Name: stereological estimation of cholinergic fiber length in the nucleus basalis of meynert of the mouse brain
Uploaded: 2020-02-05T12:00:00
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Este trabalho foi apoiado por subsídios à W.Z.S. do Serviço de Pesquisa e Desenvolvimento Médico, Departamento de Assuntos de Veteranos (Revisão de Mérito 1I01 BX001067-01A2), associação de Alzheimer (NPSPAD-11-202149) e recursos do Midwest Biomedical Fundação de Pesquisa.

Todos os procedimentos para o uso desses animais foram aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais Institucionais do Centro de Idosos de Kansas City. Camundongos de 18 meses de idade superexpressam proteína precursora beta-amilóide sueca (APPswe) e seus companheiros de lixo C57/BL6 WT foram usados para os experimentos. Detalhes da reprodução e genotipagem são dados em He et al.8.
1. Perfusão e processamento de tecidos
<ol><li>Camundongos anestesiados uti...

<ol>
	<li>Mouton, P. R., Gokhale, A. M., Ward, N. L., West, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereological+length+estimation+using+spherical+probes.">Stereological length estimation using spherical probes.</a> Journal of Microscopy. 206, 54-64 (2002).</li><li>Whitehouse, P. J., Price, D. L., Clark, A. W., Long Coyle, J. T., DeLong, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alzheimer+disease:+evidence+for+selective+loss+of+cholinergic+neurons+in+the+nucleus+basalis.">Alzheimer disease: evidence for selective loss of cholinergic neurons in the nucleus basalis.</a> Annals of Neurology. 10 (2), 122-126 (1981).</li><li>Davies, P., Maloney, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+loss+of+central+cholinergic+neurons+in+Alzheimer's+disease.">Selective loss of central cholinergic neurons in Alzheimer's disease.</a> The Lancet. 2 (8000), 1403 (1976).</li><li>Bartus, R. T., Dean, R. L., Beer, B., Lippa, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cholinergic+hypothesis+of+geriatric+memory+dysfunction.">The cholinergic hypothesis of geriatric memory dysfunction.</a> Science. 217 (4558), 408-414 (1982).</li><li>Savonenko, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Episodic-like+memory+deficits+in+the+APPswe/PS1dE9+mouse+model+of+Alzheimer's+disease:+relationships+to+beta-amyloid+deposition+and+neurotransmitter+abnormalities.">Episodic-like memory deficits in the APPswe/PS1dE9 mouse model of Alzheimer's disease: relationships to beta-amyloid deposition and neurotransmitter abnormalities.</a> Neurobiology of Disease. 18 (3), 602-617 (2005).</li><li>Perez, S. E., Dar, S., Ikonomovic, M. D., DeKosky, S. T., Mufson, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholinergic+forebrain+degeneration+in+the+APPswe/PS1DeltaE9+transgenic+mouse.">Cholinergic forebrain degeneration in the APPswe/PS1DeltaE9 transgenic mouse.</a> Neurobiology of Disease. 28 (1), 3-15 (2007).</li><li>Stokin, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonopathy+and+transport+deficits+early+in+the+pathogenesis+of+Alzheimer's+disease.">Axonopathy and transport deficits early in the pathogenesis of Alzheimer's disease.</a> Science. 307 (5713), 1282-1288 (2005).</li><li>He, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GRK5+Deficiency+Leads+to+Selective+Basal+Forebrain+Cholinergic+Neuronal+Vulnerability.">GRK5 Deficiency Leads to Selective Basal Forebrain Cholinergic Neuronal Vulnerability.</a> Scientific Reports. 6, 26116 (2016).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lab+Animal+Research.