Name: stereological estimation of cholinergic fiber length in the nucleus basalis of meynert of the mouse brain
Uploaded: 2020-02-05T12:00:00
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Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni a W.E.S. dal Servizio di Ricerca e Sviluppo Medica, dal Dipartimento degli Affari Veterani (Recensione del Merito 1I01 BX001067-01A2), dall'Alzheimer (NPSPAD-11-202149) e dalle risorse del Midwest Biomedical Fondazione di Ricerca.

Tutte le procedure per l'utilizzo di questi animali sono state approvate dal Kansas City Veterans Affairs Medical Center Institutional Animal Care and Use Committee. Per gli esperimenti sono stati utilizzati topi di 18 mesi che sovraesprimono la proteina precursore del beta-amiloide mutante svedese (APPPawe) e i loro compagni di cucciolata C57/BL6 WT. I dettagli dell'allevamento e della genotipizzazione sono forniti in Egli et al.8.
1. Perfusione e lavorazione dei tessuti...

<ol>
	<li>Mouton, P. R., Gokhale, A. M., Ward, N. L., West, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereological+length+estimation+using+spherical+probes.">Stereological length estimation using spherical probes.</a> Journal of Microscopy. 206, 54-64 (2002).</li><li>Whitehouse, P. J., Price, D. L., Clark, A. W., Long Coyle, J. T., DeLong, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alzheimer+disease:+evidence+for+selective+loss+of+cholinergic+neurons+in+the+nucleus+basalis.">Alzheimer disease: evidence for selective loss of cholinergic neurons in the nucleus basalis.</a> Annals of Neurology. 10 (2), 122-126 (1981).</li><li>Davies, P., Maloney, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+loss+of+central+cholinergic+neurons+in+Alzheimer's+disease.">Selective loss of central cholinergic neurons in Alzheimer's disease.</a> The Lancet. 2 (8000), 1403 (1976).</li><li>Bartus, R. T., Dean, R. L., Beer, B., Lippa, A. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholinergic+forebrain+degeneration+in+the+APPswe/PS1DeltaE9+transgenic+mouse.">Cholinergic forebrain degeneration in the APPswe/PS1DeltaE9 transgenic mouse.</a> Neurobiology of Disease. 28 (1), 3-15 (2007).</li><li>Stokin, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonopathy+and+transport+deficits+early+in+the+pathogenesis+of+Alzheimer's+disease.">Axonopathy and transport deficits early in the pathogenesis of Alzheimer's disease.</a> Science. 307 (5713), 1282-1288 (2005).</li><li>He, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GRK5+Deficiency+Leads+to+Selective+Basal+Forebrain+Cholinergic+Neuronal+Vulnerability.">GRK5 Deficiency Leads to Selective Basal Forebrain Cholinergic Neuronal Vulnerability.</a> Scientific Reports. 6, 26116 (2016).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lab+Animal+Research.+Anesthesia+Induction+and+Maintenance.">Lab Animal Research. Anesthesia Induction and Maintenance.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2019).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents.">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).</li><li>Mouton, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Unbiased Stereology-A Concise Guide. , (2011).</li><li>West, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+started+in+stereology.">Getting started in stereology.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2013 (4), 287-297 (2013).</li><li>West, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Space+Balls+Revisited:+Stereological+Estimates+of+Length+With+Virtual+Isotropic+Surface+Probes.">Space Balls Revisited: Stereological Estimates of Length With Virtual Isotropic Surface Probes.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 12, 49 (2018).</li><li>Nikolajsen, G. N., Kotynski, K. A., Jensen, M. S., West, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+the+capillary+network+of+aged+APPswe/PS1dE9+transgenic+mice.">Quantitative analysis of the capillary network of aged APPswe/PS1dE9 transgenic mice.</a> Neurobiology of Aging. 36 (11), 2954-2962 (2015).</li><li>Gutierrez-Jimenez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disturbances+in+the+control+of+capillary+flow+in+an+aged+APP(swe)/PS1DeltaE9+model+of+Alzheimer's+disease.">Disturbances in the control of capillary flow in an aged APP(swe)/PS1DeltaE9 model of Alzheimer's disease.</a> Neurobiology of Aging. 62, 82-94 (2018).</li><li>Gundersen, H. J., Jensen, E. B., Kieu, K., Nielsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+efficiency+of+systematic+sampling+in+stereology--reconsidered.">The efficiency of systematic sampling in stereology--reconsidered.</a> Journal of Microscopy. 193, 199-211 (1999).</li><li>Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+study+of+the+capillaries+within+the+white+matter+of+the+Tg2576+mouse+model+of+Alzheimer's+disease.">Quantitative study of the capillaries within the white matter of the Tg2576 mouse model of Alzheimer's disease.</a> Brain and Behavior. 9 (4), 01268 (2019).</li><li>McNeal, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unbiased+Stereological+Analysis+of+Reactive+Astrogliosis+to+Estimate+Age-Associated+Cerebral+White+Matter+Injury.">Unbiased Stereological Analysis of Reactive Astrogliosis to Estimate Age-Associated Cerebral White Matter Injury.</a> Journal of Neuropathology Experimental Neurology. 75 (6), 539-554 (2016).</li><li>Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Passive+(amyloid-beta)+immunotherapy+attenuates+monoaminergic+axonal+degeneration+in+the+AbetaPPswe/PS1dE9+mice.">Passive (amyloid-beta) immunotherapy attenuates monoaminergic axonal degeneration in the AbetaPPswe/PS1dE9 mice.</a> Journal of Alzheimer's Disease. 23 (2), 271-279 (2011).</li><li>Gagnon, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+Sprouting+of+Dopamine+and+Serotonin+Axons+in+the+Pallidum+of+Parkinsonian+Monkeys.">Evidence for Sprouting of Dopamine and Serotonin Axons in the Pallidum of Parkinsonian Monkeys.</a> Frontiers of Neuroanatomy. 12, 38 (2018).</li><li>Boncristiano, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholinergic+changes+in+the+APP23+transgenic+mouse+model+of+cerebral+amyloidosis.">Cholinergic changes in the APP23 transgenic mouse model of cerebral amyloidosis.</a> Journal of Neuroscience. 22 (8), 3234-3243 (2002).</li></ol>

