Name: measuring microbial mutation rates with the fluctuation assay
Uploaded: 2019-11-28T13:00:00
Duration: 7 min 44 s
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RK wurde von BB/M020975/1 und der University of Manchester School of Biological Sciences unterstützt. HR wurde von BB/J014478/1 unterstützt. GG wurde von der BBSRC Doctoral Training Partnership BB/M011208/1 unterstützt. DRG wurde von der UKRI-Awardnummer MR/R024936/1 unterstützt.

1. Tag 1: Impfung und Akklimatisierung der Kulturen
<ol><li>3 ml flüssige Lysogeneriebrühe impfen (LB, siehe Zusatztabelle 1) mit einem Eiskratzer aus dem E. coli MG1655 Glycerinbestand (18% Glycerin, -80 °C). Schütteln Sie die LB-Kultur bei 120 Umdrehungen pro Minute für 7 h bei 37 °C. HINWEIS: In diesem Experiment wird E. coli K12 MG1655, der in LB wächst, verwendet, aber dieser Test kann mit jedem E. coli-Stamm oder anderen kultivierbaren mikrobiellen Arten durchgeführt werden. Inkubationstemperatur, Inkubationszeiten und Nährstoffgehalt der Wachstumsmedien können alle Schwankungen nach Arten oder Stämmen unterliegen.</li>
	<li>Verdünnen Sie die Kultur 2.000-fach mit der Saline-Lösung. Fügen Sie drei 50 ml Schraubverschluss konische Bodenpolymerrohre (50 ml) mit 10 ml flüssigem Davis-Minimalmedium (DM, siehe Zusatztabelle 1)hinzu, die jeweils 80 mg/L, 125 mg/L oder 250 mg/L Glukose enthalten. Dies ist das gleiche Medium (d. h. die Umgebung), in dem die Mutationsrate geschätzt wird. Schütteln Sie die Kulturen bei 120 Umdrehungen von 120 Umdrehungen bei 37 °C. HINWEIS: Die Wahl der Medien unterliegt der Variation nach Arten, Stamm oder Forschungsfrage.</li>
</ol>2. Tag 2: Erzeugung von Mutanten in Parallelkulturen
<ol><li>Zuerst bereiten Sie die Umgebungen, in denen die Bakterien kultiviert werden. Immer 10% mehr vorbereiten als erforderlich (d.h. 21 ml Kulturen benötigen 22 ml). Bereiten Sie 22 ml von 1) DM mit 80 mg/L Glukose, 2) DM mit 125 mg/L Glukose, 3) DM mit 250 mg/L Glukose, 4) DM mit 80 mg/L Glukose und 5) DM mit 250 mg/L Glukose in fünf 50 ml-Röhrchen vor. Beschriften Sie sie als GLC-80A, GLC-125, GLC-250A, GLC-80B und GLC-250B.</li>
	<li>Bereiten Sie Die inokula für die Umgebungen vor. Stellen Sie sicher, dass das Inoculum für 1 ml der Umgebung 1.000 bis 5.000 Zellen enthält. Gehen Sie folgen sie den folgenden Schritten.
	<ol>
<li>Messen Sie die optische Dichte (OD) von Nachtkulturen (ab Schritt 1.2) bei 600 nm.</li>
		<li>Verdünnen Sie jede Nachtkultur, um eine Enddichte von 1.000-5.000 Zellen pro ml DM mit Glukose zu erreichen. Wenn die in 2.2.1 gemessene OD 0,3 beträgt, bedeutet dies, dass wir eine 100-fache Verdünnung (in Kochlösung) der Nachtkultur herstellen und dann 11 l dieser Lösung in die 22-ml-Umgebung einfügt.</li>
	</ol></li>
	<li>Bereiten Sie parallele Kulturen vor. HINWEIS: Dieses Protokoll ist für eine 96 tiefe Wellplatte geschrieben, die fünf Fluktuationstests (die maximal angemessene Anzahl auf einer 96-Well-Platte) unter Verwendung von drei Umgebungen durchführt. Erfahrungsgemäß können mehrere Tiefbohrplatten parallel betrieben werden.<ol>
<li>Erstellen Sie ein zufälliges Layout von parallelen Kulturen für eine 96 tiefe Brunnenplatte. Das ergänzende R-Skript LayoutGenerator.R (siehe Layout in Abbildung 1B) kann dafür verwendet werden. Positionieren Sie jede Parallelkultur auf der 96-Tiefbrunnenplatte entsprechend dem Layout. HINWEIS: Durch Ausführen von LayoutGenerator.R wird sichergestellt, dass der erste Assay 20 parallele Kulturen hat und dass der zweite, dritte, vierte und fünfte Assays jeweils 19 parallele Kulturen aufweisen.</li>
		<li>Übertragen Sie 1 ml geimpfte Medien in jeden Brunnen einer 96 tiefen Brunnenplatte entsprechend dem randomisierten Layout.</li>
		<li>Befestigen Sie den Deckel der tiefen Brunnenplatte mit dem Klebeband. Fixieren Sie den Deckel nicht fest, da das Kulturwachstum empfindlich auf die Belüftungsmenge reagiert.</li>
		<li>Die gesamte Platte mit Deckel und Klebeband wiegen und bei 250 Umdrehungen bei 24 Stunden bei 37 °C schütteln. Legen Sie 2 L destilliertes Wasser in den Inkubator, um die Verdunstungsmenge unter den Versuchssätzen zu stabilisieren.</li>
	</ol></li>
	<li>Bestimmen Sie die Inokulumgröße, indem Sie 10 l der geimpften Medien auf die nicht selektive Tetrazolium (TA)-Agarplatte plattieren (siehe Ergänzende Tabelle 1). Verwenden Sie einen sterilen L-förmigen Streuer, bis die Agaroberfläche trocken ist. Ta-Agarplatten über Nacht bei 37 °C inkubieren. HINWEIS: TA Agar ist ein reicher Agar, der den Zucker L-Arabinose und den wasserlöslichen Farbstoff 2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid enthält, der in seiner oxidierten Form farblos ist. Wenn Bakterien den Farbstoff reduzieren, wird er durch die Bildung von Formazan rot. Kolonien auf TA Agar, die L-Arabinose nicht verwenden können, sind dunkelrot. Andere Sorten, wie MG1655, sind rosa. Die Verwendung von TA-Agar anstelle von Standard-LB-Agar wird empfohlen, da farbige Bakterienkolonien leichter zu erkennen sind, was die Koloniezählung zuverlässiger und schneller macht.</li>
	<li>Bereiten Sie selektiven TA-Agar mit Rifampicin in 6 Brunnenplatten vor. Pipette 5 ml des selektiven TA-Agars in jeden Brunnen der 6 Brunnenplatten. Bereiten Sie das Antibiotikum Rifampicin kurz vor der Zugabung zum TA-Agar vor. HINWEIS: Wenn Cycloserin als Marker verwendet wird, verwenden Sie Davis minimal medium mit 250 mg/L Glukose, ergänzt mit Agar und L-Arabinose und 2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid als selektiver Agar. Nämlich, TA Agar wählt nicht nur Zellen, die resistent gegen Cycloserin sind, weil Trypton und Hefe-Extrakt (beide die wesentlichen Komponenten von TA Agar) enthalten die Aminosäure D-Alanin. Diese Aminosäure antagonisiert die antimikrobielle Wirkung des Cycloserins und ermöglicht es allen Zellen, eine Kolonie zu bilden.<ol>
<li>Lassen Sie die selektiven und verbleibenden nicht-selektiven Platten im Dunkeln (z. B. in einer Box) bei Raumtemperatur.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Tag 3: Plattierungskulturen auf selektiven und nicht-selektiven Agarplatten
<ol><li>Zählen Sie koloniebildende Einheiten (KBE) auf den nicht-selektiven Agarplatten und bestimmen Sie die Größe der Inocula durch Multiplikation der KBE mit 100. Dies ist ein Verhältnis zwischen einem Volumen der Parallelkultur (1 ml = 1.000 l) und dem plattierten Volumen (10 l). HINWEIS: Werden nicht-selektive Platten gekühlt gelagert, kann die KBE später gezählt werden.</li>
	<li>Nach 24 h Inkubation die gesamte Tiefbrunnenplatte wiegen, um die Verdunstungsmenge zu bestimmen. Dies dürfte bei etwa 10 % liegen.</li>