+Anesthesia+Induction+and+Maintenance.">Lab Animal Research. Anesthesia Induction and Maintenance.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2019).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents.">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).</li><li>Mouton, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Unbiased Stereology-A Concise Guide. , (2011).</li><li>West, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+started+in+stereology.">Getting started in stereology.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2013 (4), 287-297 (2013).</li><li>West, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Space+Balls+Revisited:+Stereological+Estimates+of+Length+With+Virtual+Isotropic+Surface+Probes.">Space Balls Revisited: Stereological Estimates of Length With Virtual Isotropic Surface Probes.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 12, 49 (2018).</li><li>Nikolajsen, G. N., Kotynski, K. A., Jensen, M. S., West, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+the+capillary+network+of+aged+APPswe/PS1dE9+transgenic+mice.">Quantitative analysis of the capillary network of aged APPswe/PS1dE9 transgenic mice.</a> Neurobiology of Aging. 36 (11), 2954-2962 (2015).</li><li>Gutierrez-Jimenez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disturbances+in+the+control+of+capillary+flow+in+an+aged+APP(swe)/PS1DeltaE9+model+of+Alzheimer's+disease.">Disturbances in the control of capillary flow in an aged APP(swe)/PS1DeltaE9 model of Alzheimer's disease.</a> Neurobiology of Aging. 62, 82-94 (2018).</li><li>Gundersen, H. J., Jensen, E. B., Kieu, K., Nielsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+efficiency+of+systematic+sampling+in+stereology--reconsidered.">The efficiency of systematic sampling in stereology--reconsidered.</a> Journal of Microscopy. 193, 199-211 (1999).</li><li>Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+study+of+the+capillaries+within+the+white+matter+of+the+Tg2576+mouse+model+of+Alzheimer's+disease.">Quantitative study of the capillaries within the white matter of the Tg2576 mouse model of Alzheimer's disease.</a> Brain and Behavior. 9 (4), 01268 (2019).</li><li>McNeal, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unbiased+Stereological+Analysis+of+Reactive+Astrogliosis+to+Estimate+Age-Associated+Cerebral+White+Matter+Injury.">Unbiased Stereological Analysis of Reactive Astrogliosis to Estimate Age-Associated Cerebral White Matter Injury.</a> Journal of Neuropathology Experimental Neurology. 75 (6), 539-554 (2016).</li><li>Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Passive+(amyloid-beta)+immunotherapy+attenuates+monoaminergic+axonal+degeneration+in+the+AbetaPPswe/PS1dE9+mice.">Passive (amyloid-beta) immunotherapy attenuates monoaminergic axonal degeneration in the AbetaPPswe/PS1dE9 mice.</a> Journal of Alzheimer's Disease. 23 (2), 271-279 (2011).</li><li>Gagnon, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+Sprouting+of+Dopamine+and+Serotonin+Axons+in+the+Pallidum+of+Parkinsonian+Monkeys.">Evidence for Sprouting of Dopamine and Serotonin Axons in the Pallidum of Parkinsonian Monkeys.</a> Frontiers of Neuroanatomy. 12, 38 (2018).</li><li>Boncristiano, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholinergic+changes+in+the+APP23+transgenic+mouse+model+of+cerebral+amyloidosis.">Cholinergic changes in the APP23 transgenic mouse model of cerebral amyloidosis.</a> Journal of Neuroscience. 22 (8), 3234-3243 (2002).</li></ol>