Qui dimostriamo un metodo per stimare la densità delle fibre colinergiche nel NBM utilizzando una sonda palla spaziale (sfera). Questa sonda stima la lunghezza totale della fibra nella regione di interesse. La lunghezza totale può essere divisa per il volume della regione per ottenere la densità della fibra. Per stimare il volume della regione, è stato utilizzato il metodo di conteggio punti Cavalieri. Il metodo di conteggio punti Cavalieri è uno stimatore imparziale ed efficiente di un volume di riferimento 3D per ...

Le stime quantitative della lunghezza e/o della densità delle fibre nervose nel cervello sono parametri importanti degli studi neuropatologici. La lunghezza degli assoni colinergici, dopaminergici e sierotonergici in varie regioni del cervello sono spesso correlati con le funzioni specifiche della regione. Poiché la distribuzione di questi assoni è generalmente eterogenea, la stereologia basata sulla progettazione viene utilizzata per evitare distorsioni durante il campionamento. La sonda spaziale di stereologia è stata progettata per fornire misure efficienti e affidabili di strutture simili a linee come le fibre neuronali in una regione di interesse1. La sonda crea una sfera virtuale che viene imposta sistematicamente nel tessuto per misurare le intersezioni della linea con la superficie della sonda. Poiché è impossibile inserire sonde di sfera nel tessuto per l'analisi, il software disponibile in commercio fornisce una sfera tridimensionale virtuale (3D), che è fondamentalmente una serie di cerchi concentrici di vari diametri che rappresentano la superficie della sonda di sfera.
La neurodegenerazione colinergica selettiva è una delle caratteristiche coerenti del morbo di Alzheimer (AD)2,3,4. Trasmissione colinergica disfunzionale è considerato un fattore causale per il declino cognitivo in AD. Disfunzione colinergica è evidente anche in molti altri disturbi mentali come il morbo di Parkinson, dipendenza, e schizofrenia. Diversi aspetti della neurodegenerazione colinergica sono studiati in modelli animali (ad esempio, riduzione dell'acetilcolina5, proteina ChAT6, neurodegenerazione della fibra colinergica in prossimità di placche amiloidi6, e diminuzione delle fibre colinergiche e varicosità sinaptiche7,8). Degenerazione di fibra è creduto per avvenire prima della perdita neuronale, perché la perdita neuronale colinergica non è sempre osservata negli studi. La maggior parte dei neuroni colinergici sono nel prosencefalo basale e il tronco encefalico, e loro assoni proiettano in varie regioni del cervello come le cortici e l'ippocampo. NBM è situato nel prosencefalo basale e si trova ad essere una delle aree del cervello comunemente colpite in AD.
Il metodo frazionario della stereologia si basa sul campionamento casuale sistematico di un tessuto a più livelli. La frazione di campionamento di sezione (SSF) è il campionamento sistematico non basato su computer delle sezioni per il metodo frazionario della stereologia. La frazione di campionamento dell'area (ASF) è la frazione di un'area dell'area di interesse nella sezione. La frazione di campionamento dello spessore (TSF) è la frazione dello spessore di una sezione. La sonda spaziale a sfera ci permette di quantificare i profili di interesse in una sfera 3D in posizioni frazionate. Qui usiamo una sonda a sfera spaziale per stimare la lunghezza totale delle fibre colinergiche nella NBM del cervello del topo per illustrare le procedure. Il protocollo attuale fornisce dettagli sull'elaborazione dei tessuti, sui metodi di campionamento per la stereologia, sulla colorazione immunoistochimica che utilizza l'anticorpo ChAT e sulla stereologia imparziale per stimare la lunghezza della fibra colinergica e la densità delle fibre nella NBM del cervello del topo.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ABC kit</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>PK6100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-ChAT Antibody</td>
