Name: stereological estimation of cholinergic fiber length in the nucleus basalis of meynert of the mouse brain
Uploaded: 2020-02-05T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Stereological Estimation of Cholinergic Fiber Length in the Nucleus Basalis of Meynert of the Mouse Brain at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av tilskudd til W.Z.S. fra Medical Research and Development Service, Department of Veterans Affairs (Merit Review 1I01 BX001067-01A2), Alzheimers Association (NPSPAD-11-202149), og ressurser fra Midtvesten Biomedical Forskningsstiftelsen.

Alle prosedyrer for bruk av disse dyrene har blitt godkjent av Kansas City Veterans Affairs Medical Center Institutional Animal Care and Use Committee. Atten måneder gamle mus overexpressing svensk mutant beta-amyloid forløper protein (APPswe) og deres C57/BL6 WT kullkamerater ble brukt til forsøkene. Detaljer om avl og genotyping er gitt i He et al.8.
1. Behandling av perfusjon og vev
<ol><li>Bedøve mus ved hjelp av en intraperitoneal injeksjon med ketamin (100 m...

<ol>
	<li>Mouton, P. R., Gokhale, A. M., Ward, N. L., West, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereological+length+estimation+using+spherical+probes.">Stereological length estimation using spherical probes.</a> Journal of Microscopy. 206, 54-64 (2002).</li><li>Whitehouse, P. J., Price, D. L., Clark, A. W., Long Coyle, J. T., DeLong, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alzheimer+disease:+evidence+for+selective+loss+of+cholinergic+neurons+in+the+nucleus+basalis.">Alzheimer disease: evidence for selective loss of cholinergic neurons in the nucleus basalis.</a> Annals of Neurology. 10 (2), 122-126 (1981).</li><li>Davies, P., Maloney, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+loss+of+central+cholinergic+neurons+in+Alzheimer's+disease.">Selective loss of central cholinergic neurons in Alzheimer's disease.</a> The Lancet. 2 (8000), 1403 (1976).</li><li>Bartus, R. T., Dean, R. L., Beer, B., Lippa, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cholinergic+hypothesis+of+geriatric+memory+dysfunction.">The cholinergic hypothesis of geriatric memory dysfunction.</a> Science. 217 (4558), 408-414 (1982).</li><li>Savonenko, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Episodic-like+memory+deficits+in+the+APPswe/PS1dE9+mouse+model+of+Alzheimer's+disease:+relationships+to+beta-amyloid+deposition+and+neurotransmitter+abnormalities.">Episodic-like memory deficits in the APPswe/PS1dE9 mouse model of Alzheimer's disease: relationships to beta-amyloid deposition and neurotransmitter abnormalities.</a> Neurobiology of Disease. 18 (3), 602-617 (2005).</li><li>Perez, S. E., Dar, S., Ikonomovic, M. D., DeKosky, S. T., Mufson, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholinergic+forebrain+degeneration+in+the+APPswe/PS1DeltaE9+transgenic+mouse.">Cholinergic forebrain degeneration in the APPswe/PS1DeltaE9 transgenic mouse.</a> Neurobiology of Disease. 28 (1), 3-15 (2007).</li><li>Stokin, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonopathy+and+transport+deficits+early+in+the+pathogenesis+of+Alzheimer's+disease.">Axonopathy and transport deficits early in the pathogenesis of Alzheimer's disease.</a> Science. 307 (5713), 1282-1288 (2005).</li><li>He, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GRK5+Deficiency+Leads+to+Selective+Basal+Forebrain+Cholinergic+Neuronal+Vulnerability.">GRK5 Deficiency Leads to Selective Basal Forebrain Cholinergic Neuronal Vulnerability.</a> Scientific Reports. 6, 26116 (2016).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lab+Animal+Research.+Anesthesia+Induction+and+Maintenance.">Lab Animal Research. Anesthesia Induction and Maintenance.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2019).