Aqui demonstramos um método para estimar a densidade de fibras cholinergic no NBM usando uma sonda de esfera espacial (esfera). Esta sonda estima o comprimento total da fibra na região de interesse. O comprimento total pode ser dividido pelo volume da região para obter a densidade da fibra. Para estimar o volume da região, utilizou-se o método de contagem de pontos Cavalieri. O método de contagem de pontos Cavalieri é um estimador imparcial e eficiente de um volume de referência 3D para qualquer região. O métod...

Estimativas quantitativas de comprimento e/ou densidade de fibras nervosas no cérebro são parâmetros importantes de estudos neuropatológicos. O comprimento dos axônhonas cholinergicgic, dopaminergice e sorotonergicos em várias regiões cerebrais são frequentemente correlacionados com as funções específicas da região. Como a distribuição desses axôlos é geralmente heterogênea, a estereorologia baseada em design é usada para evitar viés durante a amostragem. A sonda de bola espacial da estereorologia foi projetada para fornecer medidas eficientes e confiáveis de estruturas semelhantes a linhas, como fibras neuronais em uma região de interesse1. A sonda faz uma esfera virtual que é imposta sistematicamente no tecido para medir intersecções de linha com a superfície da sonda. Por ser impossível colocar sondas de esfera no tecido para análise, o software comercialmente disponível fornece uma esfera virtual tridimensional (3D), que é basicamente uma série de círculos concêntricos de vários diâmetros que representam a superfície da sonda esfera.
A neurodegeneração colinérgica seletiva é uma das características consistentes da doença de Alzheimer (AD)2,3,4. A transmissão colinérgica disfuncional é considerada um fator causal para o declínio cognitivo em AD. A disfunção colinérgica também é evidente em muitos outros transtornos mentais, como Parkinson, vício e esquizofrenia. Diferentes aspectos da neurodegeneração cholinergicsão são estudados em modelos animais (por exemplo, redução na acetilcolina5,proteína ChAT6,neurodegeneração de fibras cholinergicas nas proximidades de placas amiloides6, e diminuição em fibras cholinergic e varicos sinápticos7,8). Acredita-se que a degeneração da fibra ocorra antes da perda neuronal, porque a perda neuronal cholinergica nem sempre é observada em estudos. A maioria dos neurônios colinérgicos estão no cérebro basal e no tronco cerebral, e seus axôlos projetam para várias regiões cerebrais, como os cortices e o hipocampo. O NBM está situado no cérebro basal e descobriu-se ser uma das áreas cerebrais comumente afetadas em D.C.
O método fracionário da estereologia baseia-se na amostragem aleatória sistemática de um tecido em múltiplos níveis. A fração amostral de seção (SSF) é a amostragem sistemática não baseada em computador de seções para o método fracionário de estereology. A fração amostral de área (ASF) é a fracionamento de uma área da região de interesse no trecho. Fração amostral de espessura (TSF) é a fracionamento da espessura de uma seção. A sonda de bola espacial nos permite quantificar perfis de interesse em uma esfera 3D em locais fracionados. Aqui usamos uma sonda de bola espacial para estimar o comprimento total das fibras cholinergic no NBM do cérebro do rato para ilustrar os procedimentos. O protocolo atual fornece detalhes sobre processamento de tecidos, métodos de amostragem para estereology, coloração imunohistoquímica usando o anticorpo ChAT e estereorologia imparcial para estimar o comprimento da fibra cholinergice e a densidade de fibras no NBM do cérebro do rato.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ABC kit</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>PK6100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-ChAT Antibody</td>
			<td>Millipore, MA, USA</td>
			<td>AB144P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine anti-goat IgG-B</td>
			<td>Santacruz Biotechnology</td>
			<td>SC-2347</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum, Adult</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>B9433</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Lieca Microsystems, Buffalo Grove, IL, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>D5652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene Glycol</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>324558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>G2025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>H1009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immpact-DAB kit</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>SK4105</td>
			<td>Enhanced DAB peroxidase substrate solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Westward Pharmaceuticals, NJ, USA</td>
			<td>0143-9509-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Lieca Microsystems, Buffalo Grove, IL, USA</td>
			<td>AF6000</td>
			<td>Equipped with motorized stage and IMI-tech color digital camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optimum cutting temperature (O.C.T.) embedding medium</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences, PA, USA</td>
			<td>62550-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permount mounting medium</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences, PA, USA</td>
			<td>17986-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereologer Software</td>
			<td>Stereology Resource Center, Inc. St. Petersburg, FL, USA</td>
			<td>Stereologer2000</td>
			<td>Installed on a Dell Desktop computer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma Base</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>T1503</td>
			<td>Tris base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>T5941</td>
			<td>Tris hydrochloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Bayer, Leverkusen, Germany</td>
			<td>Rompun</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylenes, Histological grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>534056</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stereological estimation of cholinergic fiber length in the nucleus basalis of meynert of the mouse brain

O comprimento de axônons cholinergic ou outros axônticos neuronais em várias regiões cerebrais são frequentemente correlacionados com a função específica da região. A estereologia é um método útil para quantificar perfis neuronais de várias estruturas cerebrais. Aqui fornecemos um protocolo de estereorologia baseado em software para estimar o comprimento total das fibras colinérgicas no núcleo basalis de Meynert (NBM) do cérebro do forebrain basal. O método usa uma sonda de bola espacial para estimativas de comprimento. As fibras colinérgicas são visualizadas pelo sistema de detecção de acetiltransferase de colina (ChAT) com o sistema de detecção de peroxidase-diaminobenzidina (HRP-DAB). O protocolo de coloração também é válido para estimativa de fibras e números de células em várias regiões cerebrais usando software de estereologia. O protocolo de estereorologia pode ser usado para estimativa de quaisquer perfis lineares, como fibras colececeptivas, fibras dopaminérgicas/catecolaminergicas, fibras sorotonergicas, processos ascicitos ou até mesmo perfis vasculares.