	<li>Berechnen Sie das durchschnittliche Volumen einer Parallelkultur nach 24 h Inkubation (V[24h]) in Mikrolitern mit einem Ausgangsvolumen V[0h] = 1.000 l und das Gewicht der Platte in Mikroliter umgerechnet, wobei die Dichte des Wachstumsmediums in mg/l gemessen wird. In dieser Studie wird eine Dichte von 1 mg/l verwendet: <img src="/files/ftp_upload/60406/60406eq1.jpg">
</li>
	<li>Übertragen Sie die drei zufällig ausgewählten Kulturen pro Assay (insgesamt 15, hervorgehoben mit einem schwarzen Kreis im Layout in Abbildung 1B) in beschriftete Mikrozentrifugenrohre. Lassen Sie sie auf der Bank, um sie später zu verwenden (siehe Schritt 3.6), um die endgültige Bevölkerungsgröße (oder Nt)zu bestimmen.</li>
	<li>
Die restlichen 81 Parallelkulturen aus der tiefen Brunnenplatte auf den selektiven TA-Agar mit Rifampicin geben. Pipette eine ganze Parallelkultur von der 96 Tiefenbrunnenplatte in einen Brunnen einer 6-Well-Platte. Stellen Sie sicher, dass jede 6-Well-Platte Parallelkulturen aus mehr als einem Fluktuationstest enthält.
	<ol>
<li>Entfernen Sie die Deckel von den selektiven Agarplatten und lassen Sie sie unter sterilen Bedingungen unbedeckt. Trocknen Sie die gesamte Flüssigkeit auf der Oberfläche des selektiven TA-Agars aus. HINWEIS: Der Agar, der vollständig trocken ist, ist entscheidend. Allerdings überdosieren Sie den selektiven TA-Agar nicht, da er nicht knacken darf.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Während die selektiven TA-Agarplatten trocknen, was bis zu mehreren Stunden dauern kann, bestimmen Sie Nt der 15 Kulturen, die in Schritt 3.4 mit Kolonieformeinheiten (CFU) hergestellt werden.
	<ol>
<li>Bestimmen Sie die KBE, indem Sie die Kulturen aus den Mikrozentrifugenröhrchen verdünnen. Verwenden Sie fünf 10-fache Verdünnungsschritte, mischen und wirbeln 900 L Kochstofflösung mit 100 l der Kultur auf jedem Schritt. Platte 40 l der letzten Verdünnung (mit einem Verdünnungsfaktor von 105) auf dem nicht selektiven TA-Agar und inkubierten Platten über Nacht bei 37 °C nach unten. HINWEIS: Die Verdünnungsserie in 96 Wellplatten kann mit einer Mehrkanalpipette durchgeführt werden, die die Geschwindigkeit dieses Schritts erhöhen kann.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sobald alle Brunnen auf einer 6-Well-Platte frei von der Kulturflüssigkeit sind, legen Sie den Deckel wieder auf und legen Sie die 6 Brunnenplatte mit dem Deckel nach unten auf die Bank, bis alle 6 Brunnenplatten trocken sind. Sobald alle trocken sind, inkubieren Sie die Platten deckel bei 37 °C für 44-48 h. HINWEIS: Für andere Marker (Nalidixsäure, Cycloserin, Hygromycin B oder 5-FOA) inkubieren die Platten für 68-72 Stunden. Stellen Sie sicher, dass die Luftfeuchtigkeit im Inkubator hoch ist. Es ist wichtig, dass die selektiven Agarplatten während der Inkubationszeit nicht austrocknen.</li>
</ol>4. Tag 4: Bestimmung der Anzahl der Zellen in den Kulturen
<ol><li>Zählen Sie die KBE auf den nicht-selektiven Agarplatten. Schätzen Sie die Anzahl lebensfähiger Zellen in der Kultur, indem Sie die KBE mit dem Verdünnungsfaktor (105) und dem Verhältnis zwischen dem berechneten Durchschnittsvolumen V[24h] in Mikrolitern (siehe Schritt 3.3) und dem plattierten Volumen (40 l) multiplizieren: <img src="/files/ftp_upload/60406/60406eq2.jpg">
</li>
	<li>
Nt eines bestimmten Genotyps, der in einer bestimmten Umgebung wächst, ist der Mittelwert dieser Werte aus den drei Kulturen.</li>
</ol>5. Tag 5: Schätzung der Mutationsrate
<ol><li>
Zählen Sie die Anzahl der Kolonien, die gegen das Antibiotikum resistent sind, auf den selektiven TA-Agarplatten (d. h. die Anzahl der resistenten Zellen, die durch spontane Mutation in der Tiefbrunnenplatte an den Tagen 2-3 entstanden sind). Erfassen Sie die Verteilung der beobachteten Anzahl von Mutanten für einen bestimmten Test zwischen parallelen Kulturen (z. B. 16 oder 17 Werte, einschließlich Nullzählungen). HINWEIS: Wenn selektive Platten gekühlt gelagert werden, können Kolonien, die gegen das Antibiotikum resistent sind, später gezählt werden.<ol>
<li>Verwenden Sie jede Verteilung, um die Anzahl der Mutationsereignisse mmit dem R-Paket flan36zu schätzen. HINWEIS: Es gibt auch das R-Paket rSalvador mit ähnlicher Funktionalität29.</li>
		<li>Speichern Sie die Verteilung der beobachteten Mutanten für einen Assay in einer Textdatei als einzelne Spalte.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Verwenden Sie Shinyflan Software (http://shinyflan.its.manchester.ac.uk/), um m wie unten beschrieben zu schätzen.
	<ol>
<li>Auf der Registerkarte Hypothesentests lassen Werte als Standardwerte (d. h. Unbekannte Fitness angekreuzt, Schätzmethode = Maximale Likelihood (ML), Verteilung der Mutant-Lebensdauer = Exponential (LD-Modell), Winsor-Parameter = 1.024, Mutationszahl und Fitness = 1, Konfidenzstufe = 0,95, Anzahl der Klassen und Maximalwert = 100).</li>
		<li>Klicken Sie auf Durchsuchen, und wählen Sie die Textdatei mit der Verteilung der beobachteten Mutanten aus. Versuchen Sie es zuerst mit der Datei "Ergänzende Daten".</li>
		<li>Nachdem Sie die Datei hochgeladen haben, klicken Sie auf Test durchführen. Auf der rechten Seite unter dem Ergebnis des Testsfinden Sie unter dem One Sample ML-Test (LD-Modell) die Mutationsnummer. Dies ist m, die erwartete Anzahl von Mutationsereignissen.</li>
		<li>Unter dem 95 Prozent Konfidenzintervall für die Mutationszahl finden Sie die obere und untere Grenze von m.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sobald m und Nt (bestimmt durch KBE) verfügbar sind, schätzen Sie die <img src="/files/ftp_upload/60406/60406eq3.jpg"> </img>Mutationsrate eines bestimmten Genotyps in einer bestimmten Umgebung als . Teilen Sie die oberen und unteren Grenzen auf m durch Nt auf die gleiche Weise, um Konfidenzintervalle auf die Mutationsrate zu generieren (NB berücksichtigt dies nicht die Unsicherheit in Nt). HINWEIS: Die Ergebnisse werden als Mutationsrate pro rpoB-Lokus pro Generation dargestellt. Die Mutationsrate pro Basenpaar wird erzeugt, indem die Mutationsrate pro rpoB-Lokus durch 79 dividiert wird, was unser aktuelles Wissen darüber ist, wie viele Punktmutationen innerhalb eines rpoB-Gens Resistenz gegen Rifampicin37verleihen. Multiplikation der Mutationsrate pro Nukleotid mit der Größe des Chromosoms (E. coli K-12 MG1655 = 4.639.675 bp) ergibt die Mutationsrate pro Genom.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 5.1-5.3 mit den restlichen vier Fluktuationstests.</li>
</ol>

<ol>
	<li>de Vries, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Die+mutationstheorie.">Die mutationstheorie.</a> Versuche und beobachtungen &#252;ber die entstehung von arten im pflanzenreich. 1, (1901).</li><li>Muller, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+transmutation+of+the+gene.">Artificial transmutation of the gene.</a> Science. 66 (1699), (1927).</li><li>Muller, H. 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Die Autoren haben nichts zu verraten.

