Name: measuring microbial mutation rates with the fluctuation assay
Uploaded: 2019-11-28T13:00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Microbial Mutation Rates with the Fluctuation Assay at JoVE.com

RK stöddes av BB/M020975/1 och universitetar av Manchester skolar av biologiska vetenskaper. HR stöddes av BB/J014478/1. GG stöddes av BBSRC doktorandutbildning partnerskap BB/M011208/1. DRG stöddes av UKRI Award Number MR/R024936/1.

1. dag 1: inympning och acklimatisering av kulturer
<ol><li>Inokulera 3 mL flytande lysogeni buljong (LB, se kompletterande tabell 1) med en skrapa av is från E. coli MG1655 glycerolbeståndet (18% glycerol,-80 ° c). Skaka LB kulturen vid 120 RPM för ~ 7 h vid 37 ° c. Anmärkning: I detta experiment, E. coli K12 MG1655 växer i lb används, men denna analys kan utföras med någon E. coli stam eller någon annan odlingsbara mikrobiella arter. Inkubations temperatur, inkubationstider och tillväxt mediernas näringsinnehåll kan alla variera beroende på art eller stam.</li>
	<li>Späd kulturen 2 000-faldigt med saltlösning. Tillsätt 100 μL av den utspädda lösningen till 3 50 mL skruvkork konisk botten polymer rör (50 mL rör) med 10 mL flytande Davis minimalt medium (DM, se kompletterande tabell 1), respektive innehållande 80 mg/l, 125 mg/l, eller 250 mg/l glukos. Detta är samma medium (dvs. miljö) där Mutations hastigheten kommer att uppskattas. Skaka kulturerna vid 120 rpm över natten vid 37 ° c. Anmärkning: Valet av media kan variera beroende på art, stam eller forskningsfråga.</li>
</ol>2. dag 2: generering av mutanter i parallella kulturer
<ol><li>Först, förbereda de miljöer där bakterierna kommer att odlas. Förbered alltid 10% mer än nödvändigt (dvs., tjugo 1 ml kulturer kräver 22 mL). Förbered 22 mL av 1) DM med 80 mg/L glukos, 2) DM med 125 mg/L glukos, 3) DM med 250 mg/L glukos, 4) DM med 80 mg/L glukos, och 5) DM med 250 mg/L glukos i 5 50 mL rör. Märk dem som GLC-80A, GLC-125, GLC-250A, GLC-80B och GLC-250B respektive.</li>
	<li>Förbered inokulat för miljöerna. Se till att inokulum för 1 ml av miljön innehåller 1000 − 5000 celler. Gör detta genom att följa stegen nedan.
	<ol>
<li>Mät den optiska densiteten (OD) för över natten kulturer (från steg 1,2) vid 600 Nm.</li>
		<li>Späd varje natt kultur för att nå en slutlig densitet på 1000-5000 celler per mL DM med glukos. I våra händer, om OD mätt i 2.2.1 är 0,3, detta innebär att göra en 100-faldig utspädning (i saltlösning) av natten kultur, sedan lägga till 11 μl av denna lösning till 22 mL miljön.</li>
	</ol></li>
	<li>Förbered parallella kulturer. Obs: detta protokoll är skrivet för 1 96 djup brunn plattan, utför fem fluktuation analyser (det högsta rimliga antalet på 1 96 väl tallrik), med hjälp av tre miljöer. Med erfarenhet kan flera djupa plåtar köras parallellt.<ol>
<li>Skapa en slumpmässig layout av parallella kulturer för 1 96 djup brunn plattan. Den kompletterande r script LayoutGenerator. r (se layouten i figur 1B) kan användas för detta. Placera varje parallell kultur på 96 djupa brunn plattan enligt layouten. Anmärkning: Köra LayoutGenerator. R kommer att se till att den första analysen har 20 parallella kulturer, och att den andra, tredje, fjärde och femte analyser har 19 parallella kulturer vardera.</li>
		<li>Överför 1 mL inokulerat material till varje brunn på en 96 djup brunn platta enligt den randomiserade layouten.</li>
		<li>Fäst locket på den djupa brunnen plattan med tejpen. Fixa inte locket tätt, eftersom kulturen tillväxten är känslig för mängden luftning.</li>
		<li>Väg hela plattan med locket och tejpen och skaka plattan vid 250 RPM för 24 h vid 37 ° c. Placera 2 L destillerat vatten i inkubatorn för att stabilisera mängden avdunstning bland experimentella apparater.</li>
