Name: measuring microbial mutation rates with the fluctuation assay
Uploaded: 2019-11-28T13:00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Microbial Mutation Rates with the Fluctuation Assay at JoVE.com

RK werd gesteund door BB/M020975/1 en Universiteit van Manchester School of Biological Sciences. HR werd ondersteund door BB/J014478/1. GG werd gesteund door BBSRC Doctoral training samenwerking BB/M011208/1. DRG werd gesteund door het UKRI Award nummer MR/R024936/1.

1. dag 1: inoculatie en Acclimatie van culturen
<ol><li>Inoculeren 3 mL vloeibare lysogeny Bouillon (LB, Zie aanvullende tabel 1) met een scheen van ijs uit de E. coli MG1655 glycerol kolf (18% glycerol,-80 °c). Schud de LB-cultuur bij 120 rpm voor ~ 7 uur bij 37 °C. Opmerking: In dit experiment, E. coli K12 MG1655 kweken in lb wordt gebruikt, maar deze test kan worden uitgevoerd met elke E. coli stam of elke andere culturable microbiële soort. Incubatietemperatuur, incubatie tijden en nutriënten niveau van de groeimedia kunnen allemaal onderhevig zijn aan variatie per soort of stam.</li>
	<li>Verdun de cultuur 2.000-fold met behulp van de zoutoplossing. Voeg 100 μL van de verdunde oplossing toe aan 3 50 mL schroefdop conische onderkant polymeer buizen (50 mL buizen) met 10 mL vloeibaar Davis minimaal medium (DM, Zie aanvullende tabel 1), met respectievelijk 80 mg/l, 125 mg/l, of 250 mg/l glucose. Dit is hetzelfde medium (d.w.z. de omgeving) waarin de mutatie snelheid wordt geschat. Schud de culturen met 120 rpm 's nachts bij 37 °C. Opmerking: De keuze van de media is onderhevig aan variatie per soort, stam of onderzoeksvraag.</li>
</ol>2. dag 2: generatie mutanten in parallelle culturen
<ol><li>Maak eerst de omgevingen waarin de bacteriën zullen worden gekweekt. Bereid altijd 10% meer voor dan nodig is (dat wil zeggen, Twenty 1 ml culturen vereisen 22 mL). Bereid 22 mL 1) DM met 80 mg/L glucose, 2) DM met 125 mg/L glucose, 3) DM met 250 mg/L glucose, 4) DM met 80 mg/L glucose, en 5) DM met 250 mg/L glucose in 5 50 mL buizen. Label ze als GLC-80A, GLC-125, GLC-250A, GLC-80B en GLC-250B, respectievelijk.</li>
	<li>Bereid entmateriaal voor op de omgeving. Zorg dat het entmateriaal voor 1 mL van de omgeving 1000 − 5000 cellen bevat. Doe dit door de onderstaande stappen te volgen.
	<ol>
<li>Meet de optische dichtheid (OD) van de nachtelijke culturen (vanaf stap 1,2) bij 600 nm.</li>
		<li>Verdun elke nachtelijke cultuur om een eind dichtheid van 1000-5000 cellen per mL DM met glucose te bereiken. In onze handen, als de OD gemeten in 2.2.1 is 0,3, betekent dit een 100-voudige verdunning (in zoutoplossing) van de nachtelijke cultuur, vervolgens het toevoegen van 11μl van deze oplossing aan de 22 mL omgeving.</li>
	</ol></li>
	<li>Parallelle culturen voorbereiden. Opmerking: dit protocol is geschreven voor 1 96 Deep well plate, het uitvoeren van vijf fluctuatie testen (het maximale redelijke nummer op 1 96 goed bord), met behulp van drie omgevingen. Met ervaring kunnen meerdere Deep-well platen parallel worden uitgevoerd.<ol>
<li>Maak een willekeurige lay-out van parallelle culturen voor 1 96 Deep well plate. Hiervoor kan de aanvullende r-Scriptlayoutgenerator. R (Zie de indeling in Figuur 1B) worden gebruikt. Plaats elke parallelle cultuur op de 96 Deep well plate volgens de lay-out. Opmerking: Het uitvoeren van de LayoutGenerator. R zal ervoor zorgen dat de eerste test 20 parallelle culturen heeft, en dat de tweede, derde, vierde en vijfde assays elk 19 parallelle culturen hebben.</li>
		<li>Breng 1 mL inocculeerde media over in elke put van een 96 Deep well plate volgens de gerandomiseerde lay-out.</li>
		<li>Bevestig de deksel van de Deep well plate met de tape. Bevestig het deksel niet strak, want de kweek groei is gevoelig voor de hoeveelheid beluchting.</li>
		<li>Weeg het hele plaatje af met de deksel en de tape en schud de plaat bij 250 rpm gedurende 24 uur bij 37 °C. Plaats 2 L gedistilleerd water in de incubator om de hoeveelheid verdamping tussen experimentele verzamelingen te stabiliseren.</li>
	</ol></li>
	<li>Bepaal de entmateriaal grootte door 10 μL van elk van de inocculeerde media op de niet-selectieve tetrazolium (TA) agar-plaat te bekleden (Zie aanvullende tabel 1). Gebruik een steriele L-vormige strooier tot de agar-oppervlakte droog is. Incueren TA agar-platen deksel 's nachts op 37 °C. Opmerking: TA agar is een rijke agar die de suiker L-arabinose bevat en de in water oplosbare kleurstof 2, 3, 5-trifenyltetrazoliumchloride, dat kleurloos is in zijn geoxideerde vorm. Wanneer bacteriën de kleurstof verminderen, wordt het rood als gevolg van de vorming van Formazan. Kolonies op TA agar die L-arabinose niet kunnen gebruiken zijn donkerrood. Andere stammen, zoals MG1655, zijn roze. Het gebruik van TA agar in plaats van standaard LB agar wordt aanbevolen omdat gekleurde bacteriële kolonies gemakkelijker te herkennen zijn, wat het tellen van de kolonie betrouwbaarder en sneller maakt.</li>
	<li>Bereid selectieve TA agar met rifampicine in 6 goed platen. Pipetteer 5 mL van de selectieve TA agar in elke put van de 6 well Plates. Bereid het antibioticum rifampicine net voordat het aan de TA agar wordt toegevoegd. Opmerking: wanneer cycloserine wordt gebruikt als marker, gebruik dan Davis minimal medium met 250 mg/l glucose aangevuld met agar en L-arabinose en 2, 3, 5-trifenyltetrazoliumchloride als selectieve agar. Namelijk, TA agar selecteert niet alleen cellen die resistent zijn tegen cycloserine, omdat tryptoon en gistextract (beide essentiële bestanddelen van TA agar) het aminozuur D-Alanine bevatten. Dit aminozuur antagonizes het antimicrobiële effect van de cycloserine en laat alle cellen om een kolonie te maken.<ol>
<li>Laat de selectieve en resterende niet-selectieve platen in het donker (bijv. in een doos) bij kamertemperatuur.</li>
	</ol></li>
</ol>3. dag 3: plateren van culturen op selectieve en niet-selectieve agar-platen
<ol><li>Graaf kolonie vormende eenheden (CFU) op de niet-selectieve agar-platen en bepaal de grootte van de entmateriaal door CFU te vermenigvuldigen met 100. Dit is een verhouding tussen een volume van de parallelle cultuur (1 mL = 1.000 μL) en het geplateerde volume (10 μL). Opmerking: Als niet-selectieve platen gekoeld worden opgeslagen, kan de kve later worden geteld.</li>
	<li>Weeg na 24 uur incubatie de hele diepe put af om de hoeveelheid verdamping te bepalen. Dit is waarschijnlijk ongeveer 10%.</li>
	<li>Bereken het gemiddelde volume van een parallelle cultuur na 24 uur incubatie (V[24h]) in micro liters met behulp van een start volume V[0h] = 1.000 μl en het gewicht van de plaat wordt omgezet in micro liters, waarbij de dichtheid van het groeimedium wordt gemeten in mg/μl. Deze studie gebruikt een dichtheid van 1 mg/μl: <img src="/files/ftp_upload/60406/60406eq1.jpg">
</li>
	<li>Breng de drie willekeurig gekozen culturen per test (15 in totaal, gemarkeerd met een zwarte cirkel in de lay-out in Figuur 1B) in gelabelde micro centrifugebuizen. Laat ze op de Bank staan om later te worden gebruikt (zie stap 3,6) voor het bepalen van de uiteindelijke bevolkingsgrootte (of Nt).</li>
	<li>
Plaat de overgebleven 81 parallelle culturen van de diepe put op de selectieve TA agar die rifampicine bevat. Pipetteer één volledige parallelle kweek van de 96 Deep well plate in één put van een 6-well plaat. Zorg ervoor dat elke 6-put plaat parallelle culturen van meer dan één fluctuatie test bevat.
	<ol>
<li>Verwijder de deksels van de selectieve agarplaten en laat ze in steriele omstandigheden onbedekt. Droog alle vloeistof op het oppervlak van de selectieve TA agar. Opmerking: De agar die volledig droog is, is cruciaal. Echter, niet te overdrogen de selectieve TA agar, omdat het mag niet worden toegestaan om te kraken.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Terwijl de selectieve TA agar platen drogen, wat kan duren tot enkele uren, bepalen Nt van de 15 culturen bereid in stap 3,4 met behulp van kolonie vormende eenheden (CFU).
	<ol>
<li>Bepaal de CFU door de culturen van de micro centrifugebuizen te verdunen. Gebruik 5 10-voudige verdunnings stappen, meng en grondig 900 μL zoutoplossing met 100 μL van de cultuur op elke stap. Plaat 40 μL van de laatste verdunning (met een verdunningsfactor van 105) op de niet-selectieve ta agar en incuberen de platen deksel 's nachts op 37 °c. Opmerking: De verdunnings serie in 96 well Plates kan worden uitgevoerd met een multichannel Pipet, die de snelheid van deze stap kan verhogen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Zodra alle putjes op een 6-putplaat vrij zijn van de cultuur vloeistof, zet u het deksel weer op en plaatst u de 6-putplaat met het deksel naar beneden op de bank totdat alle 6 put-platen droog zijn. Zodra alle droog zijn, incueren de platen deksel beneden bij 37 ° c voor 44-48 h. Opmerking: Voor andere markers (nalidixinezuur, cycloserine, hygromycine B of 5-FOA) incuberen de platen gedurende 68-72 uur. Zorg ervoor dat de luchtvochtigheid in de incubator hoog is. Het is van cruciaal belang dat de selectieve agarplaten niet uitdrogen tijdens de incubatieperiode.</li>
</ol>4. dag 4: bepaling van het aantal cellen in de culturen
<ol><li>Tel de kve op de niet-selectieve agar-platen. Schat het aantal levensvatbare cellen in de cultuur door de kve te vermenigvuldigen met de verdunningsfactor (105) en de verhouding tussen het berekende gemiddelde volume V[24h] in micro liters (zie stap 3,3) en het vergulde volume (40 μl): <img src="/files/ftp_upload/60406/60406eq2.jpg">
</li>
	<li>
Nt van een bepaald genotype dat in een bepaalde omgeving groeit, is het gemiddelde van deze waarden uit de drie culturen.</li>
</ol>5. dag 5: schatting van het mutatie percentage
<ol><li>
Tel het aantal kolonies dat resistent is tegen het antibioticum op de selectieve TA agar-platen (d.w.z. de aantallen resistente cellen die zijn ontstaan door spontane mutatie in de diepe put op dag 2 − 3). Noteer de verdeling tussen de parallelle culturen van het waargenomen aantal mutanten voor een bepaalde assay (bijv. 16 of 17 waarden, waaronder nul tellingen). Opmerking: als selectieve platen gekoeld worden bewaard, kunnen kolonies die resistent zijn tegen het antibioticum later worden geteld.<ol>
<li>Gebruik elke distributie om het aantal mutationele gebeurtenissen, m, te schatten met behulp van het R-pakket flan36. Opmerking: Er is ook het R-pakket rSalvador met vergelijkbare functionaliteit29.</li>
		<li>Bewaar de verdeling van de waargenomen mutanten voor één assay in een tekstbestand als één kolom.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Gebruik Shinyflan software (http://shinyflan.its.manchester.ac.uk/) om m te schatten zoals hieronder beschreven.
	<ol>
<li>In de tab hypothese testen laat waarden als standaard (dat wil zeggen, onbekende fitness aangevinkt, schattingsmethode = maximale waarschijnlijkheid (ml), verdeling van de Mutant levensduur = exponentiële (LD model), Winsor parameter = 1.024, Mutatie nummer en fitness = 1, betrouwbaarheidsniveau = 0,95, aantal klasse en maximale waarde = 100).</li>
		<li>Klik op Bladeren en selecteer het tekstbestand met de verdeling van de waargenomen mutanten. Probeer het eerst met het aanvullende gegevensbestand.</li>
		<li>Na het uploaden van het bestand, klikt u op test uitvoeren. Zoek het Mutatie nummeraan de rechterkant onder het resultaat van de test, onder de één sample ml-test (LD-model). Dit is m, het verwachte aantal mutationele gebeurtenissen.</li>
		<li>Zoek onder het betrouwbaarheids interval van 95 procent voor het mutatie nummer de bovenste en onderste binding van m.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Zodra m en Nt (bepaald door CFU) beschikbaar zijn, schat u de mutatie snelheid van een bepaald genotype in een bepaalde omgeving <img src="/files/ftp_upload/60406/60406eq3.jpg"> </img>als. Verdeel de boven-en ondergrenzen op m door Nt op dezelfde manier om betrouwbaarheidsintervallen op de mutatie snelheid te genereren (NB Dit houdt geen rekening met de onzekerheid in Nt). Opmerking: Resultaten worden gepresenteerd als de mutatie snelheid per rpoB Locus per generatie. Mutatie snelheid per basis paar wordt gegenereerd door de mutatie snelheid per rpoB Locus te delen door 79, wat onze huidige kennis is van het aantal puntmutaties binnen een rpoB -gen dat resistentie verleent aan rifampicine37. Vermenigvuldiging van de mutatie snelheid per nucleotide door de grootte van het chromosoom (E. coli K-12 MG1655 = 4.639.675 BP), geeft de mutatie snelheid per genoom.</li>
	<li>Herhaal stap 5.1 − 5.3 met de resterende vier fluctuatie-assays.</li>
</ol>

