Name: stereological estimation of cholinergic fiber length in the nucleus basalis of meynert of the mouse brain
Uploaded: 2020-02-05T12:00:00
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이 작품은 의학 연구 및 개발 서비스, 재향 군인 업무부 (공로 검토 1I01 BX001067-01A2), 알츠하이머 협회 (NPSPAD-11-202149), 중서부 생물 의학의 자원에서 W.Z.S.에 대한 보조금에 의해 지원되었다 연구 재단.

이 동물을 사용하기위한 모든 절차는 캔자스 시티 재향 군인 의료 센터 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다. 스웨덴 돌연변이 베타 아밀로이드 전구체 단백질(APPswe) 및 그들의 C57/BL6 WT 리터메이트를 과발현하는 18개월 된 마우스를 실험에 사용하였다. 번식과 하노이핑에 대한 자세한 내용은 He et al.8.
1. 관류 및 조직 처리
<ol><li>케타민 (100 ...

<ol>
	<li>Mouton, P. R., Gokhale, A. M., Ward, N. L., West, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereological+length+estimation+using+spherical+probes.">Stereological length estimation using spherical probes.</a> Journal of Microscopy. 206, 54-64 (2002).</li><li>Whitehouse, P. J., Price, D. L., Clark, A. W., Long Coyle, J. T., DeLong, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alzheimer+disease:+evidence+for+selective+loss+of+cholinergic+neurons+in+the+nucleus+basalis.">Alzheimer disease: evidence for selective loss of cholinergic neurons in the nucleus basalis.</a> Annals of Neurology. 10 (2), 122-126 (1981).</li><li>Davies, P., Maloney, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+loss+of+central+cholinergic+neurons+in+Alzheimer's+disease.">Selective loss of central cholinergic neurons in Alzheimer's disease.</a> The Lancet. 2 (8000), 1403 (1976).</li><li>Bartus, R. T., Dean, R. L., Beer, B., Lippa, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cholinergic+hypothesis+of+geriatric+memory+dysfunction.">The cholinergic hypothesis of geriatric memory dysfunction.</a> Science. 217 (4558), 408-414 (1982).</li><li>Savonenko, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Episodic-like+memory+deficits+in+the+APPswe/PS1dE9+mouse+model+of+Alzheimer's+disease:+relationships+to+beta-amyloid+deposition+and+neurotransmitter+abnormalities.">Episodic-like memory deficits in the APPswe/PS1dE9 mouse model of Alzheimer's disease: relationships to beta-amyloid deposition and neurotransmitter abnormalities.</a> Neurobiology of Disease. 18 (3), 602-617 (2005).</li><li>Perez, S. E., Dar, S., Ikonomovic, M. D., DeKosky, S. T., Mufson, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholinergic+forebrain+degeneration+in+the+APPswe/PS1DeltaE9+transgenic+mouse.">Cholinergic forebrain degeneration in the APPswe/PS1DeltaE9 transgenic mouse.</a> Neurobiology of Disease. 28 (1), 3-15 (2007).</li><li>Stokin, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonopathy+and+transport+deficits+early+in+the+pathogenesis+of+Alzheimer's+disease.">Axonopathy and transport deficits early in the pathogenesis of Alzheimer's disease.</a> Science. 307 (5713), 1282-1288 (2005).</li><li>He, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GRK5+Deficiency+Leads+to+Selective+Basal+Forebrain+Cholinergic+Neuronal+Vulnerability.">GRK5 Deficiency Leads to Selective Basal Forebrain Cholinergic Neuronal Vulnerability.</a> Scientific Reports. 6, 26116 (2016).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lab+Animal+Research.+Anesthesia+Induction+and+Maintenance.">Lab Animal Research. Anesthesia Induction and Maintenance.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2019).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents.">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).</li><li>Mouton, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Unbiased Stereology-A Concise Guide. , (2011).</li><li>West, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+started+in+stereology.">Getting started in stereology.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2013 (4), 287-297 (2013).</li><li>West, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Space+Balls+Revisited:+Stereological+Estimates+of+Length+With+Virtual+Isotropic+Surface+Probes.">Space Balls Revisited: Stereological Estimates of Length With Virtual Isotropic Surface Probes.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 12, 49 (2018).</li><li>Nikolajsen, G. N., Kotynski, K. A., Jensen, M. S., West, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+the+capillary+network+of+aged+APPswe/PS1dE9+transgenic+mice.">Quantitative analysis of the capillary network of aged APPswe/PS1dE9 transgenic mice.</a> Neurobiology of Aging. 36 (11), 2954-2962 (2015).</li><li>Gutierrez-Jimenez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disturbances+in+the+control+of+capillary+flow+in+an+aged+APP(swe)/PS1DeltaE9+model+of+Alzheimer's+disease.">Disturbances in the control of capillary flow in an aged APP(swe)/PS1DeltaE9 model of Alzheimer's disease.</a> Neurobiology of Aging. 62, 82-94 (2018).</li><li>Gundersen, H. J., Jensen, E. B., Kieu, K., Nielsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+efficiency+of+systematic+sampling+in+stereology--reconsidered.">The efficiency of systematic sampling in stereology--reconsidered.</a> Journal of Microscopy. 193, 199-211 (1999).</li><li>Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+study+of+the+capillaries+within+the+white+matter+of+the+Tg2576+mouse+model+of+Alzheimer's+disease.">Quantitative study of the capillaries within the white matter of the Tg2576 mouse model of Alzheimer's disease.</a> Brain and Behavior. 9 (4), 01268 (2019).</li><li>McNeal, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unbiased+Stereological+Analysis+of+Reactive+Astrogliosis+to+Estimate+Age-Associated+Cerebral+White+Matter+Injury.">Unbiased Stereological Analysis of Reactive Astrogliosis to Estimate Age-Associated Cerebral White Matter Injury.</a> Journal of Neuropathology Experimental Neurology. 75 (6), 539-554 (2016).</li><li>Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Passive+(amyloid-beta)+immunotherapy+attenuates+monoaminergic+axonal+degeneration+in+the+AbetaPPswe/PS1dE9+mice.">Passive (amyloid-beta) immunotherapy attenuates monoaminergic axonal degeneration in the AbetaPPswe/PS1dE9 mice.</a> Journal of Alzheimer's Disease. 23 (2), 271-279 (2011).</li><li>Gagnon, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+Sprouting+of+Dopamine+and+Serotonin+Axons+in+the+Pallidum+of+Parkinsonian+Monkeys.">Evidence for Sprouting of Dopamine and Serotonin Axons in the Pallidum of Parkinsonian Monkeys.</a> Frontiers of Neuroanatomy. 12, 38 (2018).</li><li>Boncristiano, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholinergic+changes+in+the+APP23+transgenic+mouse+model+of+cerebral+amyloidosis.">Cholinergic changes in the APP23 transgenic mouse model of cerebral amyloidosis.</a> Journal of Neuroscience. 22 (8), 3234-3243 (2002).</li></ol>