Jede Schätzung einer Mutationsrate muss die erreichte Genauigkeit maximieren, um die Wiederholbarkeit und Reproduzierbarkeit innerhalb und zwischen den Studien zu gewährleisten34. Für einen Fluktuationstest gibt es drei kritische Überlegungen. Die ersten beiden wurden im angegebenen Protokoll festgelegt, müssen jedoch behoben werden (siehe Abbildung 3), wenn das Protokoll für die Arbeit mit verschiedenen Stämmen oder Umgebungen angepasst ist. Zuerst ist es, den entsprechenden phänotypischen Marker zu wählen. Für Bakterien wird empfohlen, die Raten bei einem von zwei Marker-Loci, rpoB oder GyrAzu schätzen, was eine Resistenz gegen Antibiotika Rifampicin bzw. Nalidixsäure verleiht. Die Zielgröße für Mutationen zur Antibiotikaresistenz an diesen beiden Loci ist unterschiedlich. Es gibt 79 und 20 einzigartige Mutationen, die eine Resistenz gegen Rifampicin37 bzw. Nalidixsäure40 verleihen. In der Praxis bedeutet dies, dass im Durchschnitt Rifampicin resistente Mutanten häufiger beobachtet werden. Die erste Frage (Q1 in Abbildung 3), die beantwortet werden muss, ist also, ob es sich bei der Sorte um einen Mutator handelt. Wenn konstitutive Mutatoren untersucht werden, wo viele beobachtete mutierte Kolonien erwartet werden, ist es besser, einen Marker mit einer kleineren Zielgröße (z. B. Nalidixsäure) zu verwenden. Siehe Abbildung 2B, wo die Mutationsraten des konstitutiven Mutators E. coli K-12 BW25113-mutT unter Verwendung von Nalidixsäure als Marker geschätzt wurden. Bei der Arbeit mit Nichtmutator-Bakterienstämmen, die eine wilde (d. h. normale) Mutationsrate aufweisen, ist Rifampicin die bessere Wahl (siehe Abbildung 2A). Wenn aus irgendeinem Grund mehr beobachtete Mutanten benötigt werden, ist ein relevanter Marker die Resistenz gegen ein Cycloserin. Für diesen Marker können Resistenzmutationen in mehr als zehn Genen41auftreten, was bedeutet, dass die Zielgröße sogar größer ist als bei Rifampicin. Bei der Untersuchung von Hefe und Archaeen wird empfohlen, die Mutationsraten in 25S ribosomalen Proteinen und URA3 zu schätzen, was eine Resistenz gegen Hygromycin B bzw. 5-Fluor-Orosäure (5-FOA) aufweist.
Die zweite kritische Überlegung ist das Volumen paralleler Kulturen. Welches Volumen verwendet werden soll, hängt von der tatsächlichen Anzahl der beobachteten Mutanten ab. Die erwartete Anzahl der beobachteten Mutanten wird durch die Zielgröße des gewählten phänotypischen Markers, die Fähigkeit des Stammes, Mutationen zu reparieren und zu vermeiden (die durchschnittliche Mutationsrate), und die Tragfähigkeit der Umgebung beeinflusst, die sowohl durch die verwendeten Medien als auch durch das Kulturvolumen beeinflusst wird. Wenn keine Parallelkulturen mutierte Kolonien enthalten, die gegen Rifampicin resistent sind, sollte Cycloserin verwendet oder die Anzahl der plattierten Zellen erhöht werden. Dies kann erreicht werden, indem mehr Glukose zu einem minimalen Medium hinzugefügt wird oder durch das Wachsen von Zellen in einer reicheren (oder vollständigen) Umgebung. In vielen Fällen ist ein solcher Anstieg der Bevölkerungsdichte jedoch mit einer Verringerung der Mutationsrate verbunden, was zu einer begrenzten, wenn überhaupt, Zunahme der Zahl der beobachteten mutierten Kolonienum 10führt. Wenn die Erhöhung der Nährstoffe keine Lösung ist, dann ist es eine Option, die Anzahl der Zellen durch Erhöhung des Volumens jeder Parallelkultur zu erhöhen. Wenn die Umwelt minimale Salze mit Zucker als einzige reine Kohlenstoff- und Energiequelle enthält (d. h. die Antwort auf Q2 in Abbildung 3 ist "minimal mittel"), dann sollten Volumina zwischen 0,5 und 1,5 ml verwendet werden. Wenn die Umgebung reich ist, sollten die Volumes paralleler Kulturen zwischen 0,35 und 1 ml liegen. Die letzte Frage betrifft die durchschnittliche Anzahl resistenter Kolonien. Wenn zu wenige mutierte Kolonien beobachtet werden (d. h. die Antwort auf Q3 in Abbildung 3 ist 0) und die Umgebung nicht verändert werden soll, dann sollte das Volumen der Parallelkulturen erhöht oder das Antibiotikum mit einer größeren Zielgröße (z. B. Cycloserin) verwendet werden. Auf der anderen Seite, wenn viele mutierte Kolonien auf allen selektiven Platten beobachtet werden (mehr als 150 usd pro Platte, siehe Abbildung 3), dann sollte die Anzahl der plattierten Zellen verringert werden, was in der Regel bedeutet, ein geringeres Volumen zu verwenden oder zu einem Antibiotikum mit einer kleineren Zielgröße (z. B. Nalidixinsäure) zu wechseln.
Sobald das Volumen gewählt ist, ist es am besten, dass alle Parallelkulturen auf einer 96 tiefen Brunnenplatte das gleiche Volumen haben. Dies ermöglicht eine genauere Bestimmung des tatsächlichen Volumens der Parallelkulturen aus dem Gewicht der Platte. Wenn Mutationsraten eines bestimmten Genotyps zwischen verschiedenen Umgebungen verglichen werden, ist es wiederum am besten, das gleiche Volumen paralleler Kulturen in allen Umgebungen zu verwenden. Wenn Nalidixsäure zur Schätzung von Wildtyp-Mutationsraten (d. h. normal) verwendet wird oder ein anderer phänotypischer Marker verwendet wird, der eine noch kleinere Zielgröße als Nalidixsäure hat, muss das Volumen noch erhöht werden. Eine Möglichkeit besteht darin, Parallelkulturen in 50 ml-Rohren mit einem Volumen von bis zu 15 ml herzustellen. So wurden beispielsweise 10 ml Parallelkulturen in 50 ml-Röhrchen bei der Schätzung der Mutationsrate E. coli K-12 MG1655 zu Nalidixsäure hergestellt (siehe Abbildung 2A). Die parallelen 10 ml-Kulturen wurden dann auf den selektiven TA-Agar plattiert und in große 150-mm-Platten statt in standard90 mm Petrischalen gegossen. Der Nachteil der Vorbereitung von Parallelkulturen in 50 ml-Röhren ist, dass der Durchsatz im Vergleich zu den Assaying-Mutationsraten in einer 96-Tiefenbrunnenplatte deutlich geringer ist. Eine Lösung besteht darin, die Anzahl der Parallelkulturen zu verringern. Dies wirkt sich jedoch auf die Genauigkeit für die Schätzung von maus, die von der erwarteten Anzahl von Mutationsereignissen und der Anzahl der Parallelkulturenabhängt 26. Die Erlangung einer Verteilung der beobachteten Mutanten mit 14-17 Parallelkulturen (wie in Abbildung 2) ist ein gutes Gleichgewicht zwischen einem festen Durchsatz und einer akzeptablenGenauigkeitsstufe 26 von 20 %. Ein mittlerer Genauigkeitsgrad von 17,5 % ähnelt der Mediangenauigkeit mit einem Interquartilbereich von 16,4 % (5,7 % bis 38,9 %, n = 580), der aus einem viel größeren Datensatz10berechnet wird. Daher wird empfohlen, bei der Herstellung von Parallelkulturen in 96 Tiefenbrunnenplatten oder 50 ml-Rohren die Verteilung der beobachteten Mutanten mit mindestens 14 Parallelkulturen zu erhalten. Wenn Mutationsraten in verschiedenen Umgebungen geschätzt werden, wird empfohlen, Präzisionsstufen durch ein Multiplattenexperiment zu testen, bei dem alle 96 Parallelkulturen auf einer Platte in derselben Umgebung angebaut werden. Darüber hinaus ist es bei der Herstellung