Name: stereological estimation of cholinergic fiber length in the nucleus basalis of meynert of the mouse brain
Uploaded: 2020-02-05T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Stereological Estimation of Cholinergic Fiber Length in the Nucleus Basalis of Meynert of the Mouse Brain at JoVE.com

Bu çalışma W.Z.S.'ye Tıbbi Araştırma ve Geliştirme Servisi, Gazi İşleri Dairesi (Merit Review 1I01 BX001067-01A2), Alzheimer Derneği (NPSPAD-11-202149) ve Midwest Biyomedikal kaynaklarından gelen bağışlarla desteklenmiştir. Araştırma Vakfı.

Bu hayvanların kullanımı için tüm prosedürler Kansas City Gaziler İşleri Tıp Merkezi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmıştır. Deneylerde İsveç mutantı beta-amiloid öncüprotein (APPswe) ve C57/BL6 WT çöpleri aşırı eksprese eden on sekiz aylık fareler kullanıldı. O ve ark.8'deüreme ve genotipleme nin ayrıntıları verilmiştir.
1. Perfüzyon ve doku işleme
<ol><li>Ketamin (100 mg/kg) ve ksilazin (10 mg/kg) ile i...

<ol>
	<li>Mouton, P. R., Gokhale, A. M., Ward, N. L., West, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereological+length+estimation+using+spherical+probes.">Stereological length estimation using spherical probes.</a> Journal of Microscopy. 206, 54-64 (2002).</li><li>Whitehouse, P. J., Price, D. L., Clark, A. W., Long Coyle, J. T., DeLong, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alzheimer+disease:+evidence+for+selective+loss+of+cholinergic+neurons+in+the+nucleus+basalis.">Alzheimer disease: evidence for selective loss of cholinergic neurons in the nucleus basalis.</a> Annals of Neurology. 10 (2), 122-126 (1981).</li><li>Davies, P., Maloney, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+loss+of+central+cholinergic+neurons+in+Alzheimer's+disease.">Selective loss of central cholinergic neurons in Alzheimer's disease.</a> The Lancet. 2 (8000), 1403 (1976).</li><li>Bartus, R. T., Dean, R. L., Beer, B., Lippa, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cholinergic+hypothesis+of+geriatric+memory+dysfunction.">The cholinergic hypothesis of geriatric memory dysfunction.</a> Science. 217 (4558), 408-414 (1982).</li><li>Savonenko, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Episodic-like+memory+deficits+in+the+APPswe/PS1dE9+mouse+model+of+Alzheimer's+disease:+relationships+to+beta-amyloid+deposition+and+neurotransmitter+abnormalities.">Episodic-like memory deficits in the APPswe/PS1dE9 mouse model of Alzheimer's disease: relationships to beta-amyloid deposition and neurotransmitter abnormalities.</a> Neurobiology of Disease. 18 (3), 602-617 (2005).</li><li>Perez, S. E., Dar, S., Ikonomovic, M. D., DeKosky, S. T., Mufson, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholinergic+forebrain+degeneration+in+the+APPswe/PS1DeltaE9+transgenic+mouse.">Cholinergic forebrain degeneration in the APPswe/PS1DeltaE9 transgenic mouse.</a> Neurobiology of Disease. 28 (1), 3-15 (2007).</li><li>Stokin, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonopathy+and+transport+deficits+early+in+the+pathogenesis+of+Alzheimer's+disease.">Axonopathy and transport deficits early in the pathogenesis of Alzheimer's disease.</a> Science. 307 (5713), 1282-1288 (2005).</li><li>He, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GRK5+Deficiency+Leads+to+Selective+Basal+Forebrain+Cholinergic+Neuronal+Vulnerability.">GRK5 Deficiency Leads to Selective Basal Forebrain Cholinergic Neuronal Vulnerability.</a> Scientific Reports. 6, 26116 (2016).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lab+Animal+Research.+Anesthesia+Induction+and+Maintenance.">Lab Animal Research. Anesthesia Induction and Maintenance.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2019).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents.">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).</li><li>Mouton, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Unbiased Stereology-A Concise Guide. , (2011).</li><li>West, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+started+in+stereology.">Getting started in stereology.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2013 (4), 287-297 (2013).</li><li>West, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Space+Balls+Revisited:+Stereological+Estimates+of+Length+With+Virtual+Isotropic+Surface+Probes.">Space Balls Revisited: Stereological Estimates of Length With Virtual Isotropic Surface Probes.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 12, 49 (2018).</li><li>Nikolajsen, G. N., Kotynski, K. A., Jensen, M. S., West, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+the+capillary+network+of+aged+APPswe/PS1dE9+transgenic+mice.">Quantitative analysis of the capillary network of aged APPswe/PS1dE9 transgenic mice.</a> Neurobiology of Aging. 36 (11), 2954-2962 (2015).</li><li>Gutierrez-Jimenez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disturbances+in+the+control+of+capillary+flow+in+an+aged+APP(swe)/PS1DeltaE9+model+of+Alzheimer's+disease.">Disturbances in the control of capillary flow in an aged APP(swe)/PS1DeltaE9 model of Alzheimer's disease.</a> Neurobiology of Aging. 62, 82-94 (2018).</li><li>Gundersen, H. J., Jensen, E. B., Kieu, K., Nielsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+efficiency+of+systematic+sampling+in+stereology--reconsidered.">The efficiency of systematic sampling in stereology--reconsidered.</a> Journal of Microscopy. 193, 199-211 (1999).</li><li>Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+study+of+the+capillaries+within+the+white+matter+of+the+Tg2576+mouse+model+of+Alzheimer's+disease.">Quantitative study of the capillaries within the white matter of the Tg2576 mouse model of Alzheimer's disease.</a> Brain and Behavior. 9 (4), 01268 (2019).</li><li>McNeal, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unbiased+Stereological+Analysis+of+Reactive+Astrogliosis+to+Estimate+Age-Associated+Cerebral+White+Matter+Injury.">Unbiased Stereological Analysis of Reactive Astrogliosis to Estimate Age-Associated Cerebral White Matter Injury.</a> Journal of Neuropathology Experimental Neurology. 75 (6), 539-554 (2016).</li><li>Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Passive+(amyloid-beta)+immunotherapy+attenuates+monoaminergic+axonal+degeneration+in+the+AbetaPPswe/PS1dE9+mice.">Passive (amyloid-beta) immunotherapy attenuates monoaminergic axonal degeneration in the AbetaPPswe/PS1dE9 mice.</a> Journal of Alzheimer's Disease. 23 (2), 271-279 (2011).</li><li>Gagnon, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+Sprouting+of+Dopamine+and+Serotonin+Axons+in+the+Pallidum+of+Parkinsonian+Monkeys.">Evidence for Sprouting of Dopamine and Serotonin Axons in the Pallidum of Parkinsonian Monkeys.</a> Frontiers of Neuroanatomy. 12, 38 (2018).</li><li>Boncristiano, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholinergic+changes+in+the+APP23+transgenic+mouse+model+of+cerebral+amyloidosis.">Cholinergic changes in the APP23 transgenic mouse model of cerebral amyloidosis.</a> Journal of Neuroscience. 22 (8), 3234-3243 (2002).</li></ol>