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents.">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).</li><li>Mouton, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Unbiased Stereology-A Concise Guide. , (2011).</li><li>West, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+started+in+stereology.">Getting started in stereology.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2013 (4), 287-297 (2013).</li><li>West, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Space+Balls+Revisited:+Stereological+Estimates+of+Length+With+Virtual+Isotropic+Surface+Probes.">Space Balls Revisited: Stereological Estimates of Length With Virtual Isotropic Surface Probes.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 12, 49 (2018).</li><li>Nikolajsen, G. N., Kotynski, K. A., Jensen, M. S., West, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+the+capillary+network+of+aged+APPswe/PS1dE9+transgenic+mice.">Quantitative analysis of the capillary network of aged APPswe/PS1dE9 transgenic mice.</a> Neurobiology of Aging. 36 (11), 2954-2962 (2015).</li><li>Gutierrez-Jimenez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disturbances+in+the+control+of+capillary+flow+in+an+aged+APP(swe)/PS1DeltaE9+model+of+Alzheimer's+disease.">Disturbances in the control of capillary flow in an aged APP(swe)/PS1DeltaE9 model of Alzheimer's disease.</a> Neurobiology of Aging. 62, 82-94 (2018).</li><li>Gundersen, H. J., Jensen, E. B., Kieu, K., Nielsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+efficiency+of+systematic+sampling+in+stereology--reconsidered.">The efficiency of systematic sampling in stereology--reconsidered.</a> Journal of Microscopy. 193, 199-211 (1999).</li><li>Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+study+of+the+capillaries+within+the+white+matter+of+the+Tg2576+mouse+model+of+Alzheimer's+disease.">Quantitative study of the capillaries within the white matter of the Tg2576 mouse model of Alzheimer's disease.</a> Brain and Behavior. 9 (4), 01268 (2019).</li><li>McNeal, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unbiased+Stereological+Analysis+of+Reactive+Astrogliosis+to+Estimate+Age-Associated+Cerebral+White+Matter+Injury.">Unbiased Stereological Analysis of Reactive Astrogliosis to Estimate Age-Associated Cerebral White Matter Injury.</a> Journal of Neuropathology Experimental Neurology. 75 (6), 539-554 (2016).</li><li>Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Passive+(amyloid-beta)+immunotherapy+attenuates+monoaminergic+axonal+degeneration+in+the+AbetaPPswe/PS1dE9+mice.">Passive (amyloid-beta) immunotherapy attenuates monoaminergic axonal degeneration in the AbetaPPswe/PS1dE9 mice.</a> Journal of Alzheimer's Disease. 23 (2), 271-279 (2011).</li><li>Gagnon, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+Sprouting+of+Dopamine+and+Serotonin+Axons+in+the+Pallidum+of+Parkinsonian+Monkeys.">Evidence for Sprouting of Dopamine and Serotonin Axons in the Pallidum of Parkinsonian Monkeys.</a> Frontiers of Neuroanatomy. 12, 38 (2018).</li><li>Boncristiano, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholinergic+changes+in+the+APP23+transgenic+mouse+model+of+cerebral+amyloidosis.">Cholinergic changes in the APP23 transgenic mouse model of cerebral amyloidosis.</a> Journal of Neuroscience. 22 (8), 3234-3243 (2002).</li></ol>

Her viser vi en metode for å estimere tettheten av kolinerge fibre i NBM ved hjelp av en romkule (sfære) sonde. Denne sonden anslår den totale fiberlengden i området av interesse. Den totale lengden kan deles på volumet av regionen for å få fibertettheten. For å estimere volumet av regionen, ble Cavalieri point count-metoden brukt. Cavalieri point count-metoden er en objektiv og effektiv estimator av et 3D-referansevolum for alle regioner. Metoden beregner et estimat av området på en kuttoverflate av en seksjon...

