätzt die gesamte Faserlänge in der Region von Interesse. Die Gesamtlänge kann durch das Volumen der Region geteilt werden, um die Faserdichte zu erhalten. Um das Volumen der Region zu schätzen, wurde die Cavalieri-Punktzählungsmethode verwendet. Die Cavalieri-Punktzählungsmethode ist ein unvoreingenommener und effizienter Schätzer eines 3D-Referenzvolumens für jede Region. Die M...

Quantitative Schätzungen der Länge und/oder Dichte von Nervenfasern im Gehirn sind wichtige Parameter neuropathologischer Studien. Die Länge der cholinergen, dopaminergen und serotonergen Axone in verschiedenen Hirnregionen sind oft mit den spezifischen Funktionen der Region korreliert. Da die Verteilung dieser Axone im Allgemeinen heterogen ist, wird die designbasierte Stereologie verwendet, um Verzerrungen während der Probenahme zu vermeiden. Die Raumkugelsonde der Stereologie wurde entwickelt, um effiziente und zuverlässige Messungen von linienähnlichen Strukturen wie neuronalen Fasern in einer Region von Interesse zu bieten1. Die Sonde bildet eine virtuelle Kugel, die systematisch im Gewebe aufgezwungen wird, um Linienschnitte mit der Oberfläche der Sonde zu messen. Da es unmöglich ist, Kugelsonden zur Analyse in das Gewebe zu legen, bietet die kommerziell erhältliche Software eine virtuelle dreidimensionale (3D) Kugel, die im Grunde eine Reihe konzentrischer Kreise mit verschiedenen Durchmessern ist, die die Oberfläche der Kugelsonde darstellen.
Selektive cholinerge Neurodegeneration ist eines der konsistenten Merkmale der Alzheimer-Krankheit (AD)2,3,4. Dysfunktionale cholinerge Übertragung gilt als ein ursächlichen Faktor für kognitive Nk. Cholinerge Dysfunktion ist auch bei vielen anderen psychischen Störungen wie Parkinson, Sucht, und Schizophrenie offensichtlich. Verschiedene Aspekte der cholinergen Neurodegeneration werden in Tiermodellen untersucht (z.B. Reduktion in Acetylcholin5, ChAT-Protein6, cholinerge Faser-Neurodegeneration in der Nähe von Amyloid-Plaques6, und Abnahme der cholinergen Fasern und synaptischen Varikosen7,8). Es wird angenommen, dass die Faserdegeneration früher als der neuronale Verlust stattfindet, da cholinerge neuronaler Verlust nicht immer in Studien beobachtet wird. Die meisten cholinergen Neuronen befinden sich im Basalvorhirn und im Hirnstamm, und ihre Axone projizieren auf verschiedene Hirnregionen wie die Kortizes und den Hippocampus. NBM befindet sich im Basalvorhirn und ist einer der am häufigsten betroffenen Hirnbereiche in AD.
Die Fraktionatormethode der Stereologie basiert auf einer systematischen Stichprobenerhebung eines Gewebes auf mehreren Ebenen. Section Sampling Fraction (SSF) ist die nicht computergestützte systematische Probenahme von Abschnitten für die Fraktionatormethode der Stereologie. Flächenstichprobenfraktion (ASF) ist die Fraktionierung eines Bereichs der Interessenregion in diesem Abschnitt. Die Dickeentnahmefraktion (TSF) ist die Fraktionierung der Dicke eines Abschnitts. Die Raumkugelsonde ermöglicht es uns, Profile von Interesse in einer 3D-Kugel an fraktionierten Stellen zu quantifizieren. Hier verwenden wir eine Raumkugelsonde zur Schätzung der Gesamtlänge cholinerger Fasern im NBM des Maushirns, um die Abläufe zu veranschaulichen. Das aktuelle Protokoll enthält Details zur Gewebeverarbeitung, Probenahmemethoden für die Stereologie, immunhistochemische Färbung mit dem ChAT-Antikörper und unvoreingenommene Stereologie zur Schätzung der cholinergen Faserlänge und Faserdichte im NBM des Maushirns.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ABC kit</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>PK6100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-ChAT Antibody</td>
			<td>Millipore, MA, USA</td>
			<td>AB144P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine anti-goat IgG-B</td>
			<td>Santacruz Biotechnology</td>
			<td>SC-2347</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum, Adult</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>B9433</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Lieca Microsystems, Buffalo Grove, IL, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>D5652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene Glycol</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>324558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>G2025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>H1009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immpact-DAB kit</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>SK4105</td>
			<td>Enhanced DAB peroxidase substrate solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Westward Pharmaceuticals, NJ, USA</td>
			<td>0143-9509-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Lieca Microsystems, Buffalo Grove, IL, USA</td>
			<td>AF6000</td>
			<td>Equipped with motorized stage and IMI-tech color digital camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optimum cutting temperature (O.C.T.) embedding medium</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences, PA, USA</td>
			<td>62550-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permount mounting medium</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences, PA, USA</td>
			<td>17986-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereologer Software</td>
			<td>Stereology Resource Center, Inc. St. Petersburg, FL, USA</td>
			<td>Stereologer2000</td>
			<td>Installed on a Dell Desktop computer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma Base</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>T1503</td>
			<td>Tris base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>T5941</td>
			<td>Tris hydrochloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Bayer, Leverkusen, Germany</td>
			<td>Rompun</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylenes, Histological grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>534056</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stereological estimation of cholinergic fiber length in the nucleus basalis of meynert of the mouse brain