Burada bir uzay topu (küre) sondası kullanarak NBM kolinerjik liflerin yoğunluğunu tahmin etmek için bir yöntem göstermektedir. Bu sonda, ilgi bölgesindeki toplam lif uzunluğunu tahmin ediyor. Toplam uzunluk lif yoğunluğu elde etmek için bölgenin hacmine bölünebilir. Bölgenin hacmini tahmin etmek için Cavalieri nokta sayımı yöntemi kullanılmıştır. Cavalieri puan sayımı yöntemi, herhangi bir bölge için 3B referans hacminin tarafsız ve verimli bir tahmincisidir. Yöntem, noktaları (alan kesir...

Beyindeki sinir liflerinin uzunluğu ve/veya yoğunluğunun nicel tahminleri nöropatolojik çalışmaların önemli parametreleridir. Çeşitli beyin bölgelerinde kolinerjik uzunluğu, dopaminerjik, ve serotonerjik aksonlar genellikle bölgenin belirli fonksiyonları ile ilişkilidir. Bu aksonların dağılımı genellikle heterojen olduğundan, tasarım tabanlı stereoloji örnekleme sırasında önyargıönlemek için kullanılır. Stereolojiuzay topu sondası ilgi bir bölgede nöronal lifler gibi çizgi benzeri yapıların verimli ve güvenilir önlemler sağlamak için tasarlanmıştır1. Sonda, sondanın yüzeyi ile çizgi kesişmelerini ölçmek için dokuya sistematik olarak empoze edilen sanal bir küre yapar. Analiz için dokuya küre sondaları koymak mümkün olmadığından, ticari olarak kullanılabilen yazılım sanal üç boyutlu (3D) bir küre sağlar, bu da temelde küre sondasının yüzeyini temsil eden çeşitli çaplarda eşmerkezli daireler dizisidir.
Selektif kolinerjik nörodejenerasyon Alzheimer hastalığının tutarlı özelliklerinden biridir (AD)2,3,4. Disfonksiyonel kolinerjik iletim AD bilişsel gerileme için bir etken olarak kabul edilir. Kolinerjik disfonksiyon da Parkinson gibi diğer birçok ruhsal bozukluklar belirgindir, bağımlılık, ve şizofreni. Kolinerjik nörodejenerasyon farklı yönleri hayvan modellerinde incelenir (örneğin, asetilkolin azalma5, ChAT protein6, amiloid plaklar çevresinde kolinerjik lif nörodejenerasyon6, ve kolinerjik lifler ve sinaptik varisleri azalma7,8). Lif dejenerasyonu nöronal kayıp daha erken yer olduğuna inanılmaktadır, kolinerjik nöronal kaybı her zaman çalışmalarda gözlenmez çünkü. Kolinerjik nöronların çoğu bazal ön beyin ve beyin sapı, ve korteksler ve hipokampus gibi çeşitli beyin bölgelerine aksonlar proje. NBM bazal ön beyin de bulunan ve AD yaygın olarak etkilenen beyin bölgelerinden biri olarak bulundu.
Stereolojinin fraksiyonator yöntemi, bir dokunun birden fazla düzeyde sistematik olarak rastgele örneklemesi üzerine kuruludur. Kesit örnekleme fraksiyonu (SSF), stereolojinin fraksiyonator yöntemi için bölümlerin bilgisayar tabanlı olmayan sistematik örneklemesidir. Alan örnekleme fraksiyonu (ASF), bu bölümdeki ilgi alanının bir bölümünün fraksiyonudur. Kalınlık örnekleme fraksiyonu (TSF) bir bölümün kalınlığının kesirasyonudur. Uzay topu sondası, kesirli yerlerde 3Boyutlu bir küredeki ilgi profillerini ölçmemizi sağlıyor. Burada prosedürleri göstermek için fare beyninin NBM kolinerjik liflerin toplam uzunluğu tahmin etmek için bir uzay topu sondası kullanın. Mevcut protokol doku işleme hakkında ayrıntılı bilgi sağlar, stereoloji için örnekleme yöntemleri, ChAT antikor kullanarak immünohistokimyasal boyama, ve tarafsız stereoloji fare beyninin NBM kolinerjik lif uzunluğu ve lif yoğunluğu tahmin etmek.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ABC kit</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>PK6100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-ChAT Antibody</td>
			<td>Millipore, MA, USA</td>
			<td>AB144P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine anti-goat IgG-B</td>
			<td>Santacruz Biotechnology</td>
			<td>SC-2347</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum, Adult</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>B9433</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Lieca Microsystems, Buffalo Grove, IL, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>D5652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene Glycol</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>324558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>G2025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>H1009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immpact-DAB kit</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>SK4105</td>
			<td>Enhanced DAB peroxidase substrate solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Westward Pharmaceuticals, NJ, USA</td>
			<td>0143-9509-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Lieca Microsystems, Buffalo Grove, IL, USA</td>
			<td>AF6000</td>
			<td>Equipped with motorized stage and IMI-tech color digital camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optimum cutting temperature (O.C.T.) embedding medium</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences, PA, USA</td>
			<td>62550-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permount mounting medium</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences, PA, USA</td>
			<td>17986-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereologer Software</td>
			<td>Stereology Resource Center, Inc. St. Petersburg, FL, USA</td>
			<td>Stereologer2000</td>
			<td>Installed on a Dell Desktop computer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma Base</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>T1503</td>
			<td>Tris base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>T5941</td>
			<td>Tris hydrochloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Bayer, Leverkusen, Germany</td>
			<td>Rompun</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylenes, Histological grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>534056</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stereological estimation of cholinergic fiber length in the nucleus basalis of meynert of the mouse brain