Os resultados representativos são mostrados na Tabela 1 e Figura 5. O Grupo C, que foi decodificado como APPswe Group (APP), teve comprimento de fibra significativamente menor (Figura 5B) e densidade de comprimento de fibra(Figura 5C) em comparação com seus companheiros de lixo tipo selvagem (WILD). Os resultados mostraram que não houve diferença significativa no volume do NBM ...

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Stereological Estimation of Cholinergic Fiber Length in the Nucleus Basalis of Meynert of the Mouse Brain

O comprimento da fibra neuronal dentro de uma estrutura tridimensional de uma região cerebral é um parâmetro confiável para quantificar a integridade estrutural neuronal específica ou a degeneração. Este artigo detalha um método de quantificação estereológica para medir o comprimento da fibra cholinergicdentro do núcleo basalis de Meynert em camundongos como exemplo.

Estimativa estereológica do comprimento da fibra cholinergica no Núcleo Basalis de Meynert do Cérebro do Rato

The length of cholinergic or other neuronal axons in various brain regions are often correlated with the specific function of the region. Stereology is a ...

Neurodengração em muitas doenças neurológicas é um processo crônico do qual a perda de fibras neuronais ocorre frequentemente antes da perda do corpo celular. A quantificação esterológica das fibras neuronais em três dimensões fornece um método sensível e preciso para detectar mudanças neurodegenerativas precoces. Esta tecnologia utiliza o fracionamento imparcial confiável e eficiente baseado em computador de bolas espaciais para medir os comprimentos de estruturas semelhantes a linhas, como fibras neuronais em 3D.Demonstrar que o procedimento será feito por Prabhakar Singh, um pós-doutor e nosso especialista em estereologia, e David Peng, o assistente de pesquisa do meu laboratório. Após confirmar a falta de resposta ao reflexo do pedal no camundongo anestesiado, perfuse transcardialmente com aproximadamente 50 mililitros de gelo frio 0,1 molar DPBS, seguido por aproximadamente 25 mililitros de 4% PFA em PBS molar. No final da perfusão, pós-fixar o cérebro em um recipiente de 4%pfa fresco por 24 horas a quatro graus Celsius.No dia seguinte, lave o cérebro com três lavagens de um a dois minutos em DPBS frescos por lavagem e transfira o cérebro para uma sacarose de 15% em solução de 0,1 DPBS durante a noite. Na manhã seguinte, coloque o cérebro em uma solução de 30% de sacarose e 0,1 DPBS molar por 48 horas a quatro graus Celsius. No final da incubação, transfira o cérebro para uma câmara criotome pré-definida para menos 20 graus Celsius.Cérebros podem ser mantidos em tubos selados e armazenados a menos 80 graus Celsius. Para secção, incorpore a amostra de tecido no meio de incorporação da temperatura de corte ideal e monte a amostra em um disco de amostra. Em seguida, adquira seções de espessura de 30 micrômetros em um plano coronal no criotome, transferindo cada seção para poços individuais de uma placa de cultura de 24 poços contendo solução crioprotetora em preparação para armazenamento de menos 20 graus Celsius.Para identificar a primeira e última seção de cada cérebro, compare as características morfológicas com um atlas cerebral padrão do rato. O NBM começa em bregma menos 0,0 milímetros e termina em menos 1,6 milímetros. A seleção de cada oitava seção rende um total de seis a sete seções e permite um coeficiente apropriado de erro tanto para uma estimativa de comprimento de volume e fibra.Para rotulagem imunohistoquímica das seções teciduais, depois de bloquear qualquer ligação inespecífica com soro bovino 10% normal em 0,1%Triton X-100 em soro tampão tris, rotule as seções com o anticorpo primário de interesse por 48 horas a quatro graus Celsius. No final da incubação, lave as seções três vezes por três minutos em soro fisiológico fresco com tampo tris por lavagem, seguido de incubação com um anticorpo secundário biotinilado apropriado por uma hora à temperatura ambiente. No final da incubação, lave as seções três vezes em salina tamponada com Tris fresco, como demonstrado, seguida de coloração com complexo de peroxidase de biotina avidin e solução de substrato de peroxidase DAB de acordo com os protocolos do fabricante.Após a lavagem, monte todas as seções de uma amostra de tecido cerebral em um slide gelatinizado e permita que as amostras sequem. Para desidratar as seções, mergulhe as amostras duas vezes por cinco minutos por diluição em soluções sequenciais de etanol ascendente, como indicado, seguido de compensação com duas lavagens de xileno de 10 minutos. Em seguida, use um meio de montagem apropriado para colocar tampas nos slides.Para estereologia, abra um novo estudo no