Kvantitative estimater av lengde og/eller tetthet av nervefibre i hjernen er viktige parametere for nevropatologiske studier. Lengden på kolinerge, dopaminerge og serotonerge aksoner i ulike hjerneregioner er ofte korrelert med de spesifikke funksjonene i regionen. Fordi fordelingen av disse aksonene generelt er heterogen, brukes designbasert stereologi for å unngå skjevhet under prøvetaking. Romballsonden til stereologi er designet for å gi effektive og pålitelige tiltak av linjelignende strukturer som nevronale fibre i en region av interesse1. Sonden gjør en virtuell sfære som pålegges systematisk i vevet for å måle linjekryss med overflaten av sonden. Fordi det er umulig å sette sfæresonder i vevet for analyse, gir den kommersielt tilgjengelige programvaren en virtuell tredimensjonal (3D) sfære, som i utgangspunktet er en rekke konsentriske sirkler av ulike diametre som representerer overflaten av sfæresonden.
Selektiv kolinerg neurodegenerasjon er en av de konsekvente egenskapene til Alzheimers sykdom (AD)2,3,4. Dysfunksjonell kolinerg overføring regnes som en årsaksfaktor for kognitiv nedgang i AD. Kolinerg dysfunksjon er også tydelig i mange andre psykiske lidelser som Parkinsons, avhengighet og schizofreni. Ulike aspekter ved kolinerg nevrodegenerasjon studeres i dyremodeller (f.eks. reduksjon i acetylkolin5, ChAT protein6, kolinerge fiberneurodegenerasjon i nærheten av amyloid plakk6,og reduksjon i kolinerge fibre og synaptiske varikositeter7,8). Fiberdegenerasjon antas å finne sted tidligere enn nevronalt tap, fordi kolinerge nevronale tap ikke alltid observeres i studier. De fleste kolinerge nevronene er i basal forhjernen og hjernestammen, og deres aksoner projiserer til ulike hjerneregioner som kortices og hippocampus. NBM ligger i basal forebrain og funnet å være en av de allment berørte hjerneområdene i AD.
Den fraksjonatormetoden for stereologi er basert på systematisk tilfeldig prøvetaking av et vev på flere nivåer. Seksjonsprøvefraksjon (SSF) er den ikke-databaserte systematiske prøvetakingen av seksjoner for brøkmetoden for stereologi. Arealprøvetakingsfraksjon (ASF) er fraksjonering av et område av interesseområdet i delen. Tykkelse prøvetaking fraksjon (TSF) er fraksjoneringen av tykkelsen på en seksjon. Plassballsonden gjør det mulig for oss å kvantifisere profiler av interesse i en 3D-sfære på fraksjonerte steder. Her bruker vi en plass ball sonde for estimering av den totale lengden av kolinerge fibre i NBM av musen hjernen for å illustrere prosedyrene. Den nåværende protokollen gir detaljer om vevsbehandling, prøvetakingsmetoder for stereologi, immunohistokjemisk farging ved hjelp av ChAT-antistoffet, og objektiv stereologi for å estimere kolinerg fiberlengde og fibertetthet i NBM av musehjernen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ABC kit</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>PK6100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-ChAT Antibody</td>
			<td>Millipore, MA, USA</td>
			<td>AB144P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine anti-goat IgG-B</td>
			<td>Santacruz Biotechnology</td>
			<td>SC-2347</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum, Adult</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>B9433</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Lieca Microsystems, Buffalo Grove, IL, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>D5652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene Glycol</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>324558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>G2025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>H1009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immpact-DAB kit</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>SK4105</td>
			<td>Enhanced DAB peroxidase substrate solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Westward Pharmaceuticals, NJ, USA</td>
			<td>0143-9509-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Lieca Microsystems, Buffalo Grove, IL, USA</td>
			<td>AF6000</td>
			<td>Equipped with motorized stage and IMI-tech color digital camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optimum cutting temperature (O.C.T.) embedding medium</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences, PA, USA</td>
			<td>62550-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permount mounting medium</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences, PA, USA</td>
			<td>17986-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereologer Software</td>
			<td>Stereology Resource Center, Inc. St. Petersburg, FL, USA</td>
			<td>Stereologer2000</td>
			<td>Installed on a Dell Desktop computer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma Base</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>T1503</td>
			<td>Tris base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>T5941</td>
			<td>Tris hydrochloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Bayer, Leverkusen, Germany</td>
			<td>Rompun</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylenes, Histological grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>534056</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stereological estimation of cholinergic fiber length in the nucleus basalis of meynert of the mouse brain