여기서 우리는 우주볼(sphere) 프로브를 이용하여 NBM에서 콜린성 섬유의 밀도를 추정하는 방법을 입증한다. 이 프로브는 관심 영역의 총 섬유 길이를 추정합니다. 전체 길이는 섬유 밀도를 얻기 위해 영역의 부피에 의해 나눌 수 있다. 영역의 부피를 추정하기 위해 카발리에리 포인트 카운트 방법을 사용하였다. Cavalieri 포인트 카운트 방법은 모든 지역에 대한 3D 기준 볼륨의 편견없고 효율적인 추정...

뇌의 신경 섬유의 길이 및/또는 밀도의 정량적 추정은 신경 병리학 연구의 중요한 매개 변수입니다. 다양한 뇌 영역에서 콜린성, 도파민성 및 세로토닌성 축색의 길이는 종종 이 지역의 특정 기능과 상관관계가 있습니다. 이러한 축색의 분포는 일반적으로 이기종이기 때문에, 디자인 기반 의 입체학은 샘플링 하는 동안 바이어스를 피하기 위해 사용 됩니다. 입체학의 스페이스 볼 프로브는 관심 있는 영역에서 신경 섬유와 같은 라인형 구조의 효율적이고 신뢰할 수 있는 측정을 제공하도록 설계되었습니다1. 프로브는 조직에 체계적으로 부과되는 가상 구체를 만들어 프로브의 표면과 라인 교차점을 측정합니다. 분석을 위해 구체 프로브를 조직에 넣는 것은 불가능하기 때문에 시판되는 소프트웨어는 구 프로브의 표면을 나타내는 다양한 직경의 일련의 동심원인 가상 3차원(3D) 구를 제공합니다.
선택적 콜린성 신경변성은 알츠하이머병(AD)의 일관된 특징 중 하나이며2,3,4. 기능 장애 해 전송 AD에 인지 감소에 대 한 원인 요인으로 간주 됩니다. 해 기능 장애는 또한 파 킨 슨 병 등 다른 많은 정신 질환에서 분명 하다, 중독, 그리고 정신 분열 증. 해 신경 변성의 다른 양상은 동물 모델에서 연구된다 (예를 들어, 아세틸 콜린 감소5,ChAT 단백질6,아밀로이드 플라크 부근의 해 섬유 신경 변성6,해 섬유 및 시냅스 정맥류의 감소7,8). 섬유 변성은 신경 손실 보다 일찍 일어날 것으로 추정 된다, 해 신경 손실 은 항상 연구에서 관찰 되지 않기 때문에. 해 신경의 대부분은 기저 전뇌와 뇌 줄기에, 그리고 그들의 축색은 코르티메와 해마와 같은 다양한 뇌 영역에 프로젝트. NBM은 기저 전뇌에 위치하고 AD에서 일반적으로 영향을받는 뇌 영역 중 하나 인 것으로 나타났습니다.
입체학의 분획기 방법은 여러 수준에서 조직의 체계적인 무작위 샘플링을 기반으로합니다. 단면 샘플링 분율(SSF)은 스테레오로지의 분획기 방법에 대한 섹션의 비컴퓨터 기반의 체계적인 샘플링이다. 영역 샘플링 분율(ASF)은 섹션에서 관심 영역의 영역의 분획입니다. 두께 샘플링 분수(TSF)는 단면두께의 분수입니다. 스페이스 볼 프로브를 사용하면 분수 위치에서 3D 구의 관심 프로파일을 정량화할 수 있습니다. 여기서 우리는 마우스 뇌의 NBM에서 해 섬유의 총 길이의 추정을 위한 공간 볼 프로브를 사용하여 절차를 설명한다. 현재 프로토콜은 조직 처리, 입체학을 위한 샘플링 방법, ChAT 항체를 이용한 면역 조직화학적 염색, 마우스 뇌의 NBM에서 콜린성 섬유 길이 및 섬유 밀도를 추정하기 위한 편견 없는 입체학에 대한 세부 정보를 제공합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ABC kit</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>PK6100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-ChAT Antibody</td>
			<td>Millipore, MA, USA</td>
			<td>AB144P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine anti-goat IgG-B</td>
			<td>Santacruz Biotechnology</td>
			<td>SC-2347</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum, Adult</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>B9433</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Lieca Microsystems, Buffalo Grove, IL, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>D5652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene Glycol</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>324558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>G2025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>H1009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immpact-DAB kit</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>SK4105</td>
			<td>Enhanced DAB peroxidase substrate solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Westward Pharmaceuticals, NJ, USA</td>
			<td>0143-9509-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Lieca Microsystems, Buffalo Grove, IL, USA</td>
			<td>AF6000</td>
			<td>Equipped with motorized stage and IMI-tech color digital camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optimum cutting temperature (O.C.T.) embedding medium</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences, PA, USA</td>
			<td>62550-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permount mounting medium</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences, PA, USA</td>
			<td>17986-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereologer Software</td>
			<td>Stereology Resource Center, Inc. St. Petersburg, FL, USA</td>
			<td>Stereologer2000</td>
			<td>Installed on a Dell Desktop computer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma Base</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>T1503</td>
			<td>Tris base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>T5941</td>
			<td>Tris hydrochloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Bayer, Leverkusen, Germany</td>
			<td>Rompun</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylenes, Histological grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>534056</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stereological estimation of cholinergic fiber length in the nucleus basalis of meynert of the mouse brain