	</ol></li>
	<li>Bestäm inokulum-storleken genom att plätera 10 μl av varje inokulerat medium på den icke-selektiva tetrazolium (ta)-agarplattan (se kompletterande tabell 1). Använd en steril L-formad spridare tills agarytan är torr. Inkubera TA agar plattor locket ner över natten vid 37 ° c. Anmärkning: TA agar är en rik agar som innehåller socker L-arabinose och vattenlösliga färgämne 2, 3, 5-trifenyltetrazoliumklorid, som är färglös i sin oxiderade form. När bakterier minskar färgämnet, blir det rött på grund av bildandet av formazan. Kolonier på TA-agar som inte kan använda L-arabinose är mörkröda. Andra stammar, såsom MG1655, är rosa. Användning av TA-agar i stället för standard LB-agar rekommenderas eftersom färgade bakterie kolonier är lättare att upptäcka, vilket gör att kolonin räknar mer tillförlitlig och snabbare.</li>
	<li>Förbered selektiv TA-agar som innehåller rifampicin i 6 bra plattor. Pipettera 5 mL av den selektiva TA-agar i varje brunn på de 6 brunn plattorna. Bered antibiotikumet rifampicin precis innan det tillsätts till TA-agar. Obs: när Cykloserin används som markör, Använd Davis minimalt medium med 250 mg/L glukos kompletterat med agar och L-arabinose och 2, 3, 5-trifenyltetrazoliumklorid som en selektiv agar. Nämligen, ta agar väljer inte bara celler som är resistenta mot Cykloserin, eftersom trypton och jästextrakt (båda de viktigaste komponenterna i ta-agar) innehåller aminosyran D-alanin. Denna aminosyra gäckar den antimikrobiella effekten av Cykloserin och tillåter alla celler att göra en koloni.<ol>
<li>Lämna de selektiva och resterande icke-selektiva plattorna i mörker (t. ex. i en låda) vid rumstemperatur.</li>
	</ol></li>
</ol>3. dag 3: Pläteringskulturer på selektiva och icke-selektiva agarplattor
<ol><li>Räkna Colony Forming enheter (CFU) på icke-selektiva agar plattorna och bestämma storleken på inokulat genom att multiplicera CFU med 100. Detta är ett förhållande mellan en volym av den parallella kulturen (1 mL = 1 000 μL) och den pläterade volymen (10 μL). Anmärkning: Om icke-selektiva plattor förvaras kylda kan CFU räknas senare.</li>
	<li>Efter 24 h inkubering, väga hela djup brunnen plattan för att bestämma mängden avdunstning. Detta kommer sannolikt att vara cirka 10%.</li>
	<li>Beräkna den genomsnittliga volymen av en parallell kultur efter 24 h inkubering (V[24h]) i mikroliter med en startvolym V[0h] = 1 000 μl och plattans vikt omvandlas till mikroliter, där tätheten av odlingssubstrat mäts i mg/μl. I denna studie används en densitet på 1 mg/μl: <img src="/files/ftp_upload/60406/60406eq1.jpg">
</li>
	<li>Överför de tre slumpmässigt valda kulturerna per analys (totalt 15, markerade med en svart cirkel i layouten i figur 1B) till märkta microcentrifugrör. Lämna dem på bänken för att användas senare (se steg 3,6) för bestämning av den slutliga befolkningsstorleken (eller Nt).</li>
	<li>
Platta de återstående 81 parallella kulturer från den djupa brunnen plattan på selektiv TA agar som innehåller rifampicin. Pipettera en hel parallell kultur från 96 djupt brunn pläterar in i en brunn av en 6-brunn pläterar. Se till att alla 6 brunn plattan innehåller parallella kulturer från mer än en fluktuation assay.
	<ol>
<li>Ta bort locken från de selektiva agarplattorna, och lämna avtäckt i sterila förhållanden. Torka ut all vätska på ytan av den selektiva TA-agar. Anmärkning: Agar som är helt torra är kritisk. Men övertorka inte den selektiva TA-agar, eftersom det inte får vara tillåtet att knäcka.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Medan de selektiva TA agar plattorna torkar, vilket kan ta upp till flera timmar, bestämma Nt av de 15 kulturer som utarbetats i steg 3,4 med hjälp av kolonin bildar enheter (CFU).