software. Uma caixa de diálogo de inicialização do estudo será aberta. Preencha as informações do estudo e confirme que a fração de vários níveis está selecionada.Clique duas vezes no volume para abrir a caixa de diálogo de volume. Nomeie o recurso de interesse e selecione o teste de contagem de pontos da região e clique em seguida. Clique duas vezes no comprimento e forneça um nome do recurso.Selecione o teste de esfera e clique em seguida. Na caixa de inicialização do caso, para codificar os grupos antes de iniciar o estudo, defina o número total de seções a partir da primeira seção contendo a área de interesse até a última seção contendo a área de interesse e o intervalo de amostragem da seção para oito. Clique ao lado para abrir a caixa de diálogo de inicialização do teste que definirá automaticamente a menor ampliação para a seleção da região e estimativa de volume e confirme as configurações.Clique na pré-visualização para verificar se a região de interesse pode ser identificada na ampliação inferior selecionada. Digite 50.000 micrômetros cubo por ponto para a fração de volume da região e clique em visualização e feito. Sob a alta ampliação do objeto, defina o comprimento para 63X e o comprimento de dois cliques para abrir a caixa de diálogo da esfera de comprimento.Defina o diâmetro desta esfera para 10 micrômetros e clique feito. Defina valores apropriados para a área do quadro, altura do quadro, zona de guarda e espaçamento da estrutura. Em seguida, clique em seguir e siga as instruções fornecidas pelo software.Para inserir a primeira seção, coloque o slide no estágio do microscópio sob um objetivo de 5X e clique na seta verde para desenhar um limite arbitrário ao redor do NBM para definir a região de interesse. Clique na seta verde e feito para alterar o objetivo 63X para obter as medidas de fibra da fração atual. A caixa de diálogo de espessura da seção aparecerá.Defina a superfície superior e inferior da seção para medir a espessura real da seção usando o botão de foco manual do eixo z e clique feito. Mova o eixo z lentamente de cima para baixo na altura da estrutura da seção para marcar todas as fibras interseccionais na superfície da sonda de esfera virtual. Quando todas as fibras tiverem sido marcadas, clique ao lado para avançar para o próximo local.Quando todas as frações tiverem sido concluídas, clique no arqueiro verde. O software pedirá para inserir a próxima seção. Leve a próxima amostra no slide para o foco usando o objetivo 5X e repita a medição da fibra como apenas demonstrado.Quando todas as seções tiverem sido medidas, o software gerará um resultado para o caso mostrando o coeficiente de valores de erro. Se o coeficiente de erro for aceitável, proceda para o próximo caso. Se o coeficiente de erro não for aceitável, o software fornecerá recomendações para alterar alguns dos parâmetros.Quando todos os casos forem concluídos, gere resultados para cada caso e grupo. Neste experimento representativo, o grupo de proteína precursora beta amiloide mutante sueco demonstrou um comprimento de fibra significativamente menor e densidade de comprimento de fibra em comparação com seus companheiros de lixo do tipo selvagem. Os resultados também mostraram que não houve diferença significativa no volume do NBM entre os dois grupos analisados.Esta técnica requer a aquisição adequada na orientação correta e um bom método de coloração com o período de incubação. O protocolo de estereologia pode ser usado para a estimativa de quaisquer perfis lineares, como outras fibras neuronais, processos de astrócito ou mesmo perfis vasculares.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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Neurociência

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Analysis of Gene Expression Changes in the Rat Hippocampus After Deep Brain Stimulation of the Anterior Thalamic Nucleus

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Imagens ao vivo da ependimária Cilia nas laterais ventrículos do cérebro do rato

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Microelectrode Guided Implantation of Electrodes into the Subthalamic Nucleus of Rats for Long-term Deep Brain Stimulation

Microeletrodos guiada implantação de eletrodos no subtalâmica Núcleo de Ratos por longo prazo Estimulação Profunda do Cérebro

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Stereological Estimation of Dopaminergic Neuron Number in the Mouse Substantia Nigra Using the Optical Fractionator and Standard Microscopy Equipment

Stereological estimativa do número de neurônios Dopaminergic na substância negra do Mouse usando o fracionador óptico e equipamento padrão de microscopia

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