<ol>
	<li>de Vries, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Die+mutationstheorie.">Die mutationstheorie.</a> Versuche und beobachtungen &#252;ber die entstehung von arten im pflanzenreich. 1, (1901).</li><li>Muller, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+transmutation+of+the+gene.">Artificial transmutation of the gene.</a> Science. 66 (1699), (1927).</li><li>Muller, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+measurement+of+gene+mutation+rate+in+Drosophila,+its+high+variability,+and+its+dependence+upon+temperature.">The measurement of gene mutation rate in Drosophila, its high variability, and its dependence upon temperature.</a> Genetics. 13 (4), 279-357 (1928).</li><li>Sturtevant, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essays+on+evolution.+I.+On+the+effects+of+selection+on+mutation+rate.">Essays on evolution. I. On the effects of selection on mutation rate.</a> The Quarterly Review of Biology. 12 (4), 464-467 (1937).</li><li>Luria, S. E., Delbr&#252;ck, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+of+bacteria+from+virus+sensitivity+to+virus+resistance.">Mutations of bacteria from virus sensitivity to virus resistance.</a> Genetics. 28 (6), 491-511 (1943).</li><li>Jee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rates+and+mechanisms+of+bacterial+mutagenesis+from+maximum-depth+sequencing.">Rates and mechanisms of bacterial mutagenesis from maximum-depth sequencing.</a> Nature. 534 (7609), 693-696 (2016).</li><li>Fusco, D., Gralka, M., Kayser, J., Anderson, A., Hallatschek, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excess+of+mutational+jackpot+events+in+expanding+populations+revealed+by+spatial+Luria-Delbr&#252;ck+experiments.">Excess of mutational jackpot events in expanding populations revealed by spatial Luria-Delbr&#252;ck experiments.</a> Nature Communications. 7, (2016).</li><li>Halligan, D. L., Keightley, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+mutation+accumulation+studies+in+evolutionary+genetics.">Spontaneous mutation accumulation studies in evolutionary genetics.</a> Annual Review of Ecology Evolution and Systematics. 40 (1), 151-172 (2009).</li><li>J&#243;nsson, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parental+influence+on+human+germline+de+novo+mutations+in+1,548+trios+from+Iceland.">Parental influence on human germline de novo mutations in 1,548 trios from Iceland.</a> Nature. 549, (2017).</li><li>Kra&#353;ovec, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+mutation+rate+is+a+plastic+trait+associated+with+population+density+across+domains+of+life.">Spontaneous mutation rate is a plastic trait associated with population density across domains of life.</a> PLoS Biology. 15 (8), (2017).</li><li>Kra&#353;ovec, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation+rate+plasticity+in+rifampicin+resistance+depends+on+Escherichia+coli+cell-cell+interactions.">Mutation rate plasticity in rifampicin resistance depends on Escherichia coli cell-cell interactions.</a> Nature Communications. 5, 3742 (2014).</li><li>Massey, R. C., Buckling, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+regulation+of+mutation+rates+at+specific+sites.">Environmental regulation of mutation rates at specific sites.</a> Trends in Microbiology. 10 (12), 580-584 (2002).</li><li>Lynch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+drift,+selection+and+the+evolution+of+the+mutation+rate.">Genetic drift, selection and the evolution of the mutation rate.</a> Nature Review Genetics. 17 (11), 704-714 (2016).</li><li>Foster, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress-induced+mutagenesis+in+bacteria.">Stress-induced mutagenesis in bacteria.</a> Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 42 (5), 373-397 (2007).</li><li>Kra&#353;ovec, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Where+antibiotic+resistance+mutations+meet+quorum-sensing.">Where antibiotic resistance mutations meet quorum-sensing.</a> Microbial Cell. 1 (7), 250-252 (2014).</li><li>Kra&#353;ovec, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opposing+effects+of+final+population+density+and+stress+on+Escherichia+coli+mutation+rate.">Opposing effects of final population density and stress on Escherichia coli mutation rate.</a> The ISME Journal-Multidisciplinary Journal of Microbial Ecology. 12, 2981-2987 (2018).</li><li>Lea, D., Coulson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+distribution+of+the+numbers+of+mutants+in+bacterial+populations.">The distribution of the numbers of mutants in bacterial populations.</a> Journal of Genetics. 49 (3), 264-285 (1949).</li><li>Armitage, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+statistical+theory+of+bacterial+populations+subject+to+mutation.">The statistical theory of bacterial populations subject to mutation.</a> Journal of the Royal Statistical Society. Series B (Methodological. 14 (1), 1-40 (1952).</li><li>Koch, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation+and+growth+rates+from+Luria-Delbr&#252;ck+fluctuation+tests).">Mutation and growth rates from Luria-Delbr&#252;ck fluctuation tests).</a> Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. 95 (2-3), 129-143 (1982).</li><li>Cairns, J., Overbaugh, J., Miller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin+of+mutants.">The origin of mutants.</a> Nature. 335 (6186), 142-145 (1988).</li><li>Stewart, F. M., Gordon, D. M., Levin, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluctuation+analysis:+the+probability+distribution+of+the+number+of+mutants+under+different+conditions.">Fluctuation analysis: the probability distribution of the number of mutants under different conditions.</a> Genetics. 124 (1), 175-185 (1990).</li><li>Drake, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+constant+rate+of+spontaneous+mutation+in+DNA-based+microbes.">A constant rate of spontaneous mutation in DNA-based microbes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 88 (16), 7160-7164 (1991).</li><li>Ma, W. T., Sandri, G. V., Sarkar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+Luria-Delbr&#252;ck+distribution+using+discrete+convolution+powers.">Analysis of the Luria-Delbr&#252;ck distribution using discrete convolution powers.</a> Journal of Applied Probability. 29 (2), 255-267 (1992).</li><li>Shapiro, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+mutation+-+Who's+really+in+the+garden.">Adaptive mutation - Who's really in the garden.</a> Science. 268 (5209), 373-374 (1995).</li><li>Matic, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+variable+mutation+rates+in+commensal+and+pathogenic+Escherichia+coli.">Highly variable mutation rates in commensal and pathogenic Escherichia coli.</a> Science. 277 (5333), 1833-1834 (1997).</li><li>Rosche, W. A., Foster, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+mutation+rates+in+bacterial+populations.">Determining mutation rates in bacterial populations.</a> Methods. 20 (1), 4-17 (2000).</li><li>Rosenberg, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolving+responsively:+Adaptive+mutation.">Evolving responsively: Adaptive mutation.</a> Nature Reviews Genetics. 2 (7), 504-515 (2001).</li><li>Lynch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+the+mutation+rate.">Evolution of the mutation rate.</a> Trends in Genetics. 26 (8), 345-352 (2010).</li><li>Zheng, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+practical+guide+to+the+Luria-Delbr&#252;ck+protocol.">A new practical guide to the Luria-Delbr&#252;ck protocol.</a> Mutation Research. 781, 7-13 (2015).</li><li>Boesen, J. J. B., Niericker, M. J., Dieteren, N., Simons, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+variable+is+a+spontaneous+mutation-rate+in+cultured-mammalian-cells.">How variable is a spontaneous mutation-rate in cultured-mammalian-cells.</a> Mutation Research. 307 (1), 121-129 (1994).</li><li>Melnyk, A. H., Wong, A., Kassen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fitness+costs+of+antibiotic+resistance+mutations.">The fitness costs of antibiotic resistance mutations.</a> Evolutionary Applications. 8 (3), 273-283 (2015).</li><li>Sun, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+polyploidy+causes+phenotypic+delay+and+influences+bacterial+evolvability.">Effective polyploidy causes phenotypic delay and influences bacterial evolvability.</a> PLoS Biology. 16 (2), (2018).</li><li>Frenoy, A., Bonhoeffer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Death+and+population+dynamics+affect+mutation+rate+estimates+and+evolvability+under+stress+in+bacteria.">Death and population dynamics affect mutation rate estimates and evolvability under stress in bacteria.