다양 한 뇌 영역에서 해 또는 다른 신경 축 색의 길이 종종 영역의 특정 기능과 상관. 입체학은 다양한 뇌 구조의 신경 프로필을 정량화하는 유용한 방법입니다. 여기에서 우리는 기저 전뇌의 Meynert (NBM)의 핵 기저에 있는 해 섬유의 총 길이를 추정하기 위하여 소프트웨어 기지를 둔 입체 프로토콜을 제공합니다. 이 메서드는 길이 추정에 대 한 공간 볼 프로브를 사용 합니다. 콜린성 섬유는 고추냉이 과산화 페멀티미노벤지딘(HRP-DAB) 검출 시스템으로 면역염색콜린 아세틸트랜스퍼라제(ChAT)에 의해 가시화된다. 염색 프로토콜은 또한 입체 소프트웨어를 사용하여 다양한 뇌 영역에서 섬유 및 세포 수 추정에 유효합니다. 입체 프로토콜은 담막염 섬유, 도파민성/카테콜라미네르균 섬유, 세로토닌섬유, 성상 세포 공정 또는 혈관 프로파일과 같은 선형 프로파일의 추정에 사용될 수 있습니다.

대표적인 결과는 표 1 및 도 5에나와 있다. APPswe 군(APP)으로 디코딩된 그룹 C는 야생형(WILD) 리터메이트에 비해 섬유길이(도 5B)및 섬유 길이 밀도(도5C)가현저히 낮았다. 그 결과 분석된 두 그룹 간의 NBM의 부피에는 유의한 차이가 없음을보여주었다(도 5A).
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Stereological Estimation of Cholinergic Fiber Length in the Nucleus Basalis of Meynert of the Mouse Brain

뇌 영역의 3차원 구조 내의 뉴런 섬유 길이는 특정 뉴런 구조적 무결성 또는 변성을 정량화하는 신뢰할 수 있는 파라미터이다. 본 문서는 예를 들어 마우스에서 Meynert의 핵 기저부 내에서 해 섬유 길이를 측정하는 입체 정량화 방법을 자세히 설명합니다.

마우스 뇌의 마이너트 핵 기저에서 콜린성 섬유 길이의 입체 추정

The length of cholinergic or other neuronal axons in various brain regions are often correlated with the specific function of the region. Stereology is a ...