			<td>Millipore, MA, USA</td>
			<td>AB144P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine anti-goat IgG-B</td>
			<td>Santacruz Biotechnology</td>
			<td>SC-2347</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum, Adult</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>B9433</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Lieca Microsystems, Buffalo Grove, IL, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>D5652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene Glycol</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>324558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>G2025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>H1009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immpact-DAB kit</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>SK4105</td>
			<td>Enhanced DAB peroxidase substrate solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Westward Pharmaceuticals, NJ, USA</td>
			<td>0143-9509-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Lieca Microsystems, Buffalo Grove, IL, USA</td>
			<td>AF6000</td>
			<td>Equipped with motorized stage and IMI-tech color digital camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optimum cutting temperature (O.C.T.) embedding medium</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences, PA, USA</td>
			<td>62550-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permount mounting medium</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences, PA, USA</td>
			<td>17986-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereologer Software</td>
			<td>Stereology Resource Center, Inc. St. Petersburg, FL, USA</td>
			<td>Stereologer2000</td>
			<td>Installed on a Dell Desktop computer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma Base</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>T1503</td>
			<td>Tris base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>T5941</td>
			<td>Tris hydrochloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Bayer, Leverkusen, Germany</td>
			<td>Rompun</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylenes, Histological grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>534056</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stereological estimation of cholinergic fiber length in the nucleus basalis of meynert of the mouse brain

La lunghezza degli assoni colinergici o di altri neuronali in varie regioni del cervello è spesso correlata con la funzione specifica della regione. La stereologia è un metodo utile per quantificare i profili neuronali di varie strutture cerebrali. Qui forniamo un protocollo di stereologia basato su software per stimare la lunghezza totale delle fibre colinergiche nel nucleo basalis di Meynert (NBM) del prosencefalo basale. Il metodo utilizza una sonda a sfera spaziale per le stime di lunghezza. Le fibre collinergiche sono visualizzate da colina acetiltransferasi (ChAT) immunostaining con il rafano peroxidase-diaminobenzidina (HRP-DAB) sistema di rilevamento. Il protocollo di colorazione è valido anche per la stima della fibra e del numero di cellule in varie regioni del cervello utilizzando software di stereologia. Il protocollo di stereologia può essere utilizzato per la stima di eventuali profili lineari come fibre coccolincettive, fibre dopaminergiche/catecholaminergiche, fibre sitonergiche, processi astrociti, o anche profili vascolari.

I risultati rappresentativi sono riportati nella tabella 1 e nella figura 5. Il gruppo C, che è stato decodificato come gruppo APPswe (APP), aveva una lunghezza della fibra significativamente inferiore (Figura 5B) e densità di lunghezza della fibra (Figura 5C) rispetto ai loro compagni di cucciolata di tipo selvaggio (WILD). I risultati hanno mostrato che non vi era alcuna differe...