</a> PLoS Biology. 16 (5), (2018).</li><li>Foster, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+determining+spontaneous+mutation+rates.">Methods for determining spontaneous mutation rates.</a> Methods in Enzymology. , 195-213 (2006).</li><li>Wrande, M., Roth, J. R., Hughes, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accumulation+of+mutants+in+&amp;#34;aging&amp;#34;+bacterial+colonies+is+due+to+growth+under+selection,+not+stress-induced+mutagenesis.">Accumulation of mutants in &amp;#34;aging&amp;#34; bacterial colonies is due to growth under selection, not stress-induced mutagenesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (33), 11863-11868 (2008).</li><li>Adrien, M., R&#233;my, D., St&#233;phane, D., Bernard, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=flan:+An+R+package+for+inference+on+mutation+models.">flan: An R package for inference on mutation models.</a> The R Journal. 9. 334, (2017).</li><li>Garibyan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+the+rpoB+gene+to+determine+the+specificity+of+base+substitution+mutations+on+the+Escherichia+coli+chromosome.">Use of the rpoB gene to determine the specificity of base substitution mutations on the Escherichia coli chromosome.</a> DNA Repair. 2 (5), 593-608 (2003).</li><li>Stewart, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluctuation+tests:+how+reliable+are+the+estimates+of+mutation+rates?.">Fluctuation tests: how reliable are the estimates of mutation rates?.</a> Genetics. 137 (4), 1139-1146 (1994).</li><li>Baba, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+Escherichia+coli+K-12+in-frame,+single-gene+knockout+mutants:+the+Keio+collection.">Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection.</a> Molecular Systems Biology. 2 (1), (2006).</li><li>Yamagishi, J. -. I., Yoshida, H., Yamayoshi, M., Nakamura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nalidixic+acid-resistant+mutations+of+the+gyrB+gene+of+Escherichia+coli.">Nalidixic acid-resistant mutations of the gyrB gene of Escherichia coli.</a> Molecular and General Genetics MGG. 204 (3), 367-373 (1986).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+novel+mutations+associated+with+cycloserine+resistance+in+Mycobacterium+tuberculosis.">Identification of novel mutations associated with cycloserine resistance in Mycobacterium tuberculosis.</a> Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 72 (12), 3272-3276 (2017).</li><li>Lang, G. I., Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimating+the+per-base-pair+mutation+rate+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Estimating the per-base-pair mutation rate in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 178 (1), 67-82 (2008).</li><li>Uphoff, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+activation+of+a+DNA+damage+response+causes+cell-to-cell+mutation+rate+variation.">Stochastic activation of a DNA damage response causes cell-to-cell mutation rate variation.</a> Science. 351 (6277), 1094-1097 (2016).</li><li>Robert, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation+dynamics+and+fitness+effects+followed+in+single+cells.">Mutation dynamics and fitness effects followed in single cells.</a> Science. 359 (6381), 1283-1286 (2018).</li><li>Kong, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rate+of+de+novo+mutations+and+the+importance+of+father/'s+age+to+disease+risk.">Rate of de novo mutations and the importance of father/'s age to disease risk.</a> Nature. 488 (7412), 471-475 (2012).</li><li>Narasimhan, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimating+the+human+mutation+rate+from+autozygous+segments+reveals+population+differences+in+human+mutational+processes.">Estimating the human mutation rate from autozygous segments reveals population differences in human mutational processes.</a> Nature Communications. 8 (1), 303 (2017).</li></ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Elke schatting van een mutatie snelheid moet de bereikte precisie maximaliseren om te zorgen voor herhaalbaarheid en reproduceerbaarheid binnen en tussen studies34. Voor een fluctuatie test zijn er drie kritische overwegingen. De eerste twee zijn ingesteld in het opgegeven protocol, maar moeten worden verholpen (Zie Figuur 3) als het protocol is aangepast om te werken met verschillende stammen of omgevingen. Eerst is het kiezen van de juiste fenotypische marker. Voor bacteriën, het is aanbevolen om te schatten van de tarieven bij een van twee marker loci, rpoB of Gyra, verlenen van resistentie tegen antibiotica rifampicine en nalidixinezuur, respectievelijk. De doelgrootte voor mutaties op antibioticaresistentie bij deze twee loci is verschillend. Er zijn 79 en 20 unieke mutaties die resistentie verlenen voor respectievelijk rifampicine37 en nalidixinezuur40 . In de praktijk, dit betekent dat gemiddeld, rifampicine resistente mutanten vaker worden waargenomen. Dus, de eerste vraag (Q1 in Figuur 3) die moet worden beantwoord is of de stam is een Mutator. Wanneer constitutieve mutators worden bestudeerd, waar veel waargenomen Mutant kolonies worden verwacht, is het beter om een marker te gebruiken met een kleinere doelgrootte (bijv. nalidixinezuur). Zie Figuur 2B, waar de mutatie percentages van de constitutieve Mutator E. coli K-12 BW25113 Δmutt werden geschat met behulp van nalidixinezuur als marker. Bij het werken met nonmutator bacteriestammen die een wild type hebben (d.w.z. normale) Mutatie snelheid, is rifampicine een betere keuze (Zie Figuur 2a). Als om een of andere reden meer waargenomen mutanten nodig zijn, is een relevante marker weerstand tegen een cycloserine. Voor deze marker, resistentie mutaties kunnen ontstaan in meer dan tien genen41, wat betekent dat de doelgrootte is zelfs groter dan voor rifampicine. Bij het bestuderen van gist en archaea wordt aanbevolen om de mutatie percentages te schatten in 25 s ribosomale eiwitten en URA3, waardoor resistentie wordt gegeven aan hygromycine B en 5-fluoro-orotic acid (5-FOA), respectievelijk.
De tweede kritische overweging is het volume van parallelle culturen. Welk volume moet worden gebruikt, hangt af van het werkelijke aantal waargenomen mutanten. Het verwachte aantal waargenomen mutanten wordt beïnvloed door de doelgrootte van de gekozen fenotypische marker, het vermogen van de stam om mutaties te herstellen en te voorkomen (de gemiddelde mutatie snelheid), en het draagvermogen van de omgeving, die wordt beïnvloed door zowel de gebruikte media als het kweek volume. Als geen parallelle culturen Mutant kolonies bevatten die resistent zijn tegen rifampicine, dan moet cycloserine worden gebruikt of moet het aantal vergulde cellen worden verhoogd. Dit kan worden bereikt door meer glucose toe te voegen aan een minimaal medium of door cellen te kweken in een rijkere (of complete) omgeving. In veel gevallen wordt een dergelijke toename van de bevolkingsdichtheid echter geassocieerd met een afname van de mutatie snelheid, resulterend in een beperkte, eventuele, toename van het aantal gemuteerde kolonies10. Als het verhogen van de voedingsstoffen is geen oplossing, dan is het verhogen van het aantal cellen door het verhogen van het volume van elke parallelle cultuur een optie. Wanneer de omgeving minimale zouten met suiker als enige bron van koolstof en energie bevat (d.w.z. het antwoord op Q2 in Figuur 3 is "minimaal medium"), dan moeten de volumes tussen 0,5 en 1,5 ml worden gebruikt. Als de omgeving rijk is, moeten de volumes van parallelle culturen tussen de 0,35 − 1 mL liggen. De laatste vraag betreft het mediane aantal resistente kolonies. Als er te weinig Mutant kolonies worden waargenomen (d.w.z. dat het antwoord op Q3 in Figuur 3 0 is) en de omgeving niet moet worden gewijzigd, dan moet het volume van parallelle culturen worden verhoogd of moet het antibioticum met een grotere doelgrootte (bijv. cycloserine) worden gebruikt. Aan de andere kant, als er veel Mutant kolonies worden waargenomen op alle selectieve platen (meer dan ~ 150 per plaat, Zie Figuur 3), dan moet het aantal geplateerde cellen worden verlaagd, wat meestal betekent dat een lager volume wordt gebruikt of dat het overschakelen naar een antibioticum met een kleinere doelgrootte (bijv. nalidixinezuur).