많은 신경 장애에서 신경 절개는 신경 섬유 손실이 종종 세포 체손실 이전에 발생하는 만성 과정입니다. 3차원의 뉴런 섬유의 입체적 정량화는 조기 신경 퇴행성 변화를 검출하는 민감하고 정확한 방법을 제공합니다. 이 기술은 공간 공의 안정적이고 효율적인 컴퓨터 기반의 편견분획을 활용하여 3D의 뉴런 섬유와 같은 라인과 같은 구조의 길이를 측정합니다.절차를 시연하는 것은 포스트 닥터이자 스테레오로지 전문가인 Prabhakar Singh와 제 실험실의 연구 조교인 데이비드 펭(David Peng)이 할 것입니다. 마취 마우스에서 페달 반사에 대한 반응의 부족을 확인 한 후, 약 50 밀리리터의 얼음 차가운 0.1 어금니 DPBS와 트랜스 카디에 퍼퓨즈, 0.1 어금니 PBS에서 4 %의 PFA의 약 25 밀리리터가 그 뒤를 이었다. 관류의 끝에서, 4섭씨에서 24 시간 동안 신선한 4 % PFA의 용기에 뇌를 수정합니다.다음 날, 세척 당 신선한 DPBS에 3 1 ~ 2 분 세척으로 뇌를 세척하고 하룻밤 0.1 DPBS 솔루션에서 15 %의 자당으로 뇌를 전송합니다. 다음 아침, 뇌를 섭씨 30%, 어금니 DPBS 0.1을 섭씨 48시간 동안 넣습니다. 인큐베이션이 끝나면 뇌를 영하 20도까지 미리 설정된 극저온 챔버로 옮는다.뇌는 밀봉 된 튜브에 보관하고 영하 80도에서 보관 할 수 있습니다. 단면의 경우, 조직 샘플을 최적의 절삭 온도에 포함시키는 매체에 포함시키고 시편 디스크에 샘플을 장착한다. 그런 다음 극저온 평면의 관상 에서 직렬 30 마이크로 미터 두께의 섹션을 획득하여 각 섹션을 영하 20도 저장을 준비하기 위해 극저온 보호용 액트를 포함하는 24 웰 배양 판의 개별 우물로 옮기.각 뇌의 첫 번째 및 마지막 섹션을 식별하려면 형태학적 특징을 표준 마우스 뇌 아틀라스와 비교하십시오. NBM은 0.0 밀리미터를 뺀 브레그마에서 시작하여 영하 1.6밀리미터로 끝납니다. 모든 8분의 1의 섹션은 총 6~7개의 섹션을 생성하며 부피 및 섬유 길이 추정모두에 적절한 오류 계수를 허용합니다.조직 섹션의 면역조직화학적 라벨링의 경우, Tris 완충식식염수에서 0.1%트리톤 X-100의 정상 소 혈청이 10%로 임의의 비특이적 결합을 차단한 후, 48섭씨에서 48시간 동안 1차 적시 항체로 단면을 라벨링한다. 인큐베이션이 끝나면 세척당 신선한 트리버퍼식염수로 3분간 3분간 세척한 다음 실온에서 1시간 동안 적절한 생체 개화 된 이차 항체를 배양합니다. 인큐베이션의 끝에서, 설명대로 신선한 트리버퍼식 식염수로 섹션을 세 번 세척하고, 제조 업체의 프로토콜에 따라 아비딘 비오틴 과옥시다제 복합체 및 DAB peroxidase 기판 용액으로 염색하는 다음.세척 후, 하나의 뇌 조직 샘플에서 모든 섹션을 하나의 젤라틴 슬라이드에 장착하고 샘플을 공기 건조시킬 수 있도록합니다. 단면을 탈수하려면 표시된 대로 순차적인 오름차순 에탄올 용액에 희석당 5분 동안 샘플을 두 번 담그고 10분 자일렌 세차2개로 치우게 합니다. 그런 다음 적절한 장착 매체를 사용하여 커버립을 슬라이드에 배치합니다.입체학의 경우 소프트웨어에 대한 새로운 연구를 엽니 다. 스터디 초기화 대화 상자가 열립니다. 