Die Länge von cholinergen oder anderen neuronalen Axonen in verschiedenen Hirnregionen korreliert oft mit der spezifischen Funktion der Region. Die Stereologie ist eine nützliche Methode, um neuronale Profile verschiedener Gehirnstrukturen zu quantifizieren. Hier stellen wir ein softwarebasiertes Stereologie-Protokoll zur Schätzung der Gesamtlänge cholinerger Fasern im Kern basalis von Meynert (NBM) des Basalvorhirns zur Verfügung. Die Methode verwendet eine Raumkugelsonde für Längenschätzungen. Die cholinerge Fasern werden durch Cholin-Acetyltransferase (ChAT) Immunfärbung mit dem Meerrettich peroxidase-Diaminobenzidin (HRP-DAB) Detektionssystem visualisiert. Das Färbeprotokoll gilt auch für die Faser- und Zellzahlenschätzung in verschiedenen Hirnregionen mit Stereologie-Software. Das stereologische Protokoll kann zur Abschätzung von linearen Profilen wie chollinoceptiven Fasern, dopaminergen/katecholaminergen Fasern, serotonergen Fasern, Astrozytenprozessen oder sogar Gefäßprofilen verwendet werden.

Repräsentative Ergebnisse sind in Tabelle 1 und Abbildung 5dargestellt. Gruppe C, die als APPswe-Gruppe (APP) decodiert wurde, hatte eine deutlich geringere Faserlänge (Abbildung 5B) und eine Faserlängendichte (Abbildung 5C) im Vergleich zu ihren Wildtyp-Wurfmatten (WILD). Die Ergebnisse zeigten, dass es keinen signifikanten Unterschied im Volumen der NBM zwischen den beiden anal...

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Stereological Estimation of Cholinergic Fiber Length in the Nucleus Basalis of Meynert of the Mouse Brain

Die neuronale Faserlänge innerhalb einer dreidimensionalen Struktur einer Hirnregion ist ein zuverlässiger Parameter, um spezifische neuronale strukturelle Integrität oder Degeneration zu quantifizieren. Dieser Artikel beschreibt eine stereologische Quantifizierungsmethode zur Messung der cholinergen Faserlänge innerhalb des Kernbasalis von Meynert bei Mäusen als Beispiel.

Stereologische Abschätzung der cholinergen Faserlänge im Nukleus Basalis von Meynert des Maushirns

The length of cholinergic or other neuronal axons in various brain regions are often correlated with the specific function of the region. Stereology is a ...