Lengden på kolinerge eller andre nevronale aksoner i ulike hjerneregioner er ofte korrelert med den spesifikke funksjonen i regionen. Stereologi er en nyttig metode for å kvantifisere nevronale profiler av ulike hjernestrukturer. Her gir vi en programvarebasert stereologiprotokoll for å estimere den totale lengden på kolinerge fibre i kjernen basalis av Meynert (NBM) av basal forebrain. Metoden bruker en plass ball sonde for lengde estimater. Kolinerge fibre visualiseres av kolin acetyltransferase (ChAT) immunstaining med pepperrot peroksidase-diaminobenzidin (HRP-DAB) deteksjonssystem. Fargeprotokollen er også gyldig for fiber- og cellenummerestimering i ulike hjerneregioner ved hjelp av stereologiprogramvare. Stereologiprotokollen kan brukes til estimering av lineære profiler som kolinoceptive fibre, dopaminerge/ katekollaminerge fibre, serotonergiske fibre, astrocyttprosesser eller til og med vaskulære profiler.

Representative resultater vises i tabell 1 og figur 5. Gruppe C, som ble dekodet som APPswe group (APP), hadde betydelig lavere fiberlengde (figur 5B) og fiberlengdetetthet (figur 5C) sammenlignet med deres ville type (WILD) kullkamerater. Resultatene viste at det ikke var noen signifikant forskjell i volumet av NBM mellom de to gruppene som ble analysert (figur...

Watch this Scientific Journal Video about Stereological Estimation of Cholinergic Fiber Length in the Nucleus Basalis of Meynert of the Mouse Brain at JoVE.com

Stereological Estimation of Cholinergic Fiber Length in the Nucleus Basalis of Meynert of the Mouse Brain

Neuronal fiber lengde innenfor en tredimensjonal struktur av en hjerneregion er en pålitelig parameter for å kvantifisere spesifikk nevronal strukturell integritet eller degenerasjon. Denne artikkelen beskriver en stereologisk kvantifiseringsmetode for å måle kolinerge fiberlengde innenfor kjernen basalis av Meynert hos mus som et eksempel.

Stereologisk estimering av kolinerge fiberlengde i nucleus basalis av Meynert av mushjernen

The length of cholinergic or other neuronal axons in various brain regions are often correlated with the specific function of the region. Stereology is a ...