학습 정보를 작성하고 다단계 분획 기반이 선택되어 있는지 확인합니다.볼륨을 두 번 클릭하여 볼륨 대화 상자를 엽니다. 관심 기능이름을 지정하고 지역 점 계산 프로브를 선택하고 다음을 클릭합니다. 길이를 두 번 클릭하고 피쳐 이름을 제공합니다.구 프로브를 선택하고 다음을 클릭합니다. 이 경우 초기화 상자에서 스터디를 시작하기 전에 그룹을 코딩하려면 관심 영역을 포함하는 첫 번째 섹션에서 시작하여 관심 영역과 섹션 샘플링 간격을 포함하는 마지막 섹션으로 시작하여 총 섹션 수를 8개로 설정합니다. 다음을 클릭하여 지역 선택 및 볼륨 추정에 대한 가장 낮은 배율을 자동으로 설정하고 설정을 확인하는 프로브 초기화 대화 상자를 엽니다.미리 보기를 클릭하여 선택한 하위 배율에서 관심 영역을 식별할 수 있는지 확인합니다. 지역 볼륨 분획에 대해 점당 50, 000 마이크로미터 큐브를 입력하고 미리 보기를 클릭하고 완료합니다. 개체 높은 배율하에서 길이를 63X로 설정하고 길이를 두 번 클릭하여 길이 구 대화 상자를 엽니다.이 구의 직경을 10 마이크로미터로 설정하고 완료한 것을 클릭합니다. 프레임 영역, 프레임 높이, 가드 존 및 프레임 간격에 적합한 값을 설정합니다. 그런 다음 다음을 클릭하고 소프트웨어에서 제공하는 지침을 따릅니다.첫 번째 섹션을 삽입하려면 슬라이드를 5X 목표 아래에 현미경 단계에 배치하고 녹색 화살표를 클릭하여 NBM 주위에 임의의 경계를 그려 관심 영역을 정의합니다. 녹색 화살표를 클릭하고 현재 분획의 섬유 측정을 얻기 위해 63X 목표를 변경합니다. 단면 두께 대화 상자가 나타납니다.섹션의 위쪽 및 아래쪽 표면을 설정하여 수동 z축 포커스 노브를 사용하여 섹션의 실제 두께를 측정하고 완료된 클릭합니다. z축을 섹션의 프레임 높이에서 위에서 아래로 천천히 이동하여 가상 구 프로브의 표면에 교차하는 모든 섬유를 표시합니다. 모든 섬유가 표시되면 다음 위치로 진행하려면 옆을 클릭합니다.모든 분수가 완료되면 녹색 화살표를 클릭합니다. 소프트웨어는 다음 섹션을 삽입하도록 요청합니다. 5X 목표를 사용하여 슬라이드에 다음 샘플을 초점으로 가져와 서 방금 설명한 대로 섬유 측정을 반복합니다.모든 섹션을 측정하면 소프트웨어가 오류 값계수를 표시하는 경우에 대한 결과를 생성합니다. 오류 계수가 허용되는 경우 다음 서비스 케이스로 진행합니다. 오류 계수를 허용하지 않으면 소프트웨어는 일부 매개 변수를 변경하는 권장 사항을 제공합니다.모든 사례가 완료되면 각 서비스 케이스 및 그룹에 대한 결과를 생성합니다. 본 대표적인 실험에서, 스웨덴 돌연변이 베타 아밀로이드 전구체 단백질 그룹은 야생형 쓰레기 메이트에 비해 섬유 길이와 섬유 길이 밀도가 현저히 낮았다. 결과는 또한 분석된 두 단 사이 NBM의 부피에 있는 유의한 다름이 없었다는 것을 보여주었습니다.이 기술은 올바른 방향에서 적절한 획득과 인큐베이션 기간의 좋은 염색 방법이 필요합니다. 입체 프로토콜은 다른 뉴런 섬유, 성상세포 공정 또는 혈관 프로파일과 같은 임의의 선형 프로파일의 추정에 사용될 수 있다.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