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Stereological Estimation of Cholinergic Fiber Length in the Nucleus Basalis of Meynert of the Mouse Brain

Lunghezza della fibra neuronale all'interno di una struttura tridimensionale di una regione del cervello è un parametro affidabile per quantificare specifica integrità strutturale neuronale o degenerazione. Questo articolo descrive in dettaglio un metodo di quantificazione stereologica per misurare la lunghezza della fibra colinergica all'interno del nucleo basalis di Meynert nei topi come esempio.

Stima stereologica della lunghezza della fibra colinergica nel Nucleus Basalis di Meynert del cervello del topo

The length of cholinergic or other neuronal axons in various brain regions are often correlated with the specific function of the region. Stereology is a ...

La neurodenegrazione in molti disturbi neurologici è un processo cronico di cui la perdita di fibre neuronali si verifica spesso prima della perdita del corpo cellulare. La quantificazione stereologica delle fibre neuronali in tre dimensioni fornisce un metodo sensibile e accurato per rilevare i primi cambiamenti neurodegenerativi. Questa tecnologia utilizza il frazionamento imparziale affidabile ed efficiente basato su computer delle palle spaziali per misurare le lunghezze di strutture simili a linee come le fibre neuronali in 3D.A dimostrare la procedura saranno Prabhakar Singh, un post-doc e il nostro esperto di stereologia, e David Peng, l'assistente di ricerca nel mio laboratorio. Dopo aver confermato una mancanza di risposta al riflesso del pedale nel topo anestetizzato, perfondere trascardialmente con circa 50 millilitri di DPBS molare ghiacciato 0,1, seguito da circa 25 millilitri di 4%PFA in 0,1 PBS molare. Alla fine della perfusione, post-fissare il cervello in un contenitore di 4%PFA fresco per 24 ore a quattro gradi Celsius.Il giorno dopo, lavare il cervello con tre lavaggi da uno a due minuti in DPBS fresco per lavaggio e trasferire il cervello in un saccarosio del 15% in soluzione DPBS 0.1 durante la notte. La mattina seguente, metti il cervello in una soluzione di saccarosio al 30% e 0,1 DPBS molare per 48 ore a quattro gradi Celsius. Alla fine dell'incubazione, trasferire il cervello in una camera criotoma pre-impostata a meno 20 gradi Celsius.Il cervello può essere tenuto in tubi sigillati e conservato a meno 80 gradi Celsius. Per il sezionamento, incorporare il campione di tessuto in un mezzo di incorporamento ottimale della temperatura di taglio e montare il campione su un disco campione. Quindi acquisire sezioni seriali spesse 30 micrometri in un piano coronale nel criotomo, trasferendo ogni sezione in singoli pozzi di una piastra di coltura di 24 porri contenente soluzione crioprotettiva in preparazione per lo stoccaggio di meno 20 gradi Celsius.Per identificare la prima e l'ultima sezione di ogni cervello, confrontare le caratteristiche morfologiche con un atlante cerebrale standard del mouse. NBM inizia da bregma meno 0,0 millimetri e termina a meno 1,6 millimetri. La selezione di ogni ottava sezione produce un totale di sei-sette sezioni e consente un coefficiente di errore appropriato sia per una stima del volume che della lunghezza della fibra.Per l'etichettatura immunoistochimica delle sezioni tissutali, dopo aver bloccato qualsiasi legame non specifico con siero bovino normale al 10% nello 0,1%Tritone X-100 nella soluzione salina tamponata da Tris, etichettare le sezioni con l'anticorpo primario di interesse per 48 ore a quattro gradi Celsius. Al termine dell'incubazione, lavare le sezioni tre volte per tre minuti in soluzione salina tris-tamponata fresca per lavaggio, seguita da incubazione con un anticorpo secondario biotinilato appropriato per un'ora a temperatura ambiente. Al termine dell'incubazione, lavare le sezioni tre volte in soluzione salina tris-tamponata fresca come dimostrato, seguita dalla colorazione con complesso di perossidasi di biotina Avidin e soluzione di substrato perossidasi DAB secondo i protocolli del produttore.Dopo il lavaggio, montare tutte le sezioni da un campione di tessuto cerebrale su uno scivolo gelatinizzato e lasciare asciugare i campioni all'aria. Per disidratare le sezioni, immergere i campioni due volte per cinque minuti per diluizione in soluzioni sequenziali ascendenti di etanolo come indicato, seguita da schiaritura con due lavaggi in xilene di 10 minuti. Quindi utilizzare un mezzo di montaggio appropriato per posizionare le copertine sulle diapositive.Per la stereologia, aprire