Çeşitli beyin bölgelerinde kolinerjik veya diğer nöronal aksonların uzunluğu genellikle bölgenin özel fonksiyonu ile ilişkilidir. Stereoloji çeşitli beyin yapılarının nöronal profillerini ölçmek için yararlı bir yöntemdir. Burada bazal ön beynin Meynert (NBM) çekirdeğindeki kolinerjik liflerin toplam uzunluğunu tahmin etmek için yazılım tabanlı stereoloji protokolü salıyoruz. Yöntem uzunluk tahminleri için bir uzay topu sondası kullanır. Kolinerjik lifler kolin asetiltransferaz tarafından görselleştirilmiştir (ChAT) horseradish peroksidaz-diaminobenzidin ile immünboyama (HRP-DAB) algılama sistemi. Boyama protokolü, stereoloji yazılımı kullanılarak çeşitli beyin bölgelerinde lif ve hücre sayısı tahmini için de geçerlidir. Stereoloji protokolü cholinoceptive lifler, dopaminerjik / katekolaminerik lifler, serotonerjik lifler, astrosit süreçleri, hatta vasküler profiller gibi herhangi bir lineer profillerin tahmini için kullanılabilir.

Temsil sonuçları Tablo 1 ve Şekil 5'tegösterilmiştir. APPswe grubu (APP) olarak deşifre edilen C Grubu, yabani tip (WILD) çöplerine göre önemli ölçüde daha düşük lif uzunluğuna(Şekil 5B) ve lif uzunluğu yoğunluğuna(Şekil 5C)sahipti. Sonuçlar, analiz edilen iki grup arasında NBM hacminde anlamlı bir fark olmadığını göstermiştir(Şek...

Watch this Scientific Journal Video about Stereological Estimation of Cholinergic Fiber Length in the Nucleus Basalis of Meynert of the Mouse Brain at JoVE.com

Stereological Estimation of Cholinergic Fiber Length in the Nucleus Basalis of Meynert of the Mouse Brain

Bir beyin bölgesinin üç boyutlu yapısı içinde nöronal lif uzunluğu belirli nöronal yapısal bütünlüğü veya dejenerasyon ölçmek için güvenilir bir parametredir. Bu makalede, farelerde Meynert'in çekirdek bazalisi içindeki kolinerjik lif uzunluğunu ölçmek için stereoolojik bir niceliksel leştirme yöntemi örnek olarak açıklanır.

Fare Beyninin Meynert'in Nükleus Bazalisinde Kolinerjik Lif Uzunluğunun Stereoolojik Tahmini

The length of cholinergic or other neuronal axons in various brain regions are often correlated with the specific function of the region. Stereology is a ...

