Name: measuring microbial mutation rates with the fluctuation assay
Uploaded: 2019-11-28T13:00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Microbial Mutation Rates with the Fluctuation Assay at JoVE.com

РК была поддержана BB/M020975/1 и Манчестерским университетом школы биологических наук. HR был поддержан BB/J014478/1. GG была поддержана BBSRC Докторская Обучение Партнерство BB/M011208/1. DRG была поддержана UKRI награда номер MR/R024936/1.

<ol>
	<li>de Vries, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Die+mutationstheorie.">Die mutationstheorie.</a> Versuche und beobachtungen &#252;ber die entstehung von arten im pflanzenreich. 1, (1901).</li><li>Muller, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+transmutation+of+the+gene.">Artificial transmutation of the gene.</a> Science. 66 (1699), (1927).</li><li>Muller, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+measurement+of+gene+mutation+rate+in+Drosophila,+its+high+variability,+and+its+dependence+upon+temperature.">The measurement of gene mutation rate in Drosophila, its high variability, and its dependence upon temperature.</a> Genetics. 13 (4), 279-357 (1928).</li><li>Sturtevant, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essays+on+evolution.+I.+On+the+effects+of+selection+on+mutation+rate.">Essays on evolution. I. On the effects of selection on mutation rate.</a> The Quarterly Review of Biology. 12 (4), 464-467 (1937).</li><li>Luria, S. E., Delbr&#252;ck, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+of+bacteria+from+virus+sensitivity+to+virus+resistance.">Mutations of bacteria from virus sensitivity to virus resistance.</a> Genetics. 28 (6), 491-511 (1943).</li><li>Jee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rates+and+mechanisms+of+bacterial+mutagenesis+from+maximum-depth+sequencing.">Rates and mechanisms of bacterial mutagenesis from maximum-depth sequencing.</a> Nature. 534 (7609), 693-696 (2016).</li><li>Fusco, D., Gralka, M., Kayser, J., Anderson, A., Hallatschek, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excess+of+mutational+jackpot+events+in+expanding+populations+revealed+by+spatial+Luria-Delbr&#252;ck+experiments.">Excess of mutational jackpot events in expanding populations revealed by spatial Luria-Delbr&#252;ck experiments.</a> Nature Communications. 7, (2016).</li><li>Halligan, D. L., Keightley, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+mutation+accumulation+studies+in+evolutionary+genetics.">Spontaneous mutation accumulation studies in evolutionary genetics.</a> Annual Review of Ecology Evolution and Systematics. 40 (1), 151-172 (2009).</li><li>J&#243;nsson, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parental+influence+on+human+germline+de+novo+mutations+in+1,548+trios+from+Iceland.">Parental influence on human germline de novo mutations in 1,548 trios from Iceland.</a> Nature. 549, (2017).</li><li>Kra&#353;ovec, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+mutation+rate+is+a+plastic+trait+associated+with+population+density+across+domains+of+life.">Spontaneous mutation rate is a plastic trait associated with population density across domains of life.</a> PLoS Biology. 15 (8), (2017).</li><li>Kra&#353;ovec, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation+rate+plasticity+in+rifampicin+resistance+depends+on+Escherichia+coli+cell-cell+interactions.">Mutation rate plasticity in rifampicin resistance depends on Escherichia coli cell-cell interactions.</a> Nature Communications. 5, 3742 (2014).</li><li>Massey, R. C., Buckling, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+regulation+of+mutation+rates+at+specific+sites.">Environmental regulation of mutation rates at specific sites.</a> Trends in Microbiology. 10 (12), 580-584 (2002).</li><li>Lynch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+drift,+selection+and+the+evolution+of+the+mutation+rate.">Genetic drift, selection and the evolution of the mutation rate.</a> Nature Review Genetics. 17 (11), 704-714 (2016).</li><li>Foster, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress-induced+mutagenesis+in+bacteria.">Stress-induced mutagenesis in bacteria.</a> Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 42 (5), 373-397 (2007).</li><li>Kra&#353;ovec, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Where+antibiotic+resistance+mutations+meet+quorum-sensing.">Where antibiotic resistance mutations meet quorum-sensing.