un nuovo studio nel software. Si aprirà una finestra di dialogo per l'inizializzazione dello studio. Compilare le informazioni sullo studio e verificare che sia selezionata l'opzione basata su frazioni a più livelli.Fare doppio clic sul volume per aprire la finestra di dialogo volume. Assegnare un nome alla feature di interesse e selezionare la sonda di conteggio dei punti regione e fare clic su Avanti. Fate doppio clic sulla lunghezza e fornite un nome della feature.Selezionate sonda sfera e fate clic su Avanti (Next). Nella casella di inizializzazione del caso, per codificare i gruppi prima di iniziare lo studio, impostare il numero totale di sezioni a partire dalla prima sezione contenente l'area di interesse fino all'ultima sezione contenente l'area di interesse e l'intervallo di campionamento della sezione a otto. Fare clic accanto per aprire la finestra di dialogo di inizializzazione del probe che imposta automaticamente l'ingrandimento più basso per la selezione dell'area e la stima del volume e conferma le impostazioni.Fare clic su anteprima per verificare se l'area di interesse può essere identificata con l'ingrandimento inferiore selezionato. Immettere 50.000 micrometri cubo per punto per la frazione di volume dell'area e fare clic su anteprima e fine. In ingrandimento elevato oggetto, impostate la lunghezza su 63X e fate doppio clic sulla lunghezza per aprire la finestra di dialogo della sfera di lunghezza.Impostare il diametro di questa sfera su 10 micrometri e fare clic su fatto. Impostate i valori appropriati per l'area del fotogramma, l'altezza del fotogramma, la zona di protezione e la spaziatura del fotogramma. Quindi fare clic su Avanti e seguire le istruzioni fornite dal software.Per inserire la prima sezione, posizionare la diapositiva sullo stadio del microscopio sotto un obiettivo 5X e fare clic sulla freccia verde per disegnare un limite arbitrario attorno all'NBM per definire la regione di interesse. Fare clic sulla freccia verde e fare per modificare l'obiettivo 63X per ottenere le misurazioni in fibra della frazione corrente. Verrà visualizzata la finestra di dialogo spessore sezione.Impostate la superficie superiore e inferiore della sezione per misurare lo spessore effettivo della sezione utilizzando la manopola di messa a fuoco manuale dell'asse Z e fate clic su Fatto (Done). Spostate lentamente l'asse Z dall'alto verso il basso nell'altezza del fotogramma della sezione per contrassegnare tutte le fibre intersecante sulla superficie della sonda a sfera virtuale. Quando tutte le fibre sono state contrassegnate, fare clic accanto per passare alla posizione successiva.Una volta completate tutte le frazioni, fare clic sulla freccia verde. Il software chiederà di inserire la sezione successiva. Portare a fuoco il campione successivo sulla diapositiva utilizzando l'obiettivo 5X e ripetere la misurazione della fibra come appena dimostrato.Una volta misurate tutte le sezioni, il software genererà un risultato per il caso che mostra il coefficiente dei valori di errore. Se il coefficiente di errore è accettabile, procedere al caso successivo. Se il coefficiente di errore non è accettabile, il software fornirà raccomandazioni per modificare alcuni dei parametri.Una volta completati tutti i casi, generare risultati per ogni caso e gruppo. In questo esperimento rappresentativo, il gruppo proteico precursore beta amiloide mutante svedese ha dimostrato una lunghezza delle fibre significativamente inferiore e una densità di lunghezza delle fibre rispetto ai loro accoppiamenti di lettiera di tipo selvatico. I risultati hanno anche mostrato che non c'era alcuna differenza significativa nel volume dell'NBM tra i due gruppi analizzati.Questa tecnica richiede una corretta acquisizione nell'orientamento corretto e un buon metodo di colorazione con il periodo di incubazione. Il protocollo stereologico può essere utilizzato per la stima di qualsiasi profilo lineare come altre fibre neuronali, processi astrociti o persino profili vascolari.

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Stereological Estimation of Dopaminergic Neuron Number in the Mouse Substantia Nigra Using the Optical Fractionator and Standard Microscopy Equipment

Stereologiche stima del numero di neuroni dopaminergici nel Nigra di Substantia del Mouse utilizzando il frazionatore ottica e microscopia Standard attrezzature

In pre-clinical Parkinson&#39;s disease research, analysis of the nigrostriatal tract, including quantification of dopaminergic neuron loss within the ...