von Parallelkulturen entscheidend, dass Inocula eine geringe Anzahl von Zellen enthält, da es die Wahrscheinlichkeit verringert, dass resistente Zellen im Inokulum vorhanden sind. Bereits vorhandene resistente Mutanten sind im Inokulum nicht erwünscht, da sie an Zahl zunehmen und einen Rasen auf selektiven Platten erzeugen und eine Schätzung der Mutationsrate nicht möglich sein wird. In den meisten E. coli-Populationen ohne Mutator beträgt die Mutationsrate bis zur Rifampicin-Resistenz beispielsweise in der Größenordnung von 10-8. Um die Kultur nicht mit einem bereits vorhandenen resistenten Mutanten zu impfen, muss man also mit weniger als 108 Zellen (z.B. 103x 104 Zellen) impfen. Der letzte kritische Schritt besteht darin, sicherzustellen, dass vor der Inkubation selektiver Agarplatten die Oberfläche auf dem selektiven Agar vollständig trocken ist. Streuer können nicht verwendet werden, wenn beispielsweise 6-Well-Platten verwendet werden und das Anfangsvolumen einer Parallelkultur 1 ml beträgt. Die Platten müssen unter sterilen Bedingungen freigelegt werden, damit die Oberflächenflüssigkeit austrocknen kann. Die Zeit, die dies in Anspruch nimmt, kann sehr variabel sein, abhängig von den Umgebungsbedingungen und dem Zustand der Platten. Diese Zeit sollte minimiert werden, kann aber bis zu mehreren Stunden betragen.
Der Fluktuationstest hat inhärente Einschränkungen. Es untersucht phänotypische Mutationsmarker nur in einer kleinen Teilmenge des Genoms. Der Assay erfordert also große Populationen, die eine ausreichende Anzahl von Generationen durchlaufen, um genügend Mutationen zu beobachten, um eine Rate überhaupt abzuschätzen. Dies bedeutet, dass Fluktuationstests nur auf Organismen angewendet werden können, die in der Lage sind, schnell eine große Anzahl von Generationen zu durchlaufen, wie Bakterien, Bäckerhefe42oder flüssige Säugetierzellen30. Auch Mutationen sind seltene Ereignisse, die in den spezifischen biochemischen Umständen einer bestimmten Zelle auftreten. Die Tatsache, dass Fluktuationstests im Laufe der Zeit über große Populationen von Zellen hinweg aussehen, bedeutet, dass sich diese Umstände erheblich unterscheiden können. Anhand dieses Assays ist es daher schwierig, das Fortschreiten der Mutationsraten einer bestimmten Population von der Verzögerungsphase zur frühen und späten exponentiellen Phase und schließlich zu einer stationären Phase zu untersuchen. Jede Differenzierung der Mutationsraten zwischen einzelnen Zellen innerhalb der Population ist vollständig vor dem Fluktuationstest verborgen. Die Dynamik der Einzelzellmutation kann mit einer Einzelmolekül-Tracking des DNA-Reparaturproteins MutS43 oder durch Zählen von Brennpunkten von akkumulierten MutL-Proteinen44untersucht werden. Jüngste Fortschritte bei der Hochdurchsatzsequenzierung haben es auch ermöglicht, die Mutationsraten von Eltern-Nachkommen-Trios9,45 und Mehrgenerationen-Stammbaum46direkt abzuschätzen. Solche methodischen Fortschritte beginnen, die direkte Zählung von Mutationen zu ermöglichen, die innerhalb einer einzigen Generation auftreten. Dieser direkte Ansatz erfordert jedoch teure und hochmoderne Technologien wie Fluoreszenzmikroskopie, Mikrofluidik oder Vollgenomsequenzierung. Auf der anderen Seite ist der Fluktuationstest relativ kostengünstig und es wird nur Standard-Laborausrüstung benötigt. Mehr Fluktuationstests werden auch die Generierung neuartiger Hypothesen erleichtern, die mit direkteren einzelzelligen Ansätzen getestet werden können.
Es besteht ein langjähriges Interesse an der Untersuchung von Mutationen, so dass der Fluktuationstest wahrscheinlich eine weit verbreitete Methode bleiben wird. Die Anzahl der Zitate des wegweisenden Papiers von Luria und Delbrück5 in den letzten 4 Jahren (2015-2018) gehört enallt alle unter den Top 5 für Zitate dieser Zeitung. Aufgrund einer großen Menge an präziser manueller Arbeit, die für die ordnungsgemäße Durchführung eines Fluktuationstests erforderlich ist, führen die meisten Studien jedoch nur eine Handvoll Fluktuationstests durch. Dies reicht jedoch nicht aus, um die Umweltabhängigkeiten der Mutationsrate aufzudecken. Durch die Rationalisierung von Fluktuationstests mit Multiwell-Platten, wie in diesem Papier erläutert, ist der aktuelle maximale Durchsatz möglich 11 tiefe Brunnenplatten (55 Fluktuationstests) parallel, wie hier beschrieben. Das Parallele ausführen zwei Sätze von Fluktuationstests, die um einen Tag gestaffelt sind, ermöglicht die Durchführung von bis zu 110 Assays pro Woche. Eine weitere Schrittänderung des Durchsatzes kann noch möglich sein, indem verschiedene Schritte der Fluktuationstests aus dem rein manuellen Protokoll automatisiert werden. Auch bei der Untersuchung von Umweltabhängigkeiten der Mutationsrate muss die Bevölkerungsdichte berücksichtigt werden. Frühere Ergebnisse10 zeigen, dass die Kontrolle der Bevölkerungsdichte die Variation der Mutationsratenschätzungen um mehr als 90 % reduzieren kann, wenn bekannte Faktoren, die die Mutationsrate beeinflussen, berücksichtigt werden. Um die Dichte zu kontrollieren, empfehlen wir, Nt (zur Schätzung der Mutationsrate) unabhängig von der Methode zur Bestimmung der Bevölkerungsdichte zu bestimmen. Bei Bakterien kann Nt durch KBE und Dichte bestimmt werden, z.B. mit einem ATP-basierten Lumineszenz-Assay10.
Hoher Durchsatz und die Kontrolle der Dichte sind beides wichtig, wenn untersucht wird, wie sich der ökologische Kontext eines Organismus auf die spontane Mutationsrate auswirkt. Das Wissen um die Existenz der Plastizität der Mutationsrate ist wichtig, aber das Verständnis ihrer Ursachen und Wirkungen sind zentrale Herausforderungen, die bewältigt werden müssen, wenn die Plastizität der Mutationsrate in einen breiteren biologischen Kontext integriert werden soll. Der Fluktuationstest ist ein großartiges Werkzeug, das verwendet werden kann, um viele Hypothesen zu testen, da die Ergebnisse schnell erzielt werden und Assays im Vergleich zu anderen Methoden kostengünstig sind. Die Bühne ist beispielsweise für die Untersuchung von Umweltabhängigkeiten der Mutationsrate in Bakteriengemeinschaften und Mikrobiomen festgelegt. Die Anpassung des Fluktuationstests an Kokulturen kann die Hypothese testen, dass Stämme die Mutationsraten des jeweils anderen über kleine Moleküle beeinflussen. Tausende von Fluktuationstests mit Kokulturen können bestimmen, ob Stämme sowohl in ihrer Fähigkeit, die Mutationsraten des anderen zu modifizieren, als auch in ihrer Anfälligkeit für eine Änderung ihrer Mutationsrate durch andere variieren. Vielleicht ist die Variation zwischen stämmen in der Anfälligkeit für Mutationsratenmanipulation auf spezifische genetische Variationen zurückzuführen. Dies könnte unsere Ansichten darüber verändern, wie Evolution in komplexen Gemeinschaften funktioniert, nicht zuletzt in Beispielen von großer Bedeutung, wie z. B. wie antimikrobielle Resistenzen entstehen.