Zodra het volume is gekozen, is het het beste dat alle parallelle culturen op 1 96 Deep well plate hetzelfde volume hebben. Dat maakt een preciezere bepaling mogelijk van het werkelijke volume van parallelle culturen van het gewicht van de plaat. Wanneer mutatie percentages van een bepaald genotype worden vergeleken tussen verschillende omgevingen, is het opnieuw het beste om hetzelfde volume parallelle culturen in alle omgevingen te gebruiken. Als nalidixinezuur wordt gebruikt voor de raming van wild type (d.w.z. normale) Mutatie percentages of een andere fenotypische marker die een nog kleinere doelgrootte heeft dan nalidixinezuur, moet het volume nog meer worden verhoogd. Een optie is het maken van parallelle culturen in 50 mL buizen met volumes van maximaal 15 mL. Zo werden 10 mL parallelle culturen bereid in buizen van 50 mL bij het schatten van de E. coli K-12 MG1655 mutatie snelheid naar nalidixinezuur (Zie Figuur 2A). Vervolgens werden de parallelle culturen van 10 mL op de selectieve TA agar geplateerd en in grote 150 mm platen gegoten in plaats van standaard 90 mm Petri schalen. Het nadeel van het voorbereiden van parallelle culturen in buizen van 50 mL is dat de doorvoer aanzienlijk lager is in vergelijking met de mutatie percentages in een 96 diepe goed plaat. Een oplossing is om het aantal parallelle culturen te verminderen. Dit heeft echter invloed op de nauwkeurigheid van de raming van m, die afhangt van het verwachte aantal mutationele gebeurtenissen en het aantal parallelle culturen26. Het verkrijgen van een verdeling van de waargenomen mutanten met 14 − 17 parallelle culturen (zoals gedaan in Figuur 2), is een goede balans tussen een solide doorvoer en een aanvaardbaar precisieniveau26 van 20%. Een mediaan precisieniveau van 17,5% is vergelijkbaar met de mediane precisie met een interkwartielbereik van 16,4% (5,7% − 38,9%, n = 580) berekend op basis van een veel grotere gegevensset10. Daarom is het aanbevolen dat bij het bereiden van parallelle culturen in 96 diepe goed platen of 50 mL buizen de verdeling van de waargenomen mutanten wordt verkregen met ten minste 14 parallelle culturen. Wanneer mutatie percentages worden geschat in verschillende omgevingen is het raadzaam om precisie niveaus te testen door het doen van een multiplaat experiment, waarbij alle 96 parallelle culturen op één plaat worden geteeld in dezelfde omgeving. Bovendien is het bij de voorbereiding van parallelle culturen van cruciaal belang dat entmateriaal een laag aantal cellen bevat, omdat het de kans verkleint dat er resistente cellen in het entmateriaal aanwezig zijn. Reeds bestaande resistente mutanten zijn niet gewenst in het entmateriaal, omdat ze in aantallen toenemen en een gazon creëren op selectieve platen en de mutatie snelheid niet mogelijk is. Bijvoorbeeld, in de meeste nonmutator E. coli populaties, mutatie snelheid tot rifampicine resistentie is in de volgorde van ~ 10-8. Om te voorkomen dat de cultuur wordt geënt met een bestaande resistente Mutant, moet men dus inenten met minder dan 108 cellen (bijv. 103− 104 cellen). De laatste kritieke stap is ervoor te zorgen dat voordat selectieve agar-platen worden geïnineerd, het oppervlak van de selectieve agar volledig droog is. Spreiders kunnen niet worden gebruikt als er 6-well platen worden gebruikt en het initiële volume van een parallelle kweek bijvoorbeeld 1 mL is. De platen moeten in steriele omstandigheden onbedekt worden gelaten om de ondergrond vloeibaar te laten drogen. De tijd die dit kost kan zeer variabel zijn, afhankelijk van de omgevingscondities en de toestand van de platen. Deze tijd moet worden geminimaliseerd, maar kan maximaal enkele uren.
De fluctuatie test heeft inherente beperkingen. Het assays fenotypische markers van mutatie alleen in een kleine subset van het genoom. De assay vereist dus grote populaties die een voldoende aantal generaties doorlopen om voldoende mutaties te observeren om een percentage te schatten. Dit betekent dat fluctuatie testen alleen kunnen worden gebruikt op organismen die in staat zijn om snel een groot aantal generaties door te gaan, zoals bacteriën, bakkersgist42of vloeibare-kweek zoogdiercellen30. Mutaties zijn ook zeldzame gebeurtenissen die zich voordoen in de specifieke biochemische omstandigheden van een bepaalde cel. Het feit dat fluctuatie-assays in de loop van de tijd over grote populaties cellen kijken, betekent dat die omstandigheden aanzienlijk kunnen verschillen. Met behulp van deze test is het dus moeilijk om de progressie van de mutatie percentages van een bepaalde populatie van de lag-fase naar de vroege en late exponentiële fase te bestuderen en uiteindelijk tot een stationaire fase. Elke differentiatie van mutatie percentages tussen afzonderlijke cellen binnen de populatie is volledig verborgen voor de fluctuatie test. Eencellige mutatie dynamiek kan worden bestudeerd met een single-molecule tracking van DNA-reparatie proteïne MutS43 of door het tellen van Foci van geaccumuleerde mutl eiwitten44. Recente ontwikkelingen op het gebied van high-throughput sequencing hebben het ook mogelijk gemaakt om mutatie percentages van ouder-nakomelingen trio's9,45 en multi Generation stambomen46direct te schatten. Dergelijke methodologische vooruitgang begint de directe telling mogelijk te maken van mutaties die zich binnen één generatie voordoen. Deze directe aanpak heeft echter dure en State-of-the-art technologieën nodig zoals fluorescentiemicroscopie, microfluïdica of whole-genoom sequencing. Aan de andere kant is de fluctuatie test relatief goedkoop en zijn er alleen standaard laboratoriumapparatuur nodig. Het doen van meer fluctuatie testen zal ook het genereren van nieuwe hypothesen die kunnen worden getest met meer directe eencellige benaderingen vergemakkelijken.
Er is een lang bestaande belangstelling voor de studie van mutaties, dus de fluctuatie test zal waarschijnlijk een veelgebruikte methode blijven. Het aantal citaties van het zaad van Luria en Delbrück5 in de afgelopen 4 jaar (2015-2018) behoren allemaal tot de top vijf voor citaties van dit document. Echter, vanwege een grote hoeveelheid nauwkeurig handmatig werk dat nodig is om een fluctuatie test goed uit te voeren, voeren de meeste studies slechts een handvol fluctuatie testen uit. Dit is echter onvoldoende om de milieu-afhankelijkheden van de mutatie snelheid te onthullen. Door het stroomlijnen van fluctuatie testen met behulp van multi well-platen, zoals uitgelegd in dit document, is de huidige maximale doorvoer mogelijk 11 diepe put-platen (55 fluctuatie-assays) parallel, zoals hier beschreven. Het uitvoeren van twee reeksen fluctuatie testen die met een dag parallel worden gespreid, maakt het mogelijk om tot 110 assays per week uit te voeren. Een andere stap verandering in de doorvoer kan nog mogelijk zijn door het automatiseren van verschillende stappen van de fluctuatie testen van de zuiver handmatige protocol gegeven. Ook moet voor het bestuderen van de milieu-afhankelijkheden van de mutatie snelheid rekening worden gehouden met de bevolkingsdichtheid. Vorige resultaten10 tonen aan dat wanneer bekende factoren die de mutatie snelheid beïnvloeden administratief worden verantwoord, het beheersen van de bevolkingsdichtheid de variatie in mutatie-rate schattingen met meer dan 90% kan verminderen. Om de dichtheid te beheersen, raden we aan dat Nt (gebruikt voor het inschatten van de mutatie snelheid) onafhankelijk wordt bepaald van de methode die wordt gebruikt om de bevolkingsdichtheid te bepalen. Bij bacteriën kan Nt worden bepaald door CFU en dichtheid, bijvoorbeeld met een op ATP gebaseerde luminescentie test10.
Hoge doorvoer en beheersing van de dichtheid zijn beide essentieel bij het bestuderen van hoe de ecologische context van een organisme de spontane mutatie snelheid beïnvloedt. Het kennen van het bestaan van mutatie percentage plasticiteit is belangrijk, maar het begrijpen van de oorzaken en effecten zijn belangrijke uitdagingen die moeten worden vervuld als de mutatie snelheid plasticiteit moet worden opgenomen in een bredere biologische context. De fluctuatie test is een geweldig hulpmiddel dat kan worden gebruikt om veel hypothesen te testen, omdat resultaten snel worden verkregen en assays goedkoop zijn ten opzichte van andere methoden. Het podium wordt bijvoorbeeld ingesteld om omgevings afhankelijkheden van mutatie snelheid in bacteriële Gemeenschappen en microbiomen te bestuderen. Aanpassing van de fluctuatie test aan coculturen kan de hypothese testen dat spanningen elkaars mutatie percentages beïnvloeden via kleine moleculen. Het doen van duizenden fluctuatie testen met coculturen kan bepalen of stammen variëren, zowel in hun vermogen om elkaars mutatie percentages te wijzigen als in hun gevoeligheid om hun mutatie snelheid door anderen te laten veranderen. Misschien is variatie tussen stammen in gevoeligheid voor manipulatie van de mutatie snelheid toe te schrijven aan specifieke genetische variatie. Dit kan onze opvattingen over hoe evolutie werkt in complexe gemeenschappen te transformeren, niet in het minst in voorbeelden van groot belang, zoals hoe antimicrobiële resistentie ontstaat.