</a> Microbial Cell. 1 (7), 250-252 (2014).</li><li>Kra&#353;ovec, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opposing+effects+of+final+population+density+and+stress+on+Escherichia+coli+mutation+rate.">Opposing effects of final population density and stress on Escherichia coli mutation rate.</a> The ISME Journal-Multidisciplinary Journal of Microbial Ecology. 12, 2981-2987 (2018).</li><li>Lea, D., Coulson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+distribution+of+the+numbers+of+mutants+in+bacterial+populations.">The distribution of the numbers of mutants in bacterial populations.</a> Journal of Genetics. 49 (3), 264-285 (1949).</li><li>Armitage, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+statistical+theory+of+bacterial+populations+subject+to+mutation.">The statistical theory of bacterial populations subject to mutation.</a> Journal of the Royal Statistical Society. Series B (Methodological. 14 (1), 1-40 (1952).</li><li>Koch, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation+and+growth+rates+from+Luria-Delbr&#252;ck+fluctuation+tests).">Mutation and growth rates from Luria-Delbr&#252;ck fluctuation tests).</a> Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. 95 (2-3), 129-143 (1982).</li><li>Cairns, J., Overbaugh, J., Miller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin+of+mutants.">The origin of mutants.</a> Nature. 335 (6186), 142-145 (1988).</li><li>Stewart, F. M., Gordon, D. M., Levin, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluctuation+analysis:+the+probability+distribution+of+the+number+of+mutants+under+different+conditions.">Fluctuation analysis: the probability distribution of the number of mutants under different conditions.</a> Genetics. 124 (1), 175-185 (1990).</li><li>Drake, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+constant+rate+of+spontaneous+mutation+in+DNA-based+microbes.">A constant rate of spontaneous mutation in DNA-based microbes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 88 (16), 7160-7164 (1991).</li><li>Ma, W. T., Sandri, G. V., Sarkar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+Luria-Delbr&#252;ck+distribution+using+discrete+convolution+powers.">Analysis of the Luria-Delbr&#252;ck distribution using discrete convolution powers.</a> Journal of Applied Probability. 29 (2), 255-267 (1992).</li><li>Shapiro, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+mutation+-+Who's+really+in+the+garden.">Adaptive mutation - Who's really in the garden.</a> Science. 268 (5209), 373-374 (1995).</li><li>Matic, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+variable+mutation+rates+in+commensal+and+pathogenic+Escherichia+coli.">Highly variable mutation rates in commensal and pathogenic Escherichia coli.</a> Science. 277 (5333), 1833-1834 (1997).</li><li>Rosche, W. A., Foster, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+mutation+rates+in+bacterial+populations.">Determining mutation rates in bacterial populations.</a> Methods. 20 (1), 4-17 (2000).</li><li>Rosenberg, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolving+responsively:+Adaptive+mutation.">Evolving responsively: Adaptive mutation.</a> Nature Reviews Genetics. 2 (7), 504-515 (2001).</li><li>Lynch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+the+mutation+rate.">Evolution of the mutation rate.</a> Trends in Genetics. 26 (8), 345-352 (2010).</li><li>Zheng, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+practical+guide+to+the+Luria-Delbr&#252;ck+protocol.">A new practical guide to the Luria-Delbr&#252;ck protocol.</a> Mutation Research. 781, 7-13 (2015).</li><li>Boesen, J. J. B., Niericker, M. J., Dieteren, N., Simons, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+variable+is+a+spontaneous+mutation-rate+in+cultured-mammalian-cells.">How variable is a spontaneous mutation-rate in cultured-mammalian-cells.</a> Mutation Research. 307 (1), 121-129 (1994).</li><li>Melnyk, A. H., Wong, A., Kassen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fitness+costs+of+antibiotic+resistance+mutations.">The fitness costs of antibiotic resistance mutations.</a> Evolutionary Applications. 8 (3), 273-283 (2015).