1901 prägte der niederländische Botaniker Hugo de Vries den Begriff Mutation1. 26 Jahre später, als Hermann Joseph Muller die mutagene Wirkung von Röntgenstrahlen2entdeckte, wurden Mutationen bereits als eine der treibenden Kräfte der Evolution wahrgenommen. Die Art der Mutationen war jedoch nicht klar. Um die grundsätzliche Frage zu beantworten, ob Mutationen spontan (d.h. eine spontane Mutation) oder als Reaktion auf die Selektion (d. h. eine induzierte Mutation) auftreten, war eine Methode zur Beobachtung von Mutationsereignissen erforderlich. Eine solche Methode würde die erwartete Anzahl von Mutationen pro Zellteilung oder das messen, was bereits als Mutationsrate bekannt war3,4.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60406/60406fig1a.jpg"> Abbildung 1: Schematische Darstellung der Durchführung des Fluktuationstestes mit einem mikrobiellen Stamm in einer 96 tiefen Bohrplatte. (A) Impf- und Akklimatisierungszellen in 50 ml-Röhren, die fünf verschiedene Umgebungen enthalten ('rot', 'blau', 'grün', 'lila' und 'orange'-Assays). (B) Bereiten Sie Parallelkulturen mit einer kleinen Anzahl empfindlicher Zellen in einer 96 tiefen Brunnenplatte vor. Der "rote" Assay hat 20 parallele Kulturen, während die "blauen", "grünen", "lila" und "orange" Assays alle 19 parallele Kulturen haben. Die Positionen der Parallelkulturen auf der 96-Tiefbrunnenplatte sind zufällig. Die Randomisierung kann mit dem Skript Supplementary LayoutGenerator.R oder mit einem anderen Tool durchgeführt werden. Das Layout oben rechts ist das Randomisierungsergebnis. (C) Inkubieren Sie die 96 tiefe Brunnenplatte und lassen Sie die Zellen teilen und spontan mutieren. Sechs Kulturen aus den Tiefbrunnen A1, B1, C1, E1, F1 und G1 zeigen, wie die Anzahl der Mutanten schwankt: 4, 0, 2, 2, 1 und 4 rote Zellen nach der dritten Zellteilung. Die Anzahl der Mutanten unterscheidet sich nicht nur aufgrund der unterschiedlichen Anzahl spontaner Mutationen (0, 1 oder 2, wie die erste rote Zelle zeigt), sondern auch, weil es wichtig ist, wenn während eines Kulturzyklus spontan eine Resistenzmutation entsteht (Zellteilung 1, 2 oder 3). (D) Nach der Inkubation der 96-Tiefbrunnenplatte wird die Anzahl der Mutanten durch Plattierung von 81 Parallelkulturen bestimmt. Auf dem Layout sind dies Kreise ohne fette Kanten. Die gesamte Parallelkultur ist auf einem Brunnen einer 6-Well-Platte mit einem selektiven Agar plattiert. (E) Die restlichen 15 Kulturen werden verdünnt und auf den nicht selektiven Agar plattiert, um die durchschnittliche Anzahl der Zellen zu bestimmen (Nt). Auf dem Layout sind diese als Ntwells beschriftet und haben fette Kanten. Für jeden Assay wird Nt über drei parallele Kulturen gemittelt. Unten rechts befindet sich eine Petrischale, die eine nicht-selektive Agarplatte mit 25 KBE einer verdünnten Kultur enthält, die in einem tiefen Brunnen D1 (Teil eines "grünen" Assays) angebaut wird. (F) Nach inkubationsweise der selektiven 6 Brunnenplatten wurde die Anzahl der beobachteten Mutanten gezählt und die erwartete Anzahl von Mutationsereignissen, m, wurde mit einem Maximum Likelihood-Schätzer geschätzt. (G) Unter Kenntnis der Anzahl der Mutationen, m, und der Anzahl der Zellen pro Assay, Nt, wurde die Mutationsrate als m/Ntgeschätzt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60406/60406fig1alarge.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Salvador Luria und Max Delbrück boten 1943 mit dem Fluktuationstest5 eine geniale Lösung für dieses Problem (siehe Abbildung 1). Der Test beginnt mit mehreren Populationen (parallele Kulturen), die mit einer kleinen Anzahl von mikrobiellen Zellen initiiert werden (Abbildung 1A,B). Nach dem Wachstum in einer gutartigen, nicht-selektiven Umgebung (Abbildung 1C) werden parallele Kulturen auf Platten übertragen, die einen selektiven Marker (Phagen, Antibiotika usw.) enthalten, wo nur Zellen mit einer Resistenzmutation überleben und eine Kolonie produzieren können (Abbildung 1D). Die Haupterwartung war, dass, wenn Resistenzmutationen induziert werden, die Anzahl der Zellen, die eine Mutation tragen, auf verschiedene Populationen verteilt werden sollte, wobei der Mittelwert gleich der Varianz ist. Was Luria und Delbrück mit dem Fluktuationstest herausgefunden haben, ist, dass die Zahl der Mutanten drastisch schwankte und dass die Varianz in der Anzahl der Mutanten zwischen verschiedenen Populationen deutlich größer war als der Mittelwert. Luria und Delbrück zeigten damit, dass Mutationen spontan sind. Sie zeigten, dass Mutationen spontan entstehen, wenn die DNA repliziert wird, und die Anzahl der Mutanten hängt davon ab, wann die Mutation während des Wachstums der Bevölkerung auftritt. Siehe Abbildung 1C, wo sechs Populationen, die jeweils mit einer mikrobiellen Zelle (in blau) initiiert wurden, keine, 1 oder 2 einzelne Mutationen aufweisen. Die Populationen A1, E1 und F1 erlebten eine einzige Mutation (erste rote Zelle), aber da eine einzelne Mutation spontan zu verschiedenen Zeitpunkten während eines Kulturzyklus auftaucht, endeten populationen mit einer sehr unterschiedlichen Anzahl beobachteter Mutanten (vier, zwei bzw. eins). Auf der anderen Seite endeten die Populationen C1 und G1 mit der gleichen Anzahl von beobachteten Mutanten wie E1 und A1, obwohl sie zwei Mutationsereignisse anstatt eines erlebten. Die Fluktuation der beobachteten Mutanten unter den Populationen gab dem Assay nicht nur den Namen, sondern zeigte auch, dass eine mutierte Frequenz (d. h. der Anteil der mutierten Zellen) ein unzureichender Indikator für die Mutationsrate ist.
Das übergeordnete Ziel des Fluktuationstestes besteht darin, die spontane Mutationsrate eines bestimmten Genotyps von Bakterien oder anderen einzelligen Organismen zu schätzen, die in einer bestimmten flüssigen Umgebung wachsen. Der Fluktuationstest bleibt das am besten geeignete Werkzeug, um die Umweltabhängigkeit von mikrobiellen Mutationsraten zu untersuchen und ermöglicht eine schnelle und kostengünstige Mutationsrate. Alternative Ansätze zur Mutationsrate-Schätzung, wie z. B. maximale Tiefensequenzierung6, Populationssequenzierung7, Mutationsakkumulationsexperimente8oder der Vergleich von Genomsequenzen eines Nachkommen mit denen der Eltern9 sind viel mühsamer und daher schlecht geeignet, um potenziell Umweltabhängigkeiten zu erkennen. Dynamische Aspekte der Entstehung und Reparatur einer Mutation sind jedoch für einen Fluktuationstest oder eine der oben aufgeführten Methoden zur Bewertung einer Mutationsrate weitgehend unzugänglich. Um zu untersuchen, wie sich die Anzahl der Mutationen in Zeit, Raum oder zwischen einzelnen Zellen innerhalb einer Population ändert, sind einzellige Ansätze11,12 notwendig, die nicht nur mühsamer als Fluktuationstests sind, sondern auch hochspezialisierte Fähigkeiten und Ausrüstung erfordern.
In der Praxis zählt ein Fluktuationstest Zellen, die aufgrund einer Mutation, die in einer Umgebung ohne Auswahl für diesen Marker auftritt, einen phänotypchen Marker erhalten. Die Metaanalyse von Hunderten von veröffentlichten Assays10 zeigt, dass seit der Gründung des Assays im Jahr 1943 mindestens 39 verschiedene phänotypische Marker verwendet wurden. Der Fluktuationstest kann verwendet werden, um Durchschnittswerte und Die umweltabhängige Abhängigkeit von Mutationsraten zwischen Labor-, klinischen, nichtmutator- und Mutatorstämmen zu vergleichen, die in freizügigen Umgebungen wachsen. Der Assay ermöglicht die Mutationsrate-Schätzung in Zellen mit unterschiedlichen genetischen Hintergründen, die entweder in minimalen oder reichen Umgebungen wachsen. Der Assay eignet sich nicht nur für Populationen, die als Monokultur wachsen, sondern kann auch zur Untersuchung der Auswirkungen von Zell-Zell-Wechselwirkungen auf Mutationsraten11verwendet werden. Wenn der Zinsstamm mit einem zweiten Stamm kokultiviert wird und ein neutraler Marker verwendet wird, um die Stämme zu unterscheiden, können Mutationsraten für zwei Stämme in einem Rohr gleichzeitig untersucht werden.
Fluktuationstests haben gezeigt, dass die spontane Mutationsrate sowohl vom Genotyp einer Zelle als auch von ihrer Umgebungabhängt 12 und eine Eigenschaft ist, die sich selbst entwickelt13. Wann immer sich die Mutationsrate eines bestimmten Genotyps mit der Umwelt ändert, wird sie als Mutations-Plastizität11beschrieben. Plastische Mutationsraten wurden am gründlichsten auf stressinduzierte Mutagenese (SIM)14untersucht. Darüber hinaus wurde kürzlich mit Fluktuationstests gezeigt, dass die Dichte, zu der eine Zellpopulation wächst (typischerweise eine Chargenkultur bei Tragfähigkeit), eng mit Mutationsraten über Bakterien und einzellige Eukaryoten verbunden ist. Die Mutationsrate pro Genom pro Generation nimmt bei dichten Populationen um bis zu 23-fach10,11ab. Diese dichteassoziierte Mutationsrate Plastizität (DAMP) kann von einem Quorum-Sensing-System15 abhängen und unabhängig von SIM16handeln.
Hier wird ein detailliertes Protokoll für den Fluktuationstest zur Untersuchung des Escherichia coli-Stamms K-12 vorgestellt, der in einer Glukose-Minimal-Media-Umgebung Resistenz gegen das Antibiotikum Rifampicin erlangt. Dieses Protokoll sollte jedoch als eine grundlegende Vorlage betrachtet werden, die verwendet werden kann, um eine Vielzahl von Mikroben zu untersuchen, indem einfach die Kulturbedingungen und phänotypischen Mutationsmarker geändert werden. Das Protokoll hat sich von seiner Gründungentwickelt 5,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29 durch seine Verwendung auf einer breiten Palette von Mikroben und sogar Krebszellen30 und wurde modifiziert, um zu erhöhen der Durchsatz, der für die ordnungsgemäße Prüfung von Umweltabhängigkeiten der mikrobiellen Mutationsraten10,11,16wesentlich war. Das hier beschriebene Protokoll deckt nicht alle methodischen und analytischen Fragen des Fluktuationstests ab, die bereits in der Literatur gut diskutiert wurden, insbesondere die Fitnesswirkungen resistenter Mutationen31, phänotypische Verzögerung32, Zelltod33und die Eignung verschiedener Algorithmen zur Schätzung der Mutationsraten26,34. Dies kann beispielsweise dann wichtig sein, wenn die Umweltabhängigkeit von Fitnesseffekten zu einer fehlerhaften Variation der Mutationsrate35führen kann. Wir stellen jedoch fest, dass die Analysewerkzeuge, die wir hier verwenden, mit der Variation in mutierter Fitness und Zelltod umgehen können. Wie in den Notizen und der Diskussion angesprochen, wird auch empfohlen, dass mehrere phänotypische Marker berücksichtigt werden, die wahrscheinlich nicht die gleichen umweltabhängigen Fitnesseffekte haben. Dieses Protokoll wird es den Menschen ermöglichen, routinemäßig Umweltabhängigkeiten von Mutationsraten in der Vielfalt mikrobieller Stämme und Umgebungen zu überprüfen. Assaying-Mutationen in verschiedenen Umgebungen wurden noch nicht gründlich getestet und sobald die Populationsdichte berücksichtigt wird, können Fluktuationstests eine genauere Schätzung der Mutationsrate10ergeben. Dieses Protokoll wird es ermöglichen, mehr Fluktuationstests durchzuführen, wie dies für das Verständnis der Mechanismen erforderlich ist, die den Mutationsraten zugrunde liegen, was wiederum für das Verständnis von Evolution, Karzinogenese, Alterung und antimikrobiellen Resistenz von entscheidender Bedeutung ist.