Neurodenegration bei vielen neurologischen Erkrankungen ist ein chronischer Prozess, von dem neuronale Faserverlust oft vor dem Zellkörperverlust auftritt. Die stereologische Quantifizierung neuronaler Fasern in drei Dimensionen bietet eine empfindliche und genaue Methode zur Erkennung früher neurodegenerativer Veränderungen. Diese Technologie nutzt die zuverlässige und effiziente computerbasierte unvoreingenommene Fraktionierung von Raumkugeln, um die Längen von linienähnlichen Strukturen wie neuronalen Fasern in 3D zu messen.Die Demonstration des Verfahrens wird von Prabhakar Singh, einem Post-Doc und unserem Experten für Stereologie, und David Peng, dem wissenschaftlichen Assistenten in meinem Labor, durchgeführt. Nach Bestätigung eines Mangels an Reaktion auf Pedalreflex in der anästhesierten Maus, transkardial perfuse mit etwa 50 Milliliter eiskalten 0,1 Molar DPBS, gefolgt von etwa 25 Milliliter von 4%PFA in 0,1 Molaren PBS. Am Ende der Perfusion, post-fix das Gehirn in einem Behälter von frischen 4%PFA für 24 Stunden bei vier Grad Celsius.Am nächsten Tag waschen Sie das Gehirn mit drei ein- bis zweiminütigen Waschungen in frischem DPBS pro Waschgang und übertragen Sie das Gehirn über Nacht in eine 15%Saccharose in 0,1 DPBS-Lösung. Am nächsten Morgen, legen Sie das Gehirn in eine 30%Saccharose-Lösung und 0,1 Molaren DPBS für 48 Stunden bei vier Grad Celsius. Am Ende der Inkubation, übertragen Sie das Gehirn in eine Kryotome Kammer voreingestellt auf minus 20 Grad Celsius.Gehirne können in versiegelten Röhren aufbewahrt und bei minus 80 Grad Celsius gelagert werden. Zum Schneiden die Gewebeprobe in ein optimales Schnitttemperatur-Einbettmedium einbetten und die Probe auf einer Probenscheibe montieren. Dann erwerben serielle 30 Mikrometer dicke Abschnitte in einer koronalen Ebene in der Kryotome, übertragung enzieren jeden Abschnitt in einzelne Brunnen einer 24-Well-Kulturplatte mit Kryoprotektor-Lösung in Vorbereitung auf minus 20 Grad Celsius Lagerung.Um den ersten und letzten Abschnitt jedes Gehirns zu identifizieren, vergleichen Sie die morphologischen Merkmale mit einem Standard-Maus-Gehirnatlas. NBM beginnt bei Bregma minus 0,0 Millimetern und endet bei minus 1,6 Millimetern. Die Auswahl jedes achten Abschnitts ergibt insgesamt sechs bis sieben Abschnitte und ermöglicht einen geeigneten Fehlerkoeffizienten für eine Volumen- und Faserlängenschätzung.Für die immunhistochemische Etikettierung der Gewebeabschnitte, nach der Blockierung jeder unspezifischen Bindung mit 10%normalem Rinderserum in 0,1%Triton X-100 in Tris-gepufferter Salin, beschriften Sie die Abschnitte mit dem primären Antikörper von Interesse für 48 Stunden bei vier Grad Celsius. Am Ende der Inkubation die Abschnitte dreimal drei Minuten in frischer Tris-gepufferter Kochchen pro Wäsche waschen, gefolgt von einer Inkubation mit einem geeigneten biotinylierten Sekundärantikörper für eine Stunde bei Raumtemperatur. Waschen Sie die Abschnitte am Ende der Inkubation dreimal in frischer Tris-gepufferter Kochsaline, gefolgt von der Färbung mit Deminzin-Peroxidase-Komplex und dAB-Peroxidase-Substratlösung nach den Protokollen des Herstellers.Nach dem Waschen alle Abschnitte aus einer Hirngewebeprobe auf einen gelatinierten Schlitten montieren und die Proben trocknen lassen. Um die Abschnitte zu dehydrieren, tauchen Sie die Proben zweimal für fünf Minuten pro Verdünnung in sequenzielle aufsteigende Ethanollösungen ein, wie angegeben, gefolgt von der Reinigung mit zwei 10-minütigen Xylol-Waschen. Verwenden Sie dann ein geeignetes Montagemedium, um Abdeckungen auf die Dias zu legen.Für die Stereologie, öffnen Sie eine neue Studie in der Software. Eine Dialogbox für die Studieninitialisierung wird geöffnet. Füllen Sie die Studieninformationen aus, und bestätigen Sie, dass mehrstufige Fraktionsbasierte