</li><li>Sun, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+polyploidy+causes+phenotypic+delay+and+influences+bacterial+evolvability.">Effective polyploidy causes phenotypic delay and influences bacterial evolvability.</a> PLoS Biology. 16 (2), (2018).</li><li>Frenoy, A., Bonhoeffer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Death+and+population+dynamics+affect+mutation+rate+estimates+and+evolvability+under+stress+in+bacteria.">Death and population dynamics affect mutation rate estimates and evolvability under stress in bacteria.</a> PLoS Biology. 16 (5), (2018).</li><li>Foster, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+determining+spontaneous+mutation+rates.">Methods for determining spontaneous mutation rates.</a> Methods in Enzymology. , 195-213 (2006).</li><li>Wrande, M., Roth, J. R., Hughes, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accumulation+of+mutants+in+&amp;#34;aging&amp;#34;+bacterial+colonies+is+due+to+growth+under+selection,+not+stress-induced+mutagenesis.">Accumulation of mutants in &amp;#34;aging&amp;#34; bacterial colonies is due to growth under selection, not stress-induced mutagenesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (33), 11863-11868 (2008).</li><li>Adrien, M., R&#233;my, D., St&#233;phane, D., Bernard, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=flan:+An+R+package+for+inference+on+mutation+models.">flan: An R package for inference on mutation models.</a> The R Journal. 9. 334, (2017).</li><li>Garibyan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+the+rpoB+gene+to+determine+the+specificity+of+base+substitution+mutations+on+the+Escherichia+coli+chromosome.">Use of the rpoB gene to determine the specificity of base substitution mutations on the Escherichia coli chromosome.</a> DNA Repair. 2 (5), 593-608 (2003).</li><li>Stewart, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluctuation+tests:+how+reliable+are+the+estimates+of+mutation+rates?.">Fluctuation tests: how reliable are the estimates of mutation rates?.</a> Genetics. 137 (4), 1139-1146 (1994).</li><li>Baba, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+Escherichia+coli+K-12+in-frame,+single-gene+knockout+mutants:+the+Keio+collection.">Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection.</a> Molecular Systems Biology. 2 (1), (2006).</li><li>Yamagishi, J. -. I., Yoshida, H., Yamayoshi, M., Nakamura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nalidixic+acid-resistant+mutations+of+the+gyrB+gene+of+Escherichia+coli.">Nalidixic acid-resistant mutations of the gyrB gene of Escherichia coli.</a> Molecular and General Genetics MGG. 204 (3), 367-373 (1986).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+novel+mutations+associated+with+cycloserine+resistance+in+Mycobacterium+tuberculosis.">Identification of novel mutations associated with cycloserine resistance in Mycobacterium tuberculosis.</a> Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 72 (12), 3272-3276 (2017).</li><li>Lang, G. I., Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimating+the+per-base-pair+mutation+rate+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Estimating the per-base-pair mutation rate in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 178 (1), 67-82 (2008).</li><li>Uphoff, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+activation+of+a+DNA+damage+response+causes+cell-to-cell+mutation+rate+variation.">Stochastic activation of a DNA damage response causes cell-to-cell mutation rate variation.</a> Science. 351 (6277), 1094-1097 (2016).</li><li>Robert, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation+dynamics+and+fitness+effects+followed+in+single+cells.">Mutation dynamics and fitness effects followed in single cells.</a> Science. 359 (6381), 1283-1286 (2018).</li><li>Kong, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rate+of+de+novo+mutations+and+the+importance+of+father/'s+age+to+disease+risk.">Rate of de novo mutations and the importance of father/'s age to disease risk.</a> Nature. 488 (7412), 471-475 (2012).</li><li>Narasimhan, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimating+the+human+mutation+rate+from+autozygous+segments+reveals+population+differences+in+human+mutational+processes.">Estimating the human mutation rate from autozygous segments reveals population differences in human mutational processes.</a> Nature Communications. 8 (1), 303 (2017).</li></ol>