Birçok nörolojik bozukluklarda nörodenegration nöronal lif kaybı genellikle hücre vücut kaybı öncesinde oluşur kronik bir süreçtir. Nöronal liflerin üç boyutlu stereoolojik niceliği, erken nörodejeneratif değişimi saptaması için hassas ve doğru bir yöntem sağlar. Bu teknoloji, 3D nöronal lifler gibi çizgi benzeri yapıların uzunluklarını ölçmek için uzay toplarının güvenilir ve verimli bilgisayar tabanlı tarafsız fraksiyonu kullanır.Prosedürü gösteren Prabhakar Singh, bir post-doc ve stereology uzmanı ve David Peng, benim laboratuvarda araştırma asistanı tarafından yapılacaktır. Anestezili farede pedal refleksine yanıt eksikliğini doğruladıktan sonra, transkardial perfuse buz soğuk yaklaşık 50 mililitre 0.1 molar DPBS, 0.1 molar PBS içinde yaklaşık 25 mililitre 4% PFA takip. Perfüzyonsonunda, dört santigrat derece 24 saat boyunca taze% 4 PFA bir kapta beyin post-fix.Ertesi gün, yıkama başına taze DPBS üç bir ila iki dakikalık yıkar ile beyin yıkayın ve 0.1 DPBS çözüm gecede% 15 sakaroz içine beyin transfer. Ertesi sabah, beyni %30 sakaroz solüsyonuna ve 48 saat boyunca 48 saat boyunca 0.1 azı dpbs'e yerleştirin. Kuluçka nın sonunda, beyni eksi 20 santigrat dereceye ayarlanmış bir kriyotom odasına aktarın.Beyinler kapalı tüplerde tutulabilir ve eksi 80 derecede saklanabilir. Kesitleme için doku örneğini optimum kesme sıcaklığına yerleştirin ve numuneyi bir numune diskine yerleştirin. Daha sonra kriyotomda koronal düzlemde seri 30 mikrometre kalınlığında kesitler elde ederek, her bir bölümü eksi 20 santigrat derece depolamaya hazırlanırken kriyoprotektif solüsyon içeren 24 kuyulu bir kültür plakasının ayrı kuyularına aktarın.Her beynin ilk ve son bölümlerini tanımlamak için, standart bir fare beyin atlası ile morfolojik özellikleri karşılaştırın. NBM bregma eksi 0.0 milimetre başlar ve eksi 1.6 milimetre biter. Her sekizinci bölümün seçimi toplam altı ila yedi bölüm verir ve hem hacim hem de lif uzunluğu tahmini için uygun bir hata katsayısı sağlar.Doku bölümlerinin immünohistokimyasal etiketlemeiçin, Tris-tamponlu tuzlu 0,1% Triton X-100% 10 normal sığır serumile herhangi bir nonspesifik bağlama bloke sonra, dört santigrat derece 48 saat ilgi birincil antikor ile bölümleri etiket. Kuluçka sonunda, oda sıcaklığında bir saat boyunca uygun bir biyotinylated ikincil antikor ile kuluçka takip, yıkama başına taze Tris tamponlu tuzlu üç dakika boyunca üç kez bölümleri yıkayın. Kuluçka sonunda, taze Tris-tamponlu salin üç kez yıkama, üreticinin protokollerine göre Avidin biotin peroksidaz kompleksi ve DAB peroksidaz substrat çözeltisi ile boyama izledi.Yıkadıktan sonra, bir beyin dokusu örneğinden tüm bölümleri jelatinize bir slaytüzerine monte edin ve örneklerin kurumasını bekleyin. Bölümleri susuzleştirmek için, numuneleri seyreltme başına beş dakika boyunca iki kez sıralı artan etanol çözeltilerinde, ardından iki adet 10 dakikalık ksilen yıkar ile temizleyin. Daha sonra, kapakları slaytların üzerine yerleştirmek için uygun bir montaj ortamı kullanın.Stereoloji için, yazılım yeni bir çalışma açın. Bir çalışma başlatma diyalog kutusu açılacaktır. Çalışma bilgilerini doldurun ve çok