ausgewählt ist.Doppelklicken Sie auf Lautstärke, um das Lautstärkedialogfeld zu öffnen. Benennen Sie das von Interesse ist, und wählen Sie den Punktzählungspunkt der Region aus, und klicken Sie auf Weiter. Doppelklicken Sie auf die Länge und geben Sie einen Namen der Funktion an.Wählen Sie den Kugelsondenpunkt aus, und klicken Sie auf Weiter. Um die Gruppen vor Beginn der Studie zu codieren, legen Sie im Feld "Initialisierung" die Gesamtzahl der Abschnitte fest, die vom ersten Abschnitt mit dem Interessenbereich bis zum letzten Abschnitt mit dem Interessenbereich und dem Abschnittsstichprobenintervall beginnen, auf acht. Klicken Sie auf neben, um das Dialogfeld für die Testinitialisierung zu öffnen, in dem automatisch die niedrigste Vergrößerung für die Regionsauswahl und die Volumenschätzung festgelegt wird, und die Einstellungen bestätigen.Klicken Sie auf Vorschau, um zu überprüfen, ob der Interessenbereich bei der ausgewählten unteren Vergrößerung identifiziert werden kann. Geben Sie 50.000 Mikrometer Würfel pro Punkt für den Regionsvolumenanteil ein, und klicken Sie auf Vorschau und Fertig. Legen Sie unter Objekt-Hochvergrößerung die Länge auf 63X fest, und doppelklicken Sie auf die Länge, um das Dialogfeld Länge der Kugel zu öffnen.Stellen Sie den Durchmesser dieser Kugel auf 10 Mikrometer und klicken Sie auf Fertig. Legen Sie die entsprechenden Werte für den Rahmenbereich, die Rahmenhöhe, die Schutzzone und den Rahmenabstand fest. Klicken Sie dann auf Weiter und folgen Sie den Anweisungen der Software.Um den ersten Abschnitt einzufügen, platzieren Sie die Folie auf der Bühne des Mikroskops unter einem 5-Fach-Objektiv und klicken Sie auf den grünen Pfeil, um eine beliebige Grenze um die NBM zu ziehen, um den Interessenbereich zu definieren. Klicken Sie auf den grünen Pfeil und tun Sie, um das 63X-Ziel zu ändern, um die Fasermessungen des aktuellen Bruchs zu erhalten. Die Dialogbox für die Schnittdicke wird angezeigt.Legen Sie die obere und untere Oberfläche des Abschnitts fest, um die tatsächliche Dicke des Abschnitts mit dem manuellen Fokusknopf für die Z-Achse zu messen, und klicken Sie darauf, fertig zu sein. Verschieben Sie die Z-Achse langsam von oben nach unten in der Rahmenhöhe des Abschnitts, um alle sich schneidenden Fasern auf der Oberfläche der virtuellen Kugelsonde zu markieren. Wenn alle Fasern markiert sind, klicken Sie auf weiter, um zum nächsten Speicherort zu fahren.Wenn alle Brüche abgeschlossen sind, klicken Sie auf den grünen Pfeil. Die Software wird darum bitten, den nächsten Abschnitt eingefügt zu haben. Bringen Sie die nächste Probe auf dem Dia mit dem 5X-Objektiv in den Fokus und wiederholen Sie die Fasermessung, wie gerade gezeigt.Wenn alle Abschnitte gemessen wurden, generiert die Software ein Ergebnis für den Fall, das den Koeffizienten der Fehlerwerte anzeigt. Wenn der Fehlerkoeffizient akzeptabel ist, fahren Sie mit dem nächsten Fall fort. Wenn der Fehlerkoeffizient nicht akzeptabel ist, gibt die Software Empfehlungen, um einige der Parameter zu ändern.Wenn alle Anfragen abgeschlossen sind, generieren Sie Ergebnisse für jeden Fall und jede Gruppe. In diesem repräsentativen Experiment zeigte die schwedische Mutante Beta-Amyloid-Vorläuferproteingruppe eine deutlich geringere Faserlänge und Faserlängendichte im Vergleich zu ihren Wild-Wurf-Kollegen. Die Ergebnisse zeigten auch, dass es keinen signifikanten Unterschied im Volumen der NBM zwischen den beiden analysierten Gruppen gab.Diese Technik erfordert die richtige Erfassung in der richtigen Ausrichtung und eine gute Färbemethode mit der Inkubationszeit. Das stereologische Protokoll kann für die Schätzung von linearen Profilen wie anderen neuronalen Fasern, Astrozytenprozessen oder sogar Gefäßprofilen verwendet werden.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