	<ol>
<li>Bestäm CFU genom att späda ut kulturerna från microcentrifugerören. Använd 5 10-faldig utspädning steg, blandning och vortexa 900 μl saltlösning med 100 μl av kulturen på varje steg. Platta 40 μL av den sista spädningen (med en utspädningsfaktor på 105) på de icke-selektiva ta-agar och inkubera plåtarna locket ner över natten vid 37 ° c. Anmärkning: Utspädnings serien i 96 väl plattor kan utföras med en multikanalpipett, vilket kan öka hastigheten på detta steg.</li>
	</ol>
</li>
	<li>När alla brunnar på en 6 väl plattan är fria från kulturen vätskan, sätta locket igen och placera 6 väl plattan med locket ner på bänken tills alla 6 väl plattorna är torra. När alla är torra, inkubera plåtarna locket ner vid 37 ° c för 44-48 h. Anmärkning: För andra markörer (nalidixic syra, Cykloserin, hygromycin B, eller 5-FOA) Inkubera plattorna för 68-72 timmar. Se till att luftfuktigheten i inkubatorn är hög. Det är viktigt att de selektiva agarplattorna inte torkar ut under inkubationstiden.</li>
</ol>4. dag 4: bestämning av antalet celler i kulturerna
<ol><li>Räkna CFU på de icke-selektiva agar plattorna. Uppskatta antalet livskraftiga celler i kulturen genom att multiplicera CFU med utspädningsfaktorn (105) och förhållandet mellan den beräknade genomsnittliga volymen V[24h] i mikroliter (se steg 3,3) och pläterad volym (40 μl): <img src="/files/ftp_upload/60406/60406eq2.jpg">
</li>
	<li>
Nt av en viss genotyp som växer i en viss miljö är medelvärdet av dessa värden från de tre kulturerna.</li>
</ol>5. dag 5: uppskattning av Mutationshastigheten
<ol><li>
Räkna antalet kolonier som är resistenta mot antibiotika på de selektiva TA-agarplattorna (dvs. antalet resistenta celler som uppstod genom spontan mutation i den djupa plattan på dag 2 − 3). Registrera fördelningen mellan parallella kulturer av det observerade antalet mutanter för en viss analys (t. ex. 16 eller 17 värden, inklusive nollräkningar). Obs: om selektiva plåtar förvaras kylda, kan kolonier som är resistenta mot antibiotika räknas senare.<ol>
<li>Använd varje distribution för att uppskatta antalet mutationella händelser, m, med hjälp av R-paketet flan36. Anmärkning: Det finns också R-paketet rSalvador med liknande funktionalitet29.</li>
		<li>Spara fördelningen av de observerade mutanter för en analys i en textfil som en enda kolumn.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Använd Shinyflan programvara (http://shinyflan.its.manchester.ac.uk/) för att uppskatta m som beskrivs nedan.