düzeyli kesir tabanlı seçili olduğunu doğrulayın.Birim diyalog kutusunu açmak için ses düzeyine çift tıklayın. İlgi çekici özelliği ni belirleyin ve bölge nokta sayma sondasını seçin ve sonrakini tıklatın. Uzunluğa çift tıklayın ve özelliğin adını sağlayın.Küre sondası seçin ve sonrakini tıklatın. Vaka başlatma kutusunda, çalışmaya başlamadan önce grupları kodlamak için, ilgi alanını içeren ilk bölümden başlayarak toplam bölüm sayısını ilgi alanını içeren son bölüme ve bölüm örnekleme aralığını sekize ayarlayın. Bölge seçimi ve hacim tahmini için en düşük büyütmeyi otomatik olarak ayarlayacak ve ayarları onaylayacak sonda başlatma diyalog kutusunu açmak için hemen tıklayın.Seçilen alt büyütmede ilgi alanının tanımlanıp tanımlanamamasını kontrol etmek için önizlemeyi tıklatın. Bölge hacmi fraksiyonu için nokta başına 50,000 mikrometre küp girin ve önizleme ve bitti'yi tıklatın. Nesne yüksek büyütme altında, uzunluğu 63X ve çift tıklatma uzunluğu uzunluk küre diyalog kutusunu açmak için ayarlayın.Bu kürenin çapını 10 mikrometreye ayarlayın ve tıklayın. Çerçeve alanı, çerçeve yüksekliği, koruma bölgesi ve çerçeve aralığı için uygun değerleri ayarlayın. Sonra sonraki tıklatın ve yazılım tarafından sağlanan yönergeleri izleyin.İlk bölümü eklemek için, slaytı 5X hedefi altında mikroskop aşamasına yerleştirin ve ilgi bölgesini tanımlamak için NBM'nin etrafında rasgele bir sınır çizmek için yeşil oku tıklatın. Yeşil ok tıklayın ve geçerli kesir lif ölçümleri elde etmek için 63X hedefi değiştirmek için yapılır. Kesit kalınlığı diyalog kutusu görüntülenir.Manuel z ekseni odak düğmesini kullanarak bölümün gerçek kalınlığını ölçmek için bölümün üst ve alt yüzeyini ayarlayın ve bitti'yi tıklatın. Sanal küre sondasının yüzeyindekesişen tüm lifleri işaretlemek için bölümün çerçeve yüksekliğinde z eksenini yavaşça yukarıdan aşağıya doğru hareket ettirin. Tüm lifler işaretlendiğinde, bir sonraki konuma ilerlemek için hemen tıklatın.Tüm kesirler tamamlandığında, yeşil oku tıklatın. Yazılım sonraki bölümün eklenmesini isteyecektir. Slayttaki bir sonraki örneği 5X hedefini kullanarak odak haline getirin ve lif ölçümlerini az önce gösterildiği gibi tekrarlayın.Tüm bölümler ölçüldüğünde, yazılım hata değerlerinin katsayısını gösteren durum için bir sonuç oluşturur. Hata katsayısı kabul edilebilirse, bir sonraki servis talebine devam edin. Hata katsayısı kabul edilemezse, yazılım bazı parametreleri değiştirmek için öneriler sağlar.Tüm servis talepleri tamamlandığında, her servis talebi ve grup için sonuç oluşturun. Bu temsili deneyde, İsveç mutant beta amiloid öncüprotein grubu yabani tip çöp eşleri ile karşılaştırıldığında önemli ölçüde daha düşük lif uzunluğu ve lif uzunluğu yoğunluğu gösterdi. Sonuçlar ayrıca analiz edilen iki grup arasında NBM hacminde anlamlı bir fark olmadığını gösterdi.Bu teknik, doğru oryantasyonda doğru edinimi ve kuluçka dönemi ile iyi bir boyama yöntemi gerektirir. Stereoloji protokolü diğer nöronal lifler, astrosit süreçleri, hatta vasküler profiller gibi herhangi bir doğrusal profillerin tahmini için kullanılabilir.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