Live-Imaging der Mitose in der Entwicklung von embryonalen Maus-Cortex

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

Forschung

Neurowissenschaften

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol (TRAP) Assay

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol TRAP Assay

Telomerase-Aktivität in den verschiedenen Regionen der Maus Gehirn: Nicht-radioaktive Telomerase Repeat Amplification Protocol (TRAP)-Assay

Telomerase, a ribonucleoprotein, is responsible for maintaining the telomere length and therefore promoting genomic integrity, proliferation, and ...

Analysis of Gene Expression Changes in the Rat Hippocampus After Deep Brain Stimulation of the Anterior Thalamic Nucleus

Die Analyse der Genexpression Veränderungen im Hippocampus Ratte nach Tiefenhirnstimulation des Anterior Thalamuskern

Deep brain stimulation (DBS) surgery, targeting various regions of the brain such as the basal ganglia, thalamus, and subthalamic regions, is an effective ...

Stereotaxic Infusion of Oligomeric Amyloid-beta into the Mouse Hippocampus

Stereotaktische Infusion von oligomeren Amyloid-beta in die Maus-Hippocampus

Alzheimer&#8217;s disease is a neurodegenerative disease affecting the aging population. A key neuropathological feature of the disease is the ...

Live Imaging of the Ependymal Cilia in the Lateral Ventricles of the Mouse Brain

Live-Imaging des Ependymale Cilia in der Seitenventrikel des Maus-Gehirn-

Multiciliated ependymal cells line the ventricles in the adult brain. Abnormal function or structure of ependymal cilia is associated with various ...

Microelectrode Guided Implantation of Electrodes into the Subthalamic Nucleus of Rats for Long-term Deep Brain Stimulation

Mikroelektroden-geführte Implantation von Elektroden in den Nucleus subthalamicus des Rats für die Langzeit-Tiefe Hirnstimulation

Deep brain stimulation (DBS) is a widely used and effective therapy for several neurologic disorders, such as idiopathic Parkinson&#8217;s disease, ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Aufnahme synaptische Plastizität in akuten Hippocampal Scheiben gepflegt in einem kleinvolumigen Recycling - Perfusions- und untertauchen-Typ-Kammer-System

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

Stereological Estimation of Dopaminergic Neuron Number in the Mouse Substantia Nigra Using the Optical Fractionator and Standard Microscopy Equipment

Stereologischen Schätzung der dopaminergen Neuron Nummer in der Maus Substantia Nigra mit dem optischen Plasmafraktionierer und Standard-Mikroskopie-Ausrüstung

In pre-clinical Parkinson&#39;s disease research, analysis of the nigrostriatal tract, including quantification of dopaminergic neuron loss within the ...