Авторам нечего раскрывать.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 ml Microcentrifuge tubes</td>
			<td>Starlab International GmbH</td>
			<td>S1615-5550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8877-10g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>REF 657102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>90mm Petri Dishes Triple Vented</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>REF 120189</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 deep-well plate (Masterblock 2 ml)</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>REF 780270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium sulfate</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A/6440/53</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Agar</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>REF 214010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto yeast extract</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>REF 212750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cycloserine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1158005-250MG</td>
			<td>Only for assaying an alternative phenotypic marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose anhydrous</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>G/0500/61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml Centrifuge Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>REF 430828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-(+)-Arabinose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3256-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>M/1050/53</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalidixic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N8878-5G</td>
			<td>Only for assaying an alternative phenotypic marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate dibasic trihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5504-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0662-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rifampicin</td>
			<td>EMD Millipore Corp, USA</td>
			<td>557303-1GM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S/3160/60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectophotometer</td>
			<td>Jenway</td>
			<td>6320D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiamine hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4625-25g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trisodium citrate dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S1804-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>1278-7099</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring microbial mutation rates with the fluctuation assay

Анализы колебаний широко используются для оценки частоты мутаций в микробах, растущих в жидкой среде. Многие культуры прививаются несколькими тысячами клеток, каждая из которых чувствительна к селективному маркеру, который можно анализировать фенотипически. Эти параллельные культуры растут на протяжении многих поколений в отсутствие фенотипического маркера. Подмножество культур используется для оценки общего числа клеток, подверженных риску мутаций (т.е. размер популяции в конце периода роста, или Nt). Остальные культуры покрыты селективным агаром. Распределение наблюдаемых устойчивых мутантов между параллельными культурами затем используется для оценки ожидаемого количества мутационных событий, m,с помощью математической модели. Разделение м на Nt дает оценку скорости мутации на локус на поколение. Ассея имеет три важнейших аспекта: выбранный фенотипический маркер, выбранный объем параллельных культур и обеспечение полного высыхания поверхности на селективном агаре перед инкубации. Анализ относительно недорог и нуждается только в стандартном лабораторном оборудовании. Он также менее трудоемкий, чем альтернативные подходы, такие как накопление мутаций и одноклеточные анализы. Ассес работает на организмы, которые проходят через многие поколения быстро, и это зависит от предположений о фитнес-эффекты маркеров и клеточной смерти. Однако недавно разработанные инструменты и теоретические исследования означают, что эти вопросы теперь можно решать аналитически. Анализ позволяет оценить скорость мутации различных фенотипических маркеров в клетках с различными генотипами, растущими в изоляции или в сообществе. Проводя несколько анализов параллельно, анализы могут быть использованы для изучения того, как экологический контекст организма влияет на скорость спонтанной мутации, которая имеет решающее значение для понимания устойчивости к противомикробным препаратам, канцерогенеза, старения и эволюции.