Gelişmekte Fare Embriyonik Cortex mitoz Canlı Görüntüleme

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol (TRAP) Assay

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol TRAP Assay

Fare Beyin Çeşitli Bölgelerinde Telomeraz Aktivite: Radyoaktif olmayan Telomeraz Amplifikasyon Protokolü tekrarlayın (TRAP) Deneyi

Telomerase, a ribonucleoprotein, is responsible for maintaining the telomere length and therefore promoting genomic integrity, proliferation, and ...

Analysis of Gene Expression Changes in the Rat Hippocampus After Deep Brain Stimulation of the Anterior Thalamic Nucleus

Ön Talamusun Çekirdek Derin Beyin Stimülasyon sonra Sıçan Hippocampus Gen İfade Değişim Analizi

Deep brain stimulation (DBS) surgery, targeting various regions of the brain such as the basal ganglia, thalamus, and subthalamic regions, is an effective ...

Stereotaxic Infusion of Oligomeric Amyloid-beta into the Mouse Hippocampus

Fare Hippocampus içine Oligomerik Amiloid-beta Stereotaksik İnfüzyon

Alzheimer&#8217;s disease is a neurodegenerative disease affecting the aging population. A key neuropathological feature of the disease is the ...

Live Imaging of the Ependymal Cilia in the Lateral Ventricles of the Mouse Brain

Fare Beyin lateral ventrikül Ependimal Cilia Canlı Görüntüleme

Multiciliated ependymal cells line the ventricles in the adult brain. Abnormal function or structure of ependymal cilia is associated with various ...

Microelectrode Guided Implantation of Electrodes into the Subthalamic Nucleus of Rats for Long-term Deep Brain Stimulation

Mikroelektrod Uzun vadeli Derin Beyin Stimülasyonu için Sıçan Subtalamik Nucleus içine elektrotlar implantasyonu Rehberli

Deep brain stimulation (DBS) is a widely used and effective therapy for several neurologic disorders, such as idiopathic Parkinson&#8217;s disease, ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Sinaptik plastisite akut Hipokampal dilimleri bir küçük hacimli geri dönüşüm-, perfüzyon- ve batma-tipi oda sistemi içinde tutulan kayıt

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

Stereological Estimation of Dopaminergic Neuron Number in the Mouse Substantia Nigra Using the Optical Fractionator and Standard Microscopy Equipment

Optik Fractionator ve standart mikroskobu ekipmanlar kullanarak fare gözlemliyorum Nigra dopaminerjik nöron sayısının stereological tahmin

In pre-clinical Parkinson&#39;s disease research, analysis of the nigrostriatal tract, including quantification of dopaminergic neuron loss within the ...