Neurodenegration i mange nevrologiske lidelser er en kronisk prosess hvorav nevronal fibertap ofte oppstår før cellekroppstapet. Den stereologiske kvantifiseringen av nevronale fibre i tre dimensjoner gir en følsom og nøyaktig metode for å oppdage tidlig nevrodegenerativ endring. Denne teknologien benytter pålitelig og effektiv databasert objektiv brøkdel av plass baller for å måle lengdene på linjelignende strukturer som nevronale fibre i 3D.Demonstrere prosedyren vil bli gjort av Prabhakar Singh, en post-doc og vår ekspert på stereology, og David Peng, forskningsassistent i laboratoriet mitt. Etter å ha bekreftet mangel på respons på pedalrefleks i den bedøvede musen, transkardiolenpere med ca. 50 milliliter iskalde 0,1 molar DPBS, etterfulgt av ca. 25 milliliter på 4% PFA i 0,1 molar PBS. På slutten av perfusjonen, post-fikse hjernen i en beholder med friske 4% PFA i 24 timer ved fire grader Celsius.Neste dag, vask hjernen med tre en til to-minutters vasker i friske DPBS per vask og overfør hjernen til en 15% sukrose i 0,1 DPBS-løsning over natten. Neste morgen, plasser hjernen i en 30% sukroseløsning og 0,1 molar DPBS i 48 timer ved fire grader Celsius. På slutten av inkubasjonen, overfør hjernen til et kryotomikammer forhåndsinnsett til minus 20 grader Celsius.Hjerner kan holdes i forseglede rør og lagres ved minus 80 grader Celsius. For snitting, bygg inn vevsprøven i optimal skjæretemperaturinnbyggingsmedium og monter prøven på en prøveplate. Deretter skaffe serie 30 mikrometer tykke seksjoner i en koronarplan i kryotomien, overføre hver seksjon til individuelle brønner av en 24-brønns kulturplate som inneholder kryobeskyttende løsning som forberedelse til minus 20 grader Celsius lagring.For å identifisere de første og siste delene av hver hjerne, sammenlign de morfologiske egenskapene med et standard mushjerneatlas. NBM begynner på bregma minus 0,0 millimeter og slutter på minus 1,6 millimeter. Valget av hver åttende del gir totalt seks til syv seksjoner og tillater en passende feilkoeffisient for både en volum- og fiberlengdeestimering.For immunohistokjemisk merking av vevsseksjonene, etter å ha blokkert enhver uspesifikk binding med 10% normalt storfeserum i 0,1% Triton X-100 i Tris-bufret saltvann, merk seksjonene med det primære antistoffet av interesse i 48 timer ved fire grader Celsius. På slutten av inkubasjonen, vask seksjonene tre ganger i tre minutter i fersk Tris-bufret saltvann per vask, etterfulgt av inkubasjon med et passende biotinylert sekundært antistoff i en time ved romtemperatur. På slutten av inkubasjonen vask seksjonene tre ganger i fersk Tris-bufret saltvann som demonstrert, etterfulgt av farging med Avidin biotin peroxidase kompleks og DAB peroxidase substrat løsning i henhold til produsentens protokoller.Etter vask monterer du alle seksjonene fra en hjernevevsprøve på en gelatinisert lysbilde og lar prøvene lufttørke. For å dehydrere seksjonene, senk prøvene to ganger i fem minutter per fortynning i sekvensielle stigende etanolløsninger som angitt, etterfulgt av rydding med to 10-minutters xylenvasker. Bruk deretter et passende monteringsmedium for å plassere dekkglass på lysbildene.For stereology, åpne en ny studie i programvaren. En dialogboks for initialisering av studier åpnes. Fyll ut studieinformasjonen og bekreft at brøkbasert basert på flere nivåer er valgt.Dobbeltklikk på volum for å åpne volumdialogboksen. Gi navn til funksjonen av interesse, og velg tellesonden for regionpunktet, og klikk neste. Dobbeltklikk på lengden og oppgi et navn på funksjonen.Velg sfæresonde og klikk neste. Hvis du vil kode gruppene før studien startes, angir du totalt antall seksjoner fra den første delen som inneholder interesseområdet for den siste delen som inneholder interesseområdet og seksjonsprøveintervallet til åtte. Klikk ved siden av for å åpne dialogboksen for initialisering av sonde som automatisk angir den laveste forstørrelsen for områdevalget og volumestimeringen og bekrefter innstillingene.Klikk forhåndsvisning for å kontrollere om interesseområdet kan identifiseres ved den valgte nedre forstørrelsen. Skriv inn 50 000 mikrometer kube per punkt for områdevolumfraksjonen, og klikk forhåndsvisning og ferdig. Under objekthøy forstørrelse angir du lengden til 63X og dobbeltklikker lengden for å åpne dialogboksen lengdesfære.Sett diameteren på denne sfæren til 10 mikrometer og klikk ferdig. Angi passende verdier for rammeområdet, bildehøyden, beskyttelsessonen og rammeavstanden. Klikk deretter neste og følg instruksjonene fra programvaren.Hvis du vil sette inn den første inndelingen, plasserer du lysbildet på fasen av mikroskopet under et 5X-mål og klikker på den grønne pilen for å tegne en vilkårlig grense rundt NBM for å definere interesseområdet. Klikk på den grønne pilen og gjør for å endre 63X-målet for å oppnå fibermålingene for gjeldende brøk. Dialogboksen For inndelingstykkelse vises.Still inn den øverste og nedre overflaten av seksjonen for å måle den faktiske tykkelsen på seksjonen ved hjelp av den manuelle z-aksefokusknappen og klikk ferdig. Flytt z-aksen sakte fra topp til bunn i rammen høyde av seksjonen for å markere alle kryssende fibre på overflaten av den virtuelle sfære sonde. Når alle fibrene er merket, klikker du ved siden av for å gå videre til neste sted.Når alle brøkene er fullført, klikker du den grønne pilen. Programvaren vil be om å få neste del satt inn. Ta den neste prøven på lysbildet i fokus ved hjelp av 5X-målet og gjenta fibermålingen som nettopp demonstrert.Når alle delene er målt, vil programvaren generere et resultat for saken som viser koeffisienten til feilverdier. Hvis feilkoeffisienten er akseptabel, går du videre til neste sak. Hvis feilkoeffisienten ikke er akseptabel, vil programvaren gi anbefalinger om å endre noen av parametrene.Når alle sakene er fullført, genererer du resultater for hvert tilfelle og hver gruppe. I dette representative eksperimentet demonstrerte den svenske mutant beta amyloid forløperproteingruppen en betydelig lavere fiberlengde og fiberlengdetetthet sammenlignet med deres villtype søppelkamerater. Resultatene viste også at det ikke var noen signifikant forskjell i volumet av NBM mellom de to gruppene som ble analysert.Denne teknikken krever riktig oppkjøp i riktig retning og en god fargingsmetode med inkubasjonsperioden. Stereologi protokollen kan brukes til estimering av noen lineære profiler som andre nevronale fibre, astrocytt prosesser, eller til og med vaskulære profiler.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