Результаты были собраны с зарегистрированным протоколом в 4 по-разному неделях 3 по-разному индивидуальными исследователями, где каждая неделя плита 96 глубоких скважин была использована для того чтобы произвести 5 оценок тарифа перегласовки. В общей сложности три 96 глубоких скважинных пластин генерировали 15 оценок скорости мутаций (95% доверительный интервал, CI)в E. coli K-12 MG1655(Рисунок 2A, как используется в протоколе), в то время как одна пластина глубокой скважины 96 была использована для пяти оценок (95% CI) E. coli K-12 BW25113 На рисунке 2 средняя точность с межкварттилным диапазоном оценки m составляет 17,5% (1,00% и 28,9%, n и 20). Точность является коэффициентом изменения ожидаемого количества мутационных событий(м),рассчитанного как м/м х 100% (где расчет, как показано ранее38). Необработанные данные по рисунку 2 доступны в дополнительном файле данных "Krasovec_etal_JoVE_data.csv". Дополнительный файл данных сопровождается R-скриптом для генерации рисунка 2. Смотрите также Дополнительную таблицу 2 для получения более подробной информации о бактериальных штаммов, и дополнительная таблица 3, где столбцы в файле данных объясняются. Точки данных, полученные с рифампицином и налидиксовой кислотой, были ранее опубликованы в Kra'ovec et al.10 и имеют те же идентификаторы здесь, что и при первой публикации.
На рисунке 2А представлены частоты мутаций MG1655 трех различных фенотипических маркеров, циклозерина, рифампицина и налидиксовой кислоты. Здесь, скорость мутации были оценены в Дэвисе минимальной среде с 80, 125, и 250 мг/л глюкозы, как поясняется в протоколе. В одном случае было использовано 1000 мг/л глюкозы(рисунок 1В). На практике можно использовать любую начальную концентрацию глюкозы. Как и ожидалось, частота мутаций была выше для резистентности циклобрина, самая низкая для сопротивления налидиксовой кислоты, и скорость устойчивости рифампицина была в середине. Это в соответствии с известными размерами цели для этих трех сопротивлений, где самый большой для циклорезина и самый маленький для налидиксовой кислоты. В ходе обсуждения и диаграммы 3 подробно рассказывается о том, как использовать целевые размеры, объемы параллельных культур и уровень питательных веществ в окружающей среде для оптимизации измерения частоты мутаций микробов с помощью анализов колебаний.
Анализ колебаний ясно показывает, какой штамм является составным мутатором и который имеет нормальные показатели мутации. ШтаммmutT имел приблизительно 50x более высокую скорость мутации к устойчивости nalidixic кислоты(Рисунок 2B) как MG1655 (Рисунок 2A). Однако для определения скорости мутации конкретного генотипа в различных средах рекомендуется делать по крайней мере пять репликатов на генотип в среду, используя только один фенотипический маркер. Для подробного изложения статистических методов, ранее используемых для анализа этого типа эксперимента,см.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60406/60406fig2a.jpg"> Рисунок 2: Репрезентативная цифра частоты мутаций, оцениваемая по колебаниям в популяциях кишечной палочки. (A) Скорость мутации, определяемая зарегистрированным протоколом в диком типе MG1655 (круги). На рисунке показаны показатели мутаций в присутствии рифампицина (светло-голубые круги), налидиксовой кислоты (красные круги) и килокерина (темно-синие круги) сопротивления. Для налидиксовой кислоты использовались большие объемы культуры в 10 мл (см. Дополнительный файл данных). Данные по рифампицину и налидиксовой кислоте перерисовываются с рисунка 2a в Крашовце и др.10. (B) Скорость мутации к сопротивлению nalidixic кислоты в мутанте Keio39 йmutT (красные треугольники). Обратите внимание на логарифмическую шкалу на оси скорости мутации. Ошибки баров - 95% доверительных интервалов, рассчитанных по мере объяснения в протоколе. Данные перекрываются с рисунка 4а в Крашовце и др.10. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60406/60406fig2alarge.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60406/60406fig3a.jpg"> Рисунок 3: Диаграмма для устранения неполадок в ходе асссы о колебаниях. Диаграмма потока должна следовать сверху, решая три вопроса в желтых алмазах в свою очередь, корректировка протокола в соответствии с содержанием результирующих зеленых ящиков, и реализация протокола, как указано в красных овалах. Более подробную информацию о том, как устранить неполадки, можно найти в первых трех абзацах обсуждения. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60406/60406fig3large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
Дополнительная таблица 1: Формулы для носителей, используемых в протоколе. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60406/supptable1.xlsx" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть эту таблицу (Право нажмите, чтобы скачать).</a>
Дополнительная таблица 2: Бактериальные штаммы. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60406/supptable2.xlsx" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть эту таблицу (Право нажмите, чтобы скачать).</a>
Дополнительная таблица 3: Подробное описание столбцов в файле необработанных данных Krasovec_etal_JoVE_data.csv. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60406/supptable3.xlsx" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть эту таблицу (Право нажмите, чтобы скачать).</a>
Дополнительные файлы данных. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60406/Supplemental_Data_Files.zip" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эти файлы.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Microbial Mutation Rates with the Fluctuation Assay at JoVE.com

Measuring Microbial Mutation Rates with the Fluctuation Assay

Здесь представлен протокол для проведения флуктуации и оценки частоты мутаций микробов с использованием фенотипических маркеров. Этот протокол позволит исследователям анализировать мутации в различных микробах и средах, определяя, как генотип и экологический контекст влияют на скорость спонтанных мутаций.

Измерение микробных мутационных показателей с помощью анализа колебаний

Fluctuation assays are widely used for estimating mutation rates in microbes growing in liquid environments. Many cultures are each inoculated with a few ...