	<ol>
<li>I fliken hypotestestning lämna värden som standard (dvs. okänd Fitness Ticked, uppskattning metod = maximal sannolikhet (ml), distribution av Mutant livstid = exponentiell (LD Model), Winsor parameter = 1 024, Mutation antal och Fitness = 1, konfidensnivå = 0,95, antal klass och maximalt värde = 100).</li>
		<li>Klicka på Bläddra och välj textfilen med fördelningen av observerade mutanter. Försök först med den kompletterande data filen.</li>
		<li>Efter uppladdning av filen, klicka på utför test. På höger sida under testresultatet, under ett prov ml-test (LD-modell), hitta Mutations numret. Detta är m, det förväntade antalet mutationella händelser.</li>
		<li>Under 95 procent konfidensintervall för Mutations nummer hitta den övre och undre gränsen för m.</li>
	</ol>
</li>
	<li>När m och Nt (bestäms av CFU) finns tillgängliga, uppskatta Mutations hastigheten för en viss genotyp i en viss miljö som <img src="/files/ftp_upload/60406/60406eq3.jpg"> </img>. Dividera de övre och nedre gränserna på m med Nt på samma sätt för att generera konfidensintervall på mutationshastigheten (NB detta tar inte hänsyn till osäkerheten i Nt). Anmärkning: Resultaten presenteras som mutationshastigheten per Rpob -Locus per generation. Mutationshastighet per bas par genereras genom att dividera Mutations hastigheten per Rpob Locus med 79, vilket är vår nuvarande kunskap om hur många punktmutationer inom en rpob -gen ger resistens mot rifampicin37. Multiplicera mutationshastigheten per nukleotid med storleken på kromosomen (E. coli K-12 MG1655 = 4 639 675 BP), ger mutationshastigheten per genomet.</li>
	<li>Upprepa steg 5.1 − 5.3 med de återstående fyra fluktuationsanalyserna.</li>
</ol>

<ol>
	<li>de Vries, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Die+mutationstheorie.">Die mutationstheorie.</a> Versuche und beobachtungen &#252;ber die entstehung von arten im pflanzenreich. 1, (1901).</li><li>Muller, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+transmutation+of+the+gene.">Artificial transmutation of the gene.</a> Science. 66 (1699), (1927).</li><li>Muller, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+measurement+of+gene+mutation+rate+in+Drosophila,+its+high+variability,+and+its+dependence+upon+temperature.">The measurement of gene mutation rate in Drosophila, its high variability, and its dependence upon temperature.</a> Genetics. 13 (4), 279-357 (1928).</li><li>Sturtevant, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essays+on+evolution.+I.+On+the+effects+of+selection+on+mutation+rate.">Essays on evolution. I. On the effects of selection on mutation rate.</a> The Quarterly Review of Biology. 12 (4), 464-467 (1937).</li><li>Luria, S. E., Delbr&#252;ck, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+of+bacteria+from+virus+sensitivity+to+virus+resistance.">Mutations of bacteria from virus sensitivity to virus resistance.</a> Genetics. 28 (6), 491-511 (1943).</li><li>Jee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rates+and+mechanisms+of+bacterial+mutagenesis+from+maximum-depth+sequencing.">Rates and mechanisms of bacterial mutagenesis from maximum-depth sequencing.</a> Nature. 534 (7609), 693-696 (2016).</li><li>Fusco, D., Gralka, M., Kayser, J., Anderson, A., Hallatschek, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excess+of+mutational+jackpot+events+in+expanding+populations+revealed+by+spatial+Luria-Delbr&#252;ck+experiments.">Excess of mutational jackpot events in expanding populations revealed by spatial Luria-Delbr&#252;ck experiments.</a> Nature Communications. 7, (2016).</li><li>Halligan, D. L., Keightley, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+mutation+accumulation+studies+in+evolutionary+genetics.">Spontaneous mutation accumulation studies in evolutionary genetics.</a> Annual Review of Ecology Evolution and Systematics. 40 (1), 151-172 (2009).</li><li>J&#243;nsson, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parental+influence+on+human+germline+de+novo+mutations+in+1,548+trios+from+Iceland.">Parental influence on human germline de novo mutations in 1,548 trios from Iceland.</a> Nature. 549, (2017).</li><li>Kra&#353;ovec, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+mutation+rate+is+a+plastic+trait+associated+with+population+density+across+domains+of+life.">Spontaneous mutation rate is a plastic trait associated with population density across domains of life.</a> PLoS Biology. 15 (8), (2017).</li><li>Kra&#353;ovec, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation+rate+plasticity+in+rifampicin+resistance+depends+on+Escherichia+coli+cell-cell+interactions.">Mutation rate plasticity in rifampicin resistance depends on Escherichia coli cell-cell interactions.</a> Nature Communications. 5, 3742 (2014).</li><li>Massey, R. C., Buckling, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+regulation+of+mutation+rates+at+specific+sites.">Environmental regulation of mutation rates at specific sites.</a> Trends in Microbiology. 10 (12), 580-584 (2002).