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			<td>1.5 ml Microcentrifuge tubes</td>
			<td>Starlab International GmbH</td>
			<td>S1615-5550</td>
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		</tr>
		<tr>
			<td>2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8877-10g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>REF 657102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>90mm Petri Dishes Triple Vented</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>REF 120189</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 deep-well plate (Masterblock 2 ml)</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>REF 780270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium sulfate</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A/6440/53</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Agar</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>REF 214010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto yeast extract</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>REF 212750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cycloserine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1158005-250MG</td>
			<td>Only for assaying an alternative phenotypic marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose anhydrous</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>G/0500/61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml Centrifuge Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>REF 430828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-(+)-Arabinose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3256-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>M/1050/53</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalidixic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N8878-5G</td>
			<td>Only for assaying an alternative phenotypic marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate dibasic trihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5504-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0662-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rifampicin</td>
			<td>EMD Millipore Corp, USA</td>
			<td>557303-1GM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S/3160/60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectophotometer</td>
			<td>Jenway</td>
			<td>6320D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiamine hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4625-25g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trisodium citrate dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S1804-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>1278-7099</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring microbial mutation rates with the fluctuation assay

Fluktuationstests werden häufig zur Schätzung von Mutationsraten in Mikroben verwendet, die in flüssigen Umgebungen wachsen. Viele Kulturen werden jeweils mit ein paar tausend Zellen geimpft, jede empfindlich gegenüber einem selektiven Marker, der phänotypisch untersucht werden kann. Diese Parallelkulturen wachsen für viele Generationen in Abwesenheit des phäotypischen Markers. Eine Teilmenge von Kulturen wird verwendet, um die Gesamtzahl der Zellen zu schätzen, die von Mutationen bedroht sind (d. h. die Populationsgröße am Ende des Wachstumszeitraums, oder Nt). Die restlichen Kulturen werden auf den selektiven Agar plattiert. Die Verteilung der beobachteten resistenten Mutanten auf Parallelkulturen wird dann verwendet, um die erwartete Anzahl von Mutationsereignissen, m,mit hilfe eines mathematischen Modells zu schätzen. Die Division m durch Nt gibt die Schätzung der Mutationsrate pro Ort pro Generation an. Der Test hat drei kritische Aspekte: den gewählten phänotischen Marker, das gewählte Volumen paralleler Kulturen und die Sicherstellung, dass die Oberfläche auf dem selektiven Agar vor der Inkubation vollständig trocken ist. Der Test ist relativ kostengünstig und benötigt nur Standard-Laborgeräte. Es ist auch weniger mühsam als alternative Ansätze, wie Mutation Akkumulation und Einzelzell-Assays. Der Assay arbeitet an Organismen, die viele Generationen schnell durchlaufen, und es hängt von Annahmen über die Fitness-Effekte von Markern und Zelltod ab. Jüngste Instrumente und theoretische Studien bedeuten jedoch, dass diese Fragen nun analytisch angegangen werden können. Der Test ermöglicht die Mutationsrate Schätzung verschiedener phänotypischer Marker in Zellen mit verschiedenen Genotypen, die isoliert oder in einer Gemeinschaft wachsen. Durch die parallele Durchführung mehrerer Assays können Assays verwendet werden, um zu untersuchen, wie sich der Umweltkontext eines Organismus auf die spontane Mutationsrate auswirkt, die für das Verständnis von antimikrobiellen Resistenzen, Karzinogenese, Alterung und Evolution von entscheidender Bedeutung ist.