Levende Imaging av Mitosis i utviklings Mouse Embryonic Cortex

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol (TRAP) Assay

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol TRAP Assay

Telomerase aktivitet i de ulike regionene i Mouse Brain: ikke-radioaktive Telomerase Gjenta Amplification Protocol (TRAP) Assay

Telomerase, a ribonucleoprotein, is responsible for maintaining the telomere length and therefore promoting genomic integrity, proliferation, and ...

Analysis of Gene Expression Changes in the Rat Hippocampus After Deep Brain Stimulation of the Anterior Thalamic Nucleus

Analyse av genuttrykk Endringer i Rat Hippocampus Etter dyp hjernestimulering av fremre talamiske Nucleus

Deep brain stimulation (DBS) surgery, targeting various regions of the brain such as the basal ganglia, thalamus, and subthalamic regions, is an effective ...

Stereotaxic Infusion of Oligomeric Amyloid-beta into the Mouse Hippocampus

Stereotaksisk Infusjon av Oligomeric amyloid-beta i musen Hippocampus

Alzheimer&#8217;s disease is a neurodegenerative disease affecting the aging population. A key neuropathological feature of the disease is the ...

Live Imaging of the Ependymal Cilia in the Lateral Ventricles of the Mouse Brain

Live-Imaging av Ependymal Cilia i sideventriklene av Mouse Brain

Multiciliated ependymal cells line the ventricles in the adult brain. Abnormal function or structure of ependymal cilia is associated with various ...

Microelectrode Guided Implantation of Electrodes into the Subthalamic Nucleus of Rats for Long-term Deep Brain Stimulation

Microelectrode Guidet Implantasjon av elektroder inn subthalamic Nucleus av Rats for Long-term dyp hjernestimulering

Deep brain stimulation (DBS) is a widely used and effective therapy for several neurologic disorders, such as idiopathic Parkinson&#8217;s disease, ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Innspillingen synaptiske plastisitet i akutt hippocampus skiver vedlikeholdes i en liten volum resirkulering-, perfusjon og neddykking-type kammer System

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

Stereological Estimation of Dopaminergic Neuron Number in the Mouse Substantia Nigra Using the Optical Fractionator and Standard Microscopy Equipment

Stereological estimering av Dopaminergic Neuron nummer i musen Substantia Nigra optiske Fractionator og Standard mikroskopi utstyr

In pre-clinical Parkinson&#39;s disease research, analysis of the nigrostriatal tract, including quantification of dopaminergic neuron loss within the ...