In 1901 bedacht de Nederlandse botanicus Hugo de Vries de term mutatie1. Zesentwintig jaar later, toen Hermann Joseph Muller de mutagene werking van röntgenstraling2ontdekte, werden mutaties al gezien als een van de drijvende krachten van de evolutie. De aard van mutaties was echter niet duidelijk. Om de fundamentele vraag te beantwoorden of mutaties spontaan ontstaan (d.w.z. een spontane mutatie) of in reactie op selectie (d.w.z. een geïnduceerde mutatie), was een methode nodig om mutationele gebeurtenissen te observeren. Een dergelijke methode zou het verwachte aantal mutaties per celdeling meten of wat al bekend was als mutatie percentage3,4.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60406/60406fig1a.jpg"> Figuur 1: Schematische illustratie van het uitvoeren van de fluctuatie test met een microbiële stam in een 96 diepe goed plaat. A) inoculeren en acclimatiseren cellen in 50 ml buisjes die vijf verschillende omgevingen bevatten ("rood", "blauw", "groen", "paars" en "oranje" assays). B) Maak parallelle culturen met een klein aantal gevoelige cellen in een 96 Deep well plate. De ' rode ' assay heeft 20 parallelle culturen, terwijl de ' blauwe ', ' groene ', ' paarse ' en ' oranje ' assays allemaal 19 parallelle culturen hebben. De posities van de parallelle culturen op de 96 Deep well plate zijn willekeurig. Randomisatie kan worden gedaan met het aanvullende script LayoutGenerator. R of door een andere tool. De lay-out in de rechterbovenhoek is het resultaat van de randomisatie. C) de diepte plaat 96 inbroed en de cellen laten verdelen en spontaan muteren. Zes culturen uit Deep Wells a1, B1, C1, E1, F1 en G1 laten zien hoe het aantal mutanten fluctueert: 4, 0, 2, 2, 1 en 4 rode cellen na respectievelijk de derde celdeling. Het aantal mutanten verschilt niet alleen vanwege het verschillende aantal spontane mutaties (0, 1, of 2 zoals aangegeven door de eerste rode cel), maar ook omdat het belangrijk is dat tijdens een cultuur cyclus spontaan een resistentie mutatie ontstaat (celdeling 1, 2 of 3). D) na de incubatie van de 96 Deep well plate wordt het aantal mutanten bepaald door plating 81 parallelle culturen. Op de lay-out zijn dit cirkels zonder vetgeslepen randen. De volledige parallelle cultuur wordt op een put van een 6-put met een selectieve agar-plaat geplateerd. E) de resterende 15 culturen worden verdund en geplateerd op de niet-selectieve agar om het gemiddelde aantal cellen (Nt) te bepalen. Op de lay-out zijn deze gelabeld als Ntwells en hebben vetgeslepen randen. Voor elke bepaling wordt gemiddeld over drie parallelle culturen berekend. Rechtsonder is een Petri schaaltje met een niet-selectieve agar plaat met 25 CFUs van een verdunde cultuur geteeld in een deep well D1 (onderdeel van een ' groene ' test). F) na incubatie van de selectieve 6-goed platen werd het aantal waargenomen mutanten geteld en werd het verwachte aantal mutationele gebeurtenissen, m, geschat met behulp van een maximale waarschijnlijkheid Estimator. G) wetende dat zowel het aantal mutaties, men het aantal cellen per test, Nt, de mutatie snelheid werd geschat als m/Nt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60406/60406fig1alarge.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
Salvador Luria en Max Delbrück in 1943 bieden een ingenieuze oplossing voor dit probleem met de fluctuatie test5 (Zie Figuur 1). De test begint met meerdere populaties (met de naam parallelle culturen) die worden geïnitieerd met een klein aantal Microbiële cellen (Figuur 1a, B). Na een groei in een goedaardige, niet-selectieve omgeving (Figuur 1C) worden parallelle culturen overgebracht op platen met een selectieve marker (Fagen, antibiotica, enz.), waarbij alleen cellen met een resistentie mutatie overleven en een kolonie kunnen produceren (Figuur 1D). De belangrijkste verwachting was dat als resistentie mutaties worden geïnduceerd, het aantal cellen dat een mutatie draagt, verdeeld moet worden onder verschillende populaties met het gemiddelde gelijk aan de variantie. Wat Luria en Delbrück met de fluctuatie test vonden, is dat het aantal mutanten drastisch fluctueerde en dat de variantie in het aantal mutanten onder verschillende populaties aanzienlijk groter was dan het gemiddelde. Luria en Delbrück toonden daarmee aan dat mutaties spontaan zijn. Ze toonden aan dat mutaties spontaan tevoorschijn komen wanneer het DNA wordt gerepliceerd, en het aantal mutanten is afhankelijk van wanneer de mutatie optreedt tijdens de groei van de populatie. Zie Figuur 1C, waarbij zes populaties, elk geïnitieerd met een microbiële cel (in blauw), geen, 1 of 2 enkelvoudige mutaties ervaren. Populaties a1, E1 en F1 ondervonden een enkele mutatie (eerste rode cel), maar omdat een enkele mutatie spontaan op verschillende tijdstippen tijdens een cultuur cyclus tevoorschijn komt, eindigden populaties met een heel verschillend aantal waargenomen mutanten (vier, twee en één). Aan de andere kant eindigden de populaties C1 en G1 met hetzelfde aantal waargenomen mutanten als E1 en a1, ondanks het ervaren van twee mutationele gebeurtenissen in plaats van één. De fluctuatie van de waargenomen mutanten onder de populaties gaf niet alleen de test de naam, maar toonde ook aan dat een Mutante frequentie (d.w.z. het aandeel van Mutante cellen) een ontoereikende indicator is van de mutatie snelheid.
Het algemene doel van de fluctuatie test is het inschatten van de spontane mutatie snelheid van een bepaald genotype van bacteriën of andere eencellige organismen die in een bepaalde vloeibare omgeving groeien. De fluctuatie test blijft het meest geschikte hulpmiddel voor het bestuderen van de afhankelijkheid van microbiële mutatie percentages en maakt een snelle en goedkope schatting van het mutatie percentage mogelijk. Alternatieve benaderingen voor de schatting van de mutatie snelheid, zoals maximale dieptevolgorde bepaling6, populatie volgordebepaling7, mutatie accumulatie experimenten8, of het vergelijken van genoomsequenties van een nakomelingen aan die van de ouders9 zijn veel meer bewerkelijk, en dus slecht geschikt voor het mogelijk opsporen van milieu-afhankelijkheden. Dynamische aspecten van de aanmaak en de herstelling van een mutatie zijn echter grotendeels ontoegankelijk voor een fluctuatie test of voor een van de methoden om een mutatie percentage hierboven weer te gegeven. Om te bestuderen hoe het aantal mutaties verandert in tijd, ruimte of tussen individuele cellen binnen een populatie, zijn eencellige benaderingen11,12 noodzakelijk, die, naast het meer bewerkelijk dan fluctuatie testen, zeer gespecialiseerde vaardigheden en apparatuur vereisen.
In de praktijk is een fluctuatie test het tellen van cellen die een fenotypische marker krijgen als gevolg van een mutatie die optreedt in een omgeving zonder selectie voor die marker. De meta-analyse van honderden gepubliceerde assays10 toont aan dat ten minste 39 verschillende fenotypische markers zijn gebruikt sinds het begin van de assay in 1943. De fluctuatie test kan worden gebruikt om gemiddelden en omgevings afhankelijkheid van mutatie percentages te vergelijken tussen laboratorium-, klinische, nonmutator-en mutatorstammen die in permissieve omgevingen groeien. De bepaling maakt het mogelijk de mutatie snelheid te schatten in cellen met verschillende genetische achtergronden die groeien in zowel minimale als rijke omgevingen. De assay is niet alleen geschikt voor populaties die als monocultuur groeien, maar kan ook worden gebruikt voor het bestuderen van de effecten van celcelinteracties op mutatie snelheden11. Wanneer de stam van belang wordt gecocultureerd met een tweede stam, en een neutrale marker wordt gebruikt om te onderscheiden van de stammen, mutatie percentages kunnen worden getest voor twee stammen in dezelfde buis op hetzelfde moment.
Fluctuatie testen hebben aangetoond dat de spontane mutatie snelheid afhangt van zowel het genotype van een cel als de omgeving12 en een eigenschap is die zelf zich ontwikkelt13. Wanneer de mutatie snelheid van een bepaald genotype verandert met de omgeving, wordt dit beschreven als een mutatie percentage plasticiteit11. De percentages van de kunststof mutatie zijn het meest grondig aangepakt voor stress-geïnduceerde mutagenese (SIM)14. Bovendien, met behulp van fluctuatie testen, is onlangs aangetoond dat de dichtheid waaraan een populatie van cellen groeit (meestal een batch cultuur bij het draagvermogen) nauw verbonden is met mutatie percentages over bacteriën en unicellulaire eukaryoten. De mutatie snelheid per genoom per generatie daalt in dichte populaties met maar liefst 23-voudige10,11. Dit dichtheids geassocieerde mutatie percentage plasticiteit (VOCHTIG) kan afhangen van een quorum detectiesysteem15 en onafhankelijk van SIM16handelen.
Hier wordt een gedetailleerd protocol gepresenteerd voor de fluctuatie test die wordt gebruikt om de Escherichia coli -stam K-12 te bestuderen en resistentie te verkrijgen tegen het antibioticum rifampicine in een minimale glucose-media omgeving. Dit protocol moet echter worden gezien als een basissjabloon die kan worden gebruikt om een breed scala aan microben te bestuderen door simpelweg de cultuur condities en fenotypische markers van mutatie aan te passen. Het protocol is geëvolueerd van de oprichting5,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29 door het gebruik ervan op een breed scala van microben en zelfs kankercellen30 en is gewijzigd om te verhogen de doorvoer, die essentieel was voor het goed testen van omgevings afhankelijkheden van microbiële mutatie snelheden10,11,16. Het hier beschreven protocol dekt niet alle methodologische en analytische kwesties van de fluctuatie test die al goed besproken zijn in de literatuur, met name fitness effecten van resistente mutaties31, fenotypische delay32, celdood33, en de geschiktheid van verschillende beschikbare algoritmen om mutatie percentages te schatten26,34. Dit kan bijvoorbeeld van belang zijn wanneer de milieu afhankelijkheid van fitness effecten kan leiden tot foutieve variatie in de mutatie ratio schattingen35. We merken echter op dat de analytische tools die we hier gebruiken, kunnen omgaan met de variatie in Mutant fitness en celdood. Zoals besproken in de toelichting en de discussie, is het ook aanbevolen dat meerdere fenotypische markers die waarschijnlijk niet dezelfde milieu afhankelijke fitness effecten hebben, in aanmerking worden genomen. Dit protocol zal mensen in staat stellen om routinematig milieu-afhankelijkheden van mutatie percentages te testen in de diversiteit van microbiële stammen en omgevingen. Assays mutaties in verschillende omgevingen is nog niet grondig getest en zodra de bevolkingsdichtheid wordt overwogen, fluctuatie testen kunnen een nauwkeuriger schatting van de mutatie rate10geven. Dit protocol zal het mogelijk maken meer fluctuatie testen uit te voeren, zoals nodig is voor het begrijpen van de mechanismen die de mutatie percentages onderstrepen, wat op zijn beurt van vitaal belang is voor het begrijpen van evolutie, carcinogenese, veroudering en antimicrobiële resistentie.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 ml Microcentrifuge tubes</td>
			<td>Starlab International GmbH</td>
			<td>S1615-5550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8877-10g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>REF 657102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>90mm Petri Dishes Triple Vented</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>REF 120189</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 deep-well plate (Masterblock 2 ml)</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>REF 780270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium sulfate</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A/6440/53</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Agar</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>REF 214010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto yeast extract</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>REF 212750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cycloserine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1158005-250MG</td>
			<td>Only for assaying an alternative phenotypic marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose anhydrous</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>G/0500/61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml Centrifuge Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>REF 430828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-(+)-Arabinose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3256-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>M/1050/53</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalidixic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N8878-5G</td>
			<td>Only for assaying an alternative phenotypic marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate dibasic trihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5504-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0662-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rifampicin</td>
			<td>EMD Millipore Corp, USA</td>
			<td>557303-1GM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S/3160/60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectophotometer</td>
			<td>Jenway</td>
			<td>6320D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiamine hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4625-25g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trisodium citrate dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S1804-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>1278-7099</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring microbial mutation rates with the fluctuation assay