Протокол позволяет проводить мутационные оценки микробов. Он может продемонстрировать, как организмы окружающей среды контексте эффекты вероятность спонтанной мутации. Основным преимуществом этого протокола является то, что он дешевый и эффективный.Параллельно можно сделать множество оценок скорости мутаций. Мутации, которые измеряет этот протокол, могут последовать за устойчивостью к антибиотикам. Таким образом, этот протокол может быть использован для изучения одной из самых больших проблем в мире, устойчивости к противомикробным препаратам.Этот метод может дать представление о том, как экологический контекст клеток может понять эволюцию устойчивости к противомикробным препаратам. Этот протокол оценивает мутационные показатели в монокультуре лабораторного штамма, но мы применили его к клиническим штаммам и совместной культуре двух штаммов, чтобы различать бионейтралевую молекулу. Наиболее опасными реакциями, используемыми в этом протоколе, являются антибиотик рифампицин и метанол.Поэтому не забудьте использовать защитные перчатки и очки, когда рифампицин растворяется в метаноле. Для начала этой процедуры прививают три мл жидкого лизогенного бульона со царапиной льда из запасов глицерола E.coli K12. Встряхните культуру LB при 120 об/мин и при 37 градусах по Цельсию в течение примерно семи часов.После этого разбавьте культуру в 2000 раз солевым раствором. Добавить 10 мл жидкости Дэвис минимальной среде каждой трубки с каждой из которых содержит различные концентрации глюкозы, как показано здесь. Добавьте 100 микролитров разбавленной культуры в три 50 мл крышки экрана конические нижние полимерные трубки.Подготовка 22 мл из пяти различных решений жидкости Дэвис минимальной среды с глюкозой, каждый в своей собственной 50 мл трубки, как наброски в текстовом протоколе. Чтобы подготовить инокулу для окружающей среды, сначала измерьте оптическую плотность ночных культур на уровне 600 нанометров. Разбавьте культуры солевым раствором и добавьте от 2200 до 110000 клеток в каждую среду.Это гарантирует, что инокулум для одного мл окружающей среды содержит от 1000 до 5000 клеток. Далее, создать случайный макет параллельных культур для 196 глубокой пластины хорошо. Передача одного МЛ привитых средств массовой информации в каждом колодец пластины в соответствии с макетом.Затем зафиксните крышку пластины лентой и взвесьте всю тарелку крышкой и лентой. Встряхните тарелку при 250 об/мин и при 37 градусах по Цельсию в течение 24 часов. После этого поместите два Л дистиллированной воды в инкубатор, чтобы стабилизировать количество испарения среди экспериментальных наборов.Определите размер инокулума, потрогая 10 микролитров каждого из привитых средств массовой информации на неселективной пластине TA agar. Используйте стерильный L-образный распространитель до тех пор, пока поверхность агара не высохнет. Затем приготовьте селективный ТА-агар, содержащий рифампицин в шести пластинах.Pipette 5 mL селективного agar TA в каждый наилучшим образом 6 плит наилучшим образом. Подсчитайте единицы формирования колонии на не селективных агарных пластинах и определите размер инокулы. После 24 часов инкубации, весят всю глубокую пластину хорошо, чтобы определить количество испарения, которое, вероятно, около 10%Передача трех случайно выбранных культур на анализ в помеченных микроцентрифуг труб.Плита оставшихся 81 параллельных культур из глубокой пластины хорошо на селективный та-агар, содержащий рифампицин. Затем снимите крышки с селективных агарных пластин и оставьте их в стерильных условиях, чтобы высушить всю жидкость на поверхности агара. Определите количество единиц формирования колонии путем разбавления культур из микроцентрифугных труб с помощью пяти 10-кратных шагов разбавления путем смешивания и вихря 900 микролитров солевого раствора с 100 микролитров культуры на шаг разбавления.Плита 40 микролитров окончательного разбавления на не селективном ТА-агаре и поместите крышку на пластины. Инкубировать ночь при 37 градусах по Цельсию. После того, как все колодцы на шести колодцах не будут иметь культурную жидкость, поместите крышку обратно.Затем инкубировать пластины с крышкой на 37 градусов по Цельсию в течение 44-48 часов. На четвертый день подсчитывайте колонию, образуя единицы на не селективных агарных плитах. На пятый день подсчитайте количество колоний, устойчивых к антибиотикам на селективных тагарных пластинах.Запись распределения между параллельными культурами наблюдаемого числа мутантов для конкретного анализа. Откройте соответствующее программное обеспечение на компьютере. Во вкладке тестирования гипотезы оставьте значения по умолчанию.Нажмите просмотр и выберите текстовый файл с распределением наблюдаемых мутантов. После загрузки файла нажмите на выполненный тест. С правой стороны, по результатам теста, под одним образцом ML-теста, найти номер мутации.Это м, ожидаемое количество мутационных событий. Затем оцените скорость мутации конкретного генотипа в конкретной среде как наброски в текстовом протоколе. Здесь показаны мутации MG1655 трех различных фенотипических маркеров, циклосерина, рифампицина и налидиксической кислоты.Показатели мутаций оцениваются в минимальной среде Дэвиса с концентрацией глюкозы 80 мг/л, 125 мг/л и 250 мг/л. В одном случае используется концентрация глюкозы 1000 мг/л. Как и ожидалось, показатели мутаций выше для циклозеринной резистентности, самые низкие для устойчивости налидиксиновой кислоты, и скорость резистентности к рифампицину находится в середине.Анализ колебаний ясно показывает, какой штамм является составным мутатором, а какой имеет нормальные показатели мутаций. Поскольку штамм mutT deletant имел скорость мутации к сопротивлению налидиксической кислоте, что примерно в 50 раз выше контрольного штамма MG1655. При предварительной форме этого протокола, убедитесь, что ваши клетки растут хорошо.Они должны расти до равномерной плотности между параллельными культурами с той же окружающей средой. Одним из последующих действий к этой процедуре является определение последовательности ДНК гена rpoB в устойчивых колониях. Определить, как спектр мутаций к резистентности к рифампицину изменяется в зависимости от экологического микробного генотипа.Колебания в 20-м веке показали, как мутация спонтанна и случайна с уважением к окружающей среде. Теперь они проливают новый свет на то, как скорость мутаций меняется в зависимости от окружающей среды генетически, экологически, даже социально.