Die Ergebnisse wurden mit dem gemeldeten Protokoll in vier verschiedenen Wochen von drei verschiedenen Einzelforschern gesammelt, wobei jede Woche eine 96 tiefe Bohrplatte verwendet wurde, um fünf Mutationsratenschätzungen zu generieren. Insgesamt erzeugten drei 96 Tiefbrunnenplatten 15 Mutationsratenschätzungen (ca. 95% Konfidenzintervall, CI) in E. coli K-12 MG1655 (Abbildung 2A, wie im Protokoll verwendet), während eine 96-Tiefe-Bohrplatte für fünf Schätzungen (ca. 95% CI) von E. coli K-12 BW25113 -Mutt-Mutant verwendet wurde ( Abbildung2B). In Abbildung 2 beträgt die mittlere Genauigkeit mit interquartilem Einschätzungenm 17,5 % (1,00 % bis 28,9 %, n = 20). Die Genauigkeit ist ein Koeffizient der Variation der erwarteten Anzahl von Mutationsereignissen (m) berechnet als m / m x 100% (wobei der Wert wie zuvor dargestellt38) berechnet wird. Rohdaten für Abbildung 2 finden Sie in der Zusatzdatendatei "Krasovec_etal_JoVE_data.csv". Die ergänzende Datendatei wird von einem R-Skript begleitet, um Abbildung 2zu generieren. Weitere Informationen zu Bakterienstämmen finden Sie in der ergänzenden Tabelle 2 und in der ergänzenden Tabelle 3, in der Spalten in der Datendatei erläutert werden. Datenpunkte, die mit Rifampicin und Nalidixsäure erworben wurden, wurden zuvor in Kraovec et al.10 veröffentlicht und weisen hier die gleichen IDs auf wie bei der erstveröffentlichung.
In Abbildung 2A werden die MG1655-Mutationsraten von drei verschiedenen phänotypischen Markern, Cycloserin, Rifampicin und Nalidixsäure dargestellt. Hier wurden die Mutationsraten in Davis minimal medium mit 80, 125 und 250 mg/L Glukose bewertet, wie im Protokoll erläutert. In einem Fall wurden 1.000 mg/L Glukose verwendet (Abbildung 1B). In der Praxis kann jede anfängliche Glukosekonzentration verwendet werden. Wie erwartet, waren die Mutationsraten für die Cycloserinresistenz höher, die niedrigste für die Nalidixsäureresistenz, und die Rate der Rifampicin-Resistenz war in der Mitte. Dies entspricht den bekannten Zielgrößen für diese drei Widerstände, wobei der größte für das Cycloserin und der kleinste für die Nalidixsäure gilt. Die Diskussion und Abbildung 3 geben Aufzählungszeichen darüber, wie die Zielgrößen, Volumen paralleler Kulturen und der Nährstoffgehalt in der Umwelt genutzt werden können, um die Messung der mikrobiellen Mutationsraten mit dem Fluktuationstest zu optimieren.
Der Fluktuationstest zeigt deutlich, welcher Stamm ein konstitutiver Mutator ist und welcher normale Mutationsraten hat. DerMutT-Stamm hatte eine etwa 50-fach höhere Mutationsrate zur Nalidixinsäureresistenz (Abbildung 2B) als MG1655 (Abbildung 2A). Um jedoch die Mutationsrate eines bestimmten Genotyps in verschiedenen Umgebungen zu bestimmen, wird empfohlen, mindestens fünf Replikationen pro Genotyp pro Umgebung mit nur einem phänotypischen Marker zu verwenden. Eine detaillierte Darstellung der statistischen Methoden, die zuvor zur Analyse dieser Art von Experimenten verwendet wurden, finden Sie in den ergänzenden Informationen in Kraovec et al.10.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60406/60406fig2a.jpg"> Abbildung 2: Repräsentative Zahl der Mutationsraten, die durch den Fluktuationstest bei Escherichia coli-Populationen geschätzt werden. (A) Die Mutationsrate, die durch das gemeldete Protokoll im Wildtyp MG1655 (Kreise) bestimmt wird. Die Abbildung zeigt die Mutationsraten in Gegenwart von Rifampicin (hellblaue Kreise), Nalidixsäure (rote Kreise) und Cycloserin (dunkelblaue Kreise) Widerstand. Für Nalidixsäure wurden größere Kulturvolumina von 10 ml verwendet (siehe Ergänzende Datendatei). Die Daten für Rifampicin und Nalidixsäure werden aus Abbildung 2a in Kraovec et al.10nachgezeichnet. (B) Die Mutationsrate zur Nalidixsäureresistenz im Keio 39-Mutt-Mutanten (rote Dreiecke). Beachten Sie die logarithmische Skala auf der Mutationsrate-Achse. Fehlerbalken = 95 % Konfidenzintervalle, die wie im Protokoll erläutert berechnet werden. Die Daten werden aus Abbildung 4a in Kraovec et al.10nachgezeichnet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60406/60406fig2alarge.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60406/60406fig3a.jpg"> Abbildung 3: Ein Flussdiagramm zur Fehlerbehebung beim Fluktuationstest. Das Flussdiagramm ist von oben zu verfolgen, die drei Fragen in den gelben Diamanten nacheinander zu beantworten, das Protokoll an den Inhalt der resultierenden grünen Kästchen anzupassen und das Protokoll wie in den roten Ovalen angegeben umzusetzen. Weitere Informationen zur Problembehandlung finden Sie in den ersten drei Absätzen der Diskussion. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60406/60406fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Ergänzende Tabelle 1: Formeln für die im Protokoll verwendeten Medien. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60406/supptable1.xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle anzuzeigen (Rechtsklick zum Herunterladen).</a>
Ergänzende Tabelle 2: Bakterienstämme. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60406/supptable2.xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle anzuzeigen (Rechtsklick zum Herunterladen).</a>
Ergänzende Tabelle 3: Detaillierte Beschreibung der Spalten in der Rohdatendatei Krasovec_etal_JoVE_data.csv. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60406/supptable3.xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle anzuzeigen (Rechtsklick zum Herunterladen).</a>
Ergänzende Datendateien. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60406/Supplemental_Data_Files.zip" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Dateien herunterzuladen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Microbial Mutation Rates with the Fluctuation Assay at JoVE.com

Measuring Microbial Mutation Rates with the Fluctuation Assay

Hier wird ein Protokoll vorgestellt, um einen Fluktuationstest durchzuführen und die mikrobielle Mutationsrate mit phänotypischen Markern zu schätzen. Dieses Protokoll wird es Forschern ermöglichen, Mutationen in verschiedenen Mikroben und Umgebungen zu assayen und zu bestimmen, wie sich Genotyp und ökologischer Kontext auf spontane Mutationsraten auswirken.

Messung der mikrobiellen Mutationsraten mit dem Fluktuationstest

Fluctuation assays are widely used for estimating mutation rates in microbes growing in liquid environments. Many cultures are each inoculated with a few ...