Fluctuatie-assays worden veel gebruikt voor het inschatten van mutatie percentages in microben die groeien in vloeibare omgevingen. Veel culturen worden elk met een paar duizend cellen geïnocculeerd, elk gevoelig voor een selectieve marker die fenotypisch kan worden onderzocht. Deze parallelle culturen groeien voor vele generaties in de afwezigheid van de fenotypische marker. Een subset van culturen wordt gebruikt om het totale aantal cellen met risico op mutaties te schatten (d.w.z. de bevolkingsgrootte aan het einde van de groeiperiode, of Nt). De overgebleven culturen worden op de selectieve agar geplateerd. De verdeling van de waargenomen resistente mutanten onder parallelle culturen wordt vervolgens gebruikt om het verwachte aantal mutationele gebeurtenissen, m, te schatten met behulp van een wiskundig model. Het verdelen van m door Nt geeft de geschatte mutatie snelheid per Locus per generatie. De test heeft drie kritische aspecten: de gekozen fenotypische marker, het gekozen volume van parallelle culturen, en ervoor zorgen dat het oppervlak van de selectieve agar volledig droog is vóór de incubatie. De assay is relatief goedkoop en heeft alleen standaard laboratoriumapparatuur nodig. Het is ook minder bewerkelijk dan alternatieve benaderingen, zoals Mutatie accumulatie en eencellige assays. De assay werkt op organismen die vele generaties snel doorlopen en het hangt af van veronderstellingen over de fitness-effecten van markers en celdood. Echter, recent ontwikkelde tools en theoretische studies betekenen dat deze problemen nu analytisch kunnen worden aangepakt. De bepaling maakt een schatting van de mutatie snelheid mogelijk van verschillende fenotypische markers in cellen met verschillende genotypen die in afzondering of in een gemeenschap groeien. Door meerdere testen parallel uit te voeren, kan assays worden gebruikt om te bestuderen hoe de milieucontext van een organisme van invloed is op de spontane mutatie snelheid, wat cruciaal is voor het begrijpen van antimicrobiële resistentie, carcinogenese, veroudering en evolutie.