개발 마우스 배아의 피질 유사 분열의 라이브 영상

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

연구

신경과학

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol (TRAP) Assay

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol TRAP Assay

마우스 뇌의 다양한 지역에서 텔로 머라 제 활동 : 비 방사성 텔로 머라 제는 증폭 프로토콜을 반복 (TRAP) 분석

Telomerase, a ribonucleoprotein, is responsible for maintaining the telomere length and therefore promoting genomic integrity, proliferation, and ...

Analysis of Gene Expression Changes in the Rat Hippocampus After Deep Brain Stimulation of the Anterior Thalamic Nucleus

전방 시상 핵의 깊은 뇌 자극 후 쥐 해마의 유전자 발현 변화 분석

Deep brain stimulation (DBS) surgery, targeting various regions of the brain such as the basal ganglia, thalamus, and subthalamic regions, is an effective ...

Stereotaxic Infusion of Oligomeric Amyloid-beta into the Mouse Hippocampus

마우스 해마에 올리고머 아밀로이드 - 베타의 정위 주입

Alzheimer&#8217;s disease is a neurodegenerative disease affecting the aging population. A key neuropathological feature of the disease is the ...

Live Imaging of the Ependymal Cilia in the Lateral Ventricles of the Mouse Brain

마우스 뇌의 좌우 심실의 뇌실막 섬모의 라이브 영상

Multiciliated ependymal cells line the ventricles in the adult brain. Abnormal function or structure of ependymal cilia is associated with various ...

Microelectrode Guided Implantation of Electrodes into the Subthalamic Nucleus of Rats for Long-term Deep Brain Stimulation

미세 전극은 장기 깊은 뇌 자극 쥐의 Subthalamic 핵에 전극의 주입을 가이드

Deep brain stimulation (DBS) is a widely used and effective therapy for several neurologic disorders, such as idiopathic Parkinson&#8217;s disease, ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

급성 Hippocampal 조각에 작은 볼륨 재활용-, 관류-침수 형 챔버 시스템 유지에 시 냅 스가 소성을 기록

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

Stereological Estimation of Dopaminergic Neuron Number in the Mouse Substantia Nigra Using the Optical Fractionator and Standard Microscopy Equipment

광학 Fractionator 표준 현미경 장비를 사용 하 여 마우스 Substantia Nigra에서 Dopaminergic 신경 수 stereological 추정

In pre-clinical Parkinson&#39;s disease research, analysis of the nigrostriatal tract, including quantification of dopaminergic neuron loss within the ...