Das Protokoll ermöglicht die Mutationsabschätzung in Mikroben. Es kann zeigen, wie ein Organismen Umweltkontext die Wahrscheinlichkeit einer spontanen Mutation beeinflusst. Der Hauptvorteil dieses Protokolls ist, dass es billig und effizient ist.Viele Schätzungen der Mutationsrate können parallel vorgenommen werden. Mutationen, die dieses Protokoll misst, könnten der Resistenz gegen Antibiotika folgen. Dieses Protokoll kann also verwendet werden, um eine der weltweit größten Herausforderungen zu untersuchen, die Antibiotikaresistenz.Diese Methode kann einen Einblick in die Auswirkungen des ökologischen Kontexts von Zellen auf die Entwicklung der antibiotika-resistenz geben. Dieses Protokoll schätzt die Mutationsraten in der Monokultur von Laborstämmen, aber wir haben sie auf klinische Stämme und Kokultur von zwei Stämmen angewendet, um bioneutrale Moleküle zu unterscheiden. Die gefährlichsten Reaktionen in diesem Protokoll sind Antibiotikum Rifampicin und Methanol.So achten Sie darauf, Schutzhandschuhe und Schutzbrillen zu verwenden, wenn Rifampicin in Methanol gelöst wird. Um dieses Verfahren zu beginnen, impfen Sie drei ml flüssige Lysogenybrühe mit einem Eiskratzer aus dem E.coli K12 Glycerinbestand. Schütteln Sie die LB-Kultur bei 120 Umdrehungen pro Minute und bei 37 Grad Celsius für etwa sieben Stunden.Danach die Kultur 2000-fach mit der Saline-Lösung verdünnen. Fügen Sie 10 ml flüssiges Davis-Minimalmedium zu jeder Röhre hinzu, wobei jede eine andere Glukosekonzentration enthält, wie hier gezeigt. Fügen Sie 100 Mikroliter der verdünnten Kultur zu drei 50 ml Siebkappe konische Bodenpolymerrohre.Bereiten Sie 22 ml von fünf verschiedenen Lösungen von flüssigen Davis minimal Medium mit Glukose, jede in seinem eigenen 50 ml Rohr als Umriss im Textprotokoll. Um Eine Impfung für die Umgebungen vorzubereiten, messen Sie zunächst die optische Dichte der Nachtkulturen mit 600 Nanometern. Verdünnen Sie die Kulturen mit einer Salinelösung und fügen Sie jede Umgebung zwischen 2200 und 110000 Zellen hinzu.Dadurch wird sichergestellt, dass das Inokulum für einen ml der Umgebung zwischen 1000 und 5000 Zellen enthält. Als nächstes erstellen Sie ein zufälliges Layout von parallelen Kulturen für 196 tiefe Brunnenplatte. Übertragen Sie je nach Layout einen ml der geimpften Medien in jeden Brunnen der Platte.Dann befestigen Sie den Deckel der Platte mit Klebeband und wiegen Sie die gesamte Platte mit dem Deckel und Band. Schütteln Sie die Platte bei 250 Umdrehungen pro Minute und bei 37 Grad Celsius für 24 Stunden. Danach zwei L destilliertes Wasser in den Inkubator geben, um die Verdunstungsmenge unter den Versuchssätzen zu stabilisieren.Bestimmen Sie die Inokulumgröße, indem Sie 10 Mikroliter jedes der geimpften Medien auf einer nicht selektiven TA-Agarplatte verschichten. Verwenden Sie einen sterilen L-förmigen Streuer, bis die Agaroberfläche trocken ist. Dann bereiten Sie selektiven TA-Agar mit Rifampicin in sechs Brunnenplatten zu.Pipette fünf ml des selektiven TA-Agars in jeden Brunnen der sechs Brunnenplatten. Zählen Sie die Kolonie bildenden Einheiten auf den nicht-selektiven Agarplatten und bestimmen Sie die Größe der Inocula. Nach 24 Stunden Inkubation wiegen Sie die gesamte Tiefbrunnenplatte, um die Verdunstungsmenge zu bestimmen, die wahrscheinlich um 10% beträgt, übertragen Sie drei zufällig ausgewählte Kulturen pro Assay in markierte Mikrozentrifugenröhren.Die restlichen 81 Parallelkulturen aus der tiefen Brunnenplatte auf den selektiven TA-Agar mit Rifampicin geben. Als nächstes entfernen Sie die Deckel von den selektiven Agarplatten und lassen Sie sie unter sterilen Bedingungen frei, um die gesamte Flüssigkeit auf der Oberfläche des Agars auszutrocknen. Bestimmen Sie die Anzahl der koloniebildenden Einheiten, indem Sie die Kulturen aus den Mikrozentrifugenrohren mit fünf 10-fachen Verdünnungsschritten verdünnen, indem Sie 900 Mikroliter Kochchen Kochchen Lösung mit 100 Mikroliter der Kultur pro Verdünnungsschritt mischen und wirbeln.Platte 40 Mikroliter der endigen Verdünnung auf den nicht-selektiven TA-Agar und legen Sie den Deckel auf die Platten. Über Nacht bei 37 Grad Celsius inkubieren. Sobald alle Brunnen auf einer sechs Brunnenplatte frei von der Kulturflüssigkeit sind, legen Sie den Deckel wieder auf.Dann die Platten mit dem Deckel auf 37 Grad Celsius für 44-48 Stunden inkubieren. Zählen Sie am vierten Tag die Koloniebildenden Einheiten auf den nicht-selektiven Agarplatten. Zählen Sie am fünften Tag die Anzahl der Kolonien, die gegen das Antibiotikum resistent sind, auf den selektiven TA-Agarplatten.Erfassen Sie die Verteilung der beobachteten Anzahl von Mutanten für einen bestimmten Test zwischen parallelen Kulturen. Öffnen Sie die entsprechende Software auf dem Computer. Belassen Sie auf der Registerkarte Hypothesentests die Werte bei ihren Standardwerten.Klicken Sie auf Durchsuchen und markieren Sie die Textdatei mit der Verteilung der beobachteten Mutanten. Nachdem Sie die Datei hochgeladen haben, klicken Sie auf "Durchgeführter Test". Auf der rechten Seite, unter dem Ergebnis des Tests, unter dem One Sample ML-Test, finden Sie die Mutationszahl.Dies ist m, die erwartete Anzahl von Mutationsereignissen. Schätzen Sie dann die Mutationsrate eines bestimmten Genotyps in einer bestimmten Umgebung als Gliederung im Textprotokoll. Die MG1655-Mutationsraten von drei verschiedenen phänotypischen Markern, Cycloserin, Rifampicin und Nalidixsäure, sind hier dargestellt.Mutationsraten werden in Davis minimalen Medium mit Glukosekonzentration von 80 mg/L, 125 mg/L und 250 mg/L bewertet. In einem Fall wird eine Glukosekonzentration von 1000 mg/L verwendet. Wie erwartet, sind die Mutationsraten für die Cycloserinresistenz höher, die niedrigste für die Nalidixsäureresistenz, und die Rate der Rifampicin-Resistenz liegt in der Mitte.Der Fluktuationstest zeigt deutlich, welcher Stamm ein konstitutiver Mutator ist und welcher normale Mutationsraten hat. Da der mutT-Deletantstamm eine Mutationsrate bis zur Nalidixsäureresistenz hatte, die etwa 50-fach höher ist als der Kontrollstamm MG1655. Stellen Sie beim Vorformen dieses Protokolls sicher, dass Ihre Zellen gut wachsen.Sie sollten zu einer gleichmäßigen Dichte zwischen parallelen Kulturen mit der gleichen Umgebung anwachsen. Ein Follow-up zu diesem Verfahren ist die Bestimmung der DNA-Sequenz des rpoB-Gens in resistenten Kolonien. Um zu bestimmen, wie das Spektrum der Mutationen zu Rifampicin Resistenz variiert mit Umwelt mikrobiellen Genotyp.Fluktuationstests im 20. Jahrhundert zeigten, wie spontan und zufällig Mutationen in Bezug auf die Umwelt sind. Jetzt werfen sie ein neues Licht darauf, wie die Mutationsraten genetisch, ökologisch, sogar sozial mit der Umwelt variieren.

Research

JoVE Journal

Genetics

Monitoring Spatial Segregation in Surface Colonizing Microbial Populations

Überwachung räumliche Trennung in Oberflächen Colonizing mikrobiellen Populationen

Microbes provide an intriguing system to study social interaction among individuals within a population. The short generation times and relatively simple ...

Forschung

Genetik

Purification of High Molecular Weight Genomic DNA from Powdery Mildew for Long-Read Sequencing

Reinigung von High Molecular Weight genomischer DNA aus Echten Mehltaus für Long-Read-Sequenzierung

The powdery mildew fungi are a group of economically important fungal plant pathogens. Relatively little is known about the molecular biology and genetics ...

Measuring mRNA Levels Over Time During the Yeast S. cerevisiae Hypoxic Response

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Messung der mRNA-Niveaus im Laufe der Zeit während der Hefe S. Cerevisiae hypoxischen Antwort

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Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

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Generation von einem Gen gestört Streptococcus Mutans Belastung ohne Gene Klonen

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