Resultaten werden verzameld met het gerapporteerde protocol in vier verschillende weken door drie verschillende individuele onderzoekers, waarbij elke week een 96 Deep well plate werd gebruikt voor het genereren van vijf mutatie rate schattingen. In totaal 3 96 diepte platen gegenereerd 15 mutatie percentage schattingen (± 95% betrouwbaarheidsinterval, CI) in E. coli k-12 MG1655 (Figuur 2A, zoals gebruikt in het Protocol), terwijl 1 96 Deep well plate werd gebruikt voor vijf schattingen (± 95% BI) van e. coli k-12 BW25113 Δmutt Mutant (Figuur 2B). In Figuur 2 is de mediane precisie met het interkwartielbereik van schatting m 17,5% (1,00% − 28,9%, n = 20). Precisie is een coëfficiënt van de variatie van het verwachte aantal mutationele gebeurtenissen (m) berekend als σm / m x 100% (waarbij σ wordt berekend zoals eerder aangegeven38). Onbewerkte gegevens voor Figuur 2 zijn beschikbaar in het aanvullende gegevensbestand "Krasovec_etal_JoVE_data. csv". Het aanvullende gegevensbestand gaat vergezeld van een R-script om Figuur 2te genereren. Zie ook aanvullende tabel 2 voor meer informatie over bacteriestammen en aanvullende tabel 3, waarbij kolommen in het gegevensbestand worden toegelicht. Gegevenspunten verkregen met rifampicine en nalidixinezuur werden eerder gepubliceerd in Krašovec et al.10 en hebben dezelfde id's hier als bij de eerste publicatie.
In Figuur 2A worden de MG1655-mutatie percentages van drie verschillende fenotypische markers, cycloserine, rifampicine en nalidixinezuur weergegeven. Hier werden mutatie percentages beoordeeld in Davis minimal medium met 80, 125 en 250 mg/L glucose, zoals uitgelegd in het protocol. In één geval werd 1.000 mg/L glucose gebruikt (Figuur 1B). In de praktijk kan een initiële glucoseconcentratie worden gebruikt. Zoals verwacht, mutatie percentages waren hoger voor de cycloserine resistentie, laagste voor nalidixinezuur resistentie, en de snelheid van rifampicine resistentie was in het midden. Dit is in overeenstemming met de bekende doel grootten voor deze drie weerstanden, waarbij de grootste is voor de cycloserine en de kleinste voor het nalidixinezuur. De bespreking en Figuur 3 geven informatie over hoe de doel grootten, volumes van parallelle culturen en het niveau van voedingsstoffen in de omgeving kunnen worden benut om de meting van microbiële mutatie snelheden met de fluctuatie test te optimaliseren.
De fluctuatie test laat duidelijk zien welke stam een constitutieve Mutator is en welke een normale mutatie snelheid heeft. De Δmutt -stam had een ongeveer 50x hogere mutatie ratio aan nalidixinezuur resistentie (Figuur 2B) als MG1655 (Figuur 2A). Om de mutatie snelheid van een bepaald genotype in verschillende omgevingen te bepalen, wordt echter aanbevolen om ten minste vijf replicaten per genotype per omgeving te gebruiken met slechts één fenotypische marker. Zie de aanvullende informatie in Krašovec et al.10voor een gedetailleerd overzicht van de statistische methoden die eerder werden gebruikt om dit type experiment te analyseren.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60406/60406fig2a.jpg"> Figuur 2: representatief percentage van de mutatie percentages geschat door de fluctuatie test in populaties van Escherichia coli . A) de mutatie snelheid zoals bepaald door het gerapporteerde protocol in wild type MG1655 (cirkels). De figuur toont de mutatie percentages in de aanwezigheid van rifampicine (licht blauwe cirkels), nalidixinezuur (rode cirkels) en cycloserine (donker blauwe cirkels) weerstand. Voor nalidixinezuur werden grotere kweek volumes van 10 mL gebruikt (Zie aanvullend gegevensbestand). Gegevens voor rifampicine en nalidixinezuur worden opnieuw uitgezet uit Figuur 2a in krašovec et al.10. B) de mutatie snelheid tot nalidixinezuur resistentie in de keio39 Δmutt Mutant (rode driehoeken). Noteer de logaritmische schaal op de as van de mutatie snelheid. Foutbalken = 95% betrouwbaarheidsintervallen berekend zoals beschreven in het protocol. De gegevens worden opnieuw uitgezet uit Figuur 4a in krašovec et al.10. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60406/60406fig2alarge.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60406/60406fig3a.jpg"> Figuur 3: een stroomdiagram voor het oplossen van de fluctuatie test. Het stroomdiagram moet vanaf de top worden gevolgd, waarbij de drie vragen op zijn beurt worden aangepakt in de gele diamanten, waarbij het protocol wordt aangepast aan de inhoud van de resulterende groene dozen en de uitvoering van het protocol zoals aangegeven in de rode ovalen. Zie de eerste drie alinea's van de discussie voor meer informatie over het oplossen van problemen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60406/60406fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
Aanvullende tabel 1: formules voor de media die in het protocol worden gebruikt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60406/supptable1.xlsx" target="_blank">Klik hier om deze tabel te bekijken (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden).</a>
Aanvullende tabel 2: bacteriestammen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60406/supptable2.xlsx" target="_blank">Klik hier om deze tabel te bekijken (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden).</a>
Aanvullende tabel 3: gedetailleerde beschrijving van de kolommen in het bestand met onbewerkte gegevens Krasovec_etal_JoVE_data. CSV. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60406/supptable3.xlsx" target="_blank">Klik hier om deze tabel te bekijken (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden).</a>
Aanvullende gegevensbestanden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60406/Supplemental_Data_Files.zip" target="_blank">Klik hier om deze bestanden te downloaden.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Microbial Mutation Rates with the Fluctuation Assay at JoVE.com