Research

JoVE Journal

Genetics

Monitoring Spatial Segregation in Surface Colonizing Microbial Populations

Мониторинг пространственной сегрегации в поверхностных колонизировать микробных популяций

Microbes provide an intriguing system to study social interaction among individuals within a population. The short generation times and relatively simple ...

Purification of High Molecular Weight Genomic DNA from Powdery Mildew for Long-Read Sequencing

Очистка ДНК с высоким молекулярным весом геномной от мучнистой росы для Long-Read Sequencing

The powdery mildew fungi are a group of economically important fungal plant pathogens. Relatively little is known about the molecular biology and genetics ...

Measuring mRNA Levels Over Time During the Yeast S. cerevisiae Hypoxic Response

Measuring mRNA Levels Over Time During the Yeast S. cerevisiae Hypoxic Response

Измерение уровня мРНК со временем во время дрожжей S. cerevisiae гипоксических ответа

Complex changes in gene expression typically mediate a large portion of a cellular response. Each gene may change expression with unique kinetics as the ...

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

Поколение ген нарушена Streptococcus mutans штамм без генов клонирования

Typical methods for the elucidation of the function of a particular gene involve comparative phenotypic analyses of the wild-type strain and a strain in ...

Determining Genome-wide Transcript Decay Rates in Proliferating and Quiescent Human Fibroblasts

Определение генома всей стенограммы распада ставок в пролиферирующих и покоя фибробластов

Quiescence is a temporary, reversible state in which cells have ceased cell division, but retain the capacity to proliferate. Multiple studies, including ...

Measuring Gene Expression in Bombarded Barley Aleurone Layers with Increased Throughput

Измеряя экспрессии генов в бомбардировке ячменя Aleurone слои с повышенной пропускной способностью

The aleurone layer of barley grains is an important model system for hormone-regulated gene expression in plants. In aleurone cells, genes required for ...

Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere

Изучения корня микрофлора: извлечение данных бактериальных сообщества из почвы, ризосфере и корень Endosphere

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to ...

Measuring Exercise Levels in Drosophila melanogaster Using the Rotating Exercise Quantification System (REQS)

Measuring Exercise Levels in Drosophila melanogaster Using the Rotating Exercise Quantification System REQS

Измерение уровня осуществления в Drosophila melanogaster , с использованием системы количественной оценки вращающихся упражнения (REQS)

Drosophila melanogaster is a new model organism for studies in exercise biology. To date, two main exercise systems, the Power Tower and the Treadwheel ...

Determining 3'-Termini and Sequences of Nascent Single-Stranded Viral DNA Molecules during HIV-1 Reverse Transcription in Infected Cells

Определение последовательности зарождающейся вирусной ДНК одноцепочечной молекул во время ВИЧ-1 и 3'-Термини обратный транскрипции в инфицированных клетках

Monitoring of nucleic acid intermediates during virus replication provides insights into the effects and mechanisms of action of antiviral compounds and ...

ATAC-seq Assay with Low Mitochondrial DNA Contamination from Primary Human CD4+ T Lymphocytes

ATAC-seq Assay с низкой митохондриальной ДНК загрязнения от первичного человека CD4 + Т-лимфоцитов

ATAC-seq has become a widely used methodology in the study of epigenetics due to its rapid and simple approach to mapping genome-wide accessible ...