Measuring Microbial Mutation Rates with the Fluctuation Assay

Hier wordt een protocol gepresenteerd om een fluctuatie test uit te voeren en de microbiële mutatie snelheid te schatten met behulp van fenotypische markers. Dit protocol stelt onderzoekers in staat om mutaties in diverse microben en omgevingen te testen, waarbij wordt bepaald hoe genotype en ecologische context de spontane mutatie percentages beïnvloeden.

Meten van microbiële mutatie snelheden met de fluctuatie test

Fluctuation assays are widely used for estimating mutation rates in microbes growing in liquid environments. Many cultures are each inoculated with a few ...

Het protocol maakt mutatieschatting in microben mogelijk. Het kan aantonen hoe een organismen milieucontext de waarschijnlijkheid van spontane mutatie beïnvloedt. Het belangrijkste voordeel van dit protocol is dat het goedkoop en efficiënt is.Veel schattingen van de mutatiesnelheid kunnen parallel worden gemaakt. Mutaties die dit protocol meet kunnen resistentie tegen antibiotica volgen. Dit protocol kan gebruikt worden om een van 's werelds grootste uitdaging te bestuderen, antimicrobiële resistentie.Deze methode kan inzicht geven in hoe cellen ecologische context de evolutie van antimicrobiële resistentie kunnen beïnvloeden. Dit protocol schat mutatiesnelheden in de monocultuur van laboratoriumstam, maar we hebben het toegepast op klinische stammen en co-cultuur van twee stammen om bioneutraal molecuul te onderscheiden. De meest gevaarlijke reacties die in dit protocol worden gebruikt zijn antibiotica rifampicine en methanol.Dus zorg ervoor dat u beschermende handschoenen en brillen te gebruiken wanneer rifampicine is opgelost in methanol. Om te beginnen inenten met deze procedure drie mL vloeibare lysogeny bouillon met een schaafwond van ijs uit de E.coli K12 glycerol voorraad. Schud de LB-cultuur bij 120 tpm en bij 37 graden celsius gedurende ongeveer zeven uur.Verdun hierna de cultuur 2000-voudig met de zoutoplossing. Voeg 10 mL vloeibare Davis minimale medium aan elke buis met elk met een andere concentratie van glucose zoals hier getoond. Voeg 100 microliters van de verdunde cultuur toe aan drie 50 mL screen cap conische onderste polymeerbuizen.Bereid 22 mL van vijf verschillende oplossingen van vloeibare Davis minimale medium met glucose, elk in zijn eigen 50 mL buis als overzicht in het tekstprotocol. Om inocula voor te bereiden op de omgevingen, meet eerst de optische dichtheid van de nachtelijke culturen op 600 nanometer. Verdun de culturen met zoutoplossing en voeg tussen 2200 en 110000 cellen toe aan elke omgeving.Dit zal ervoor zorgen dat het entmateriaal voor één mL van de omgeving tussen 1000 en 5000 cellen bevat. Maak vervolgens een willekeurige lay-out van parallelle culturen voor 196 diepe put plaat. Breng een mL van de ingeënte media in elke put van de plaat volgens de lay-out.Bevestig vervolgens het deksel van de plaat met tape en weeg de hele plaat met het deksel en tape. Schud de plaat bij 250 tpm en bij 37 graden Celsius gedurende 24 uur. Plaats hierna twee L gedestilleerd water in de couveuse om de hoeveelheid verdamping in de experimentele sets te stabiliseren.Bepaal de inoculumgrootte door 10 microliter van elk van de ingeënte media op een niet-selectieve TA agar-plaat te beplating. Gebruik een steriele L-vormige strooier tot het agaroppervlak droog is. Bereid vervolgens selectieve TA agar met rifampicin in zes putplaten.Pipette vijf mL van selectieve TA agar in elke put van de zes putplaten. Tel de kolonie vormende eenheden op de niet-selectieve agar platen, en bepalen van de grootte inocula. Na 24 uur van incubatie, wegen de gehele diepe put plaat om de hoeveelheid verdamping te bepalen, die waarschijnlijk rond 10%Breng drie willekeurig gekozen culturen per test in gelabelde microcentrifuge buizen.Plaat de resterende 81 parallelle culturen van de diepe put plaat op de selectieve TA agar met rifampicin. Verwijder vervolgens de deksels van de selectieve agarplaten en laat ze in steriele omstandigheden aan het licht komen om alle vloeistof op het oppervlak van de agar uit te drogen. Bepaal het aantal kolonievormende eenheden door de culturen uit de microcentrifugebuizen te verdunnen met behulp van vijf 10-voudige verdunningsstappen door 900 microliters zoute oplossing te mengen en te wervelen met 100 microliters van de kweek per verdunningsstap.Plaat 40 microliter van de uiteindelijke verdunning op de niet-selectieve TA agar en plaats het deksel op de platen. Incubeer 's nachts bij 37 graden Celsius. Zodra alle putten op een zes put plaat vrij zijn van de cultuur vloeistof, plaats het deksel terug op.Dan incubeer de platen met het deksel op op 37 graden Celsius voor 44-48 uur. Op dag vier, tel de kolonie vormen eenheden op de niet-selectieve agar platen. Op dag vijf, tellen het aantal kolonies die resistent zijn tegen het antibioticum op de selectieve TA agar platen.Noteert de verdeling over parallelle culturen van het waargenomen aantal mutanten voor een bepaalde test. Open de juiste software op de computer. Laat in het tabblad hypothesetests de waarden op hun standaardwaarden staan.Klik op bladeren en selecteer het tekstbestand met de verdeling van de waargenomen mutanten. Na het uploaden van het bestand, klik op uitgevoerde test. Aan de rechterkant, onder het resultaat van de test, onder de One Sample ML-test, vind het mutatienummer.Dit is m, het verwachte aantal mutatie-voorvallen. Schat vervolgens de mutatiesnelheid van bepaald genotype in een bepaalde omgeving als overzicht in het tekstprotocol. De MG1655 mutatiepercentages van drie verschillende fenotypische markers, cycloserine, rifampicine en nalidixic zuur worden hier weergegeven.Mutatiepercentages worden beoordeeld in Davis minimaal medium met glucoseconcentratie van 80 mg/L, 125 mg/L en 250 mg/L. In één geval wordt een glucoseconcentratie van 1000 mg/L gebruikt. Zoals verwacht zijn de mutatiepercentages hoger voor cycloserineweerstand, het laagst voor nalidixïnezuurweerstand en de snelheid van rifampicineresistentie is in het midden.De fluctuatietest laat duidelijk zien welke stam een constitutieve mutator is en welke normale mutatiesnelheden heeft. Aangezien de mutT deletant stam had een mutatie snelheid om nalidixic zuur resistentie die ongeveer 50x hoger is dan de controle MG1655 stam. Tijdens het voorvormen van dit protocol, zorg ervoor dat uw cellen goed groeien.Ze moeten groeien tot uniforme dichtheid in parallelle culturen met dezelfde omgeving. Een follow-up van deze procedure is het bepalen van de DNA-sequentie van het rpoB-gen in resistente kolonies. Om te bepalen hoe het spectrum van mutaties tot rifampicineresistentie varieert met milieumicrobiële genotype.Fluctuatietesten in de 20e eeuw toonden aan hoe mutatie spontaan en willekeurig is met respect voor het milieu. Nu werpen ze nieuw licht op hoe mutatiepercentages variëren met het milieu genetisch, ecologisch, zelfs sociaal.

Research

JoVE Journal

Genetics

Monitoring Spatial Segregation in Surface Colonizing Microbial Populations

Monitoring ruimtelijke segregatie in Surface Kolonisatie microbiële populaties

Microbes provide an intriguing system to study social interaction among individuals within a population. The short generation times and relatively simple ...

Purification of High Molecular Weight Genomic DNA from Powdery Mildew for Long-Read Sequencing

Zuivering van hoog molecuulgewicht Genomic DNA van echte meeldauw voor Long-Read Sequencing

The powdery mildew fungi are a group of economically important fungal plant pathogens. Relatively little is known about the molecular biology and genetics ...

Measuring mRNA Levels Over Time During the Yeast S. cerevisiae Hypoxic Response

Measuring mRNA Levels Over Time During the Yeast S. cerevisiae Hypoxic Response

Het meten van de mRNA niveaus na verloop van tijd tijdens de gist S. cerevisiae hypoxische reactie

Complex changes in gene expression typically mediate a large portion of a cellular response. Each gene may change expression with unique kinetics as the ...

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

Generatie van een gen-verstoord Streptococcus mutans stam zonder Gene klonen

Typical methods for the elucidation of the function of a particular gene involve comparative phenotypic analyses of the wild-type strain and a strain in ...

Determining Genome-wide Transcript Decay Rates in Proliferating and Quiescent Human Fibroblasts

Bepalen van genoom-brede Transcript verval tarieven in delende en zwakke menselijke fibroblasten

Quiescence is a temporary, reversible state in which cells have ceased cell division, but retain the capacity to proliferate. Multiple studies, including ...

Measuring Gene Expression in Bombarded Barley Aleurone Layers with Increased Throughput

Meten van de genexpressie in gebombardeerd gerst Aleurone lagen met grotere gegevensdoorvoer

The aleurone layer of barley grains is an important model system for hormone-regulated gene expression in plants. In aleurone cells, genes required for ...

Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere

Verkennen van de wortel Microbiome: extraheren van gegevens van de bacteriële Gemeenschap uit de bodem, de rhizosfeer, en de wortel Endosphere

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to ...

Measuring Exercise Levels in Drosophila melanogaster Using the Rotating Exercise Quantification System (REQS)

Measuring Exercise Levels in Drosophila melanogaster Using the Rotating Exercise Quantification System REQS

Meten van oefening niveaus bij Drosophila melanogaster met behulp van de roterende oefening kwantificering (systeemvereisten)

Drosophila melanogaster is a new model organism for studies in exercise biology. To date, two main exercise systems, the Power Tower and the Treadwheel ...

Determining 3'-Termini and Sequences of Nascent Single-Stranded Viral DNA Molecules during HIV-1 Reverse Transcription in Infected Cells

Bepalende 3'-Termini en sequenties van ontluikende Single-Stranded virale DNA moleculen tijdens HIV-1 Reverse transcriptie in geïnfecteerde cellen

Monitoring of nucleic acid intermediates during virus replication provides insights into the effects and mechanisms of action of antiviral compounds and ...