</li><li>Lynch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+drift,+selection+and+the+evolution+of+the+mutation+rate.">Genetic drift, selection and the evolution of the mutation rate.</a> Nature Review Genetics. 17 (11), 704-714 (2016).</li><li>Foster, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress-induced+mutagenesis+in+bacteria.">Stress-induced mutagenesis in bacteria.</a> Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 42 (5), 373-397 (2007).</li><li>Kra&#353;ovec, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Where+antibiotic+resistance+mutations+meet+quorum-sensing.">Where antibiotic resistance mutations meet quorum-sensing.</a> Microbial Cell. 1 (7), 250-252 (2014).</li><li>Kra&#353;ovec, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opposing+effects+of+final+population+density+and+stress+on+Escherichia+coli+mutation+rate.">Opposing effects of final population density and stress on Escherichia coli mutation rate.</a> The ISME Journal-Multidisciplinary Journal of Microbial Ecology. 12, 2981-2987 (2018).</li><li>Lea, D., Coulson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+distribution+of+the+numbers+of+mutants+in+bacterial+populations.">The distribution of the numbers of mutants in bacterial populations.</a> Journal of Genetics. 49 (3), 264-285 (1949).</li><li>Armitage, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+statistical+theory+of+bacterial+populations+subject+to+mutation.">The statistical theory of bacterial populations subject to mutation.</a> Journal of the Royal Statistical Society. Series B (Methodological. 14 (1), 1-40 (1952).</li><li>Koch, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation+and+growth+rates+from+Luria-Delbr&#252;ck+fluctuation+tests).">Mutation and growth rates from Luria-Delbr&#252;ck fluctuation tests).</a> Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. 95 (2-3), 129-143 (1982).</li><li>Cairns, J., Overbaugh, J., Miller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin+of+mutants.">The origin of mutants.</a> Nature. 335 (6186), 142-145 (1988).</li><li>Stewart, F. M., Gordon, D. M., Levin, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluctuation+analysis:+the+probability+distribution+of+the+number+of+mutants+under+different+conditions.">Fluctuation analysis: the probability distribution of the number of mutants under different conditions.</a> Genetics. 124 (1), 175-185 (1990).</li><li>Drake, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+constant+rate+of+spontaneous+mutation+in+DNA-based+microbes.">A constant rate of spontaneous mutation in DNA-based microbes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 88 (16), 7160-7164 (1991).</li><li>Ma, W. T., Sandri, G. V., Sarkar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+Luria-Delbr&#252;ck+distribution+using+discrete+convolution+powers.">Analysis of the Luria-Delbr&#252;ck distribution using discrete convolution powers.</a> Journal of Applied Probability. 29 (2), 255-267 (1992).</li><li>Shapiro, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+mutation+-+Who's+really+in+the+garden.">Adaptive mutation - Who's really in the garden.</a> Science. 268 (5209), 373-374 (1995).</li><li>Matic, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+variable+mutation+rates+in+commensal+and+pathogenic+Escherichia+coli.">Highly variable mutation rates in commensal and pathogenic Escherichia coli.</a> Science. 277 (5333), 1833-1834 (1997).</li><li>Rosche, W. A., Foster, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+mutation+rates+in+bacterial+populations.">Determining mutation rates in bacterial populations.</a> Methods. 20 (1), 4-17 (2000).</li><li>Rosenberg, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolving+responsively:+Adaptive+mutation.">Evolving responsively: Adaptive mutation.</a> Nature Reviews Genetics. 2 (7), 504-515 (2001).</li><li>Lynch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+the+mutation+rate.">Evolution of the mutation rate.</a> Trends in Genetics. 26 (8), 345-352 (2010).</li><li>Zheng, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+practical+guide+to+the+Luria-Delbr&#252;ck+protocol.">A new practical guide to the Luria-Delbr&#252;ck protocol.</a> Mutation Research. 781, 7-13 (2015).</li><li>Boesen, J. J. B., Niericker, M. J., Dieteren, N., Simons, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+variable+is+a+spontaneous+mutation-rate+in+cultured-mammalian-cells.">How variable is a spontaneous mutation-rate in cultured-mammalian-cells.</a> Mutation Research. 307 (1), 121-129 (1994).</li><li>Melnyk, A. H., Wong, A., Kassen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fitness+costs+of+antibiotic+resistance+mutations.">The fitness costs of antibiotic resistance mutations.</a> Evolutionary Applications. 8 (3), 273-283 (2015).</li><li>Sun, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+polyploidy+causes+phenotypic+delay+and+influences+bacterial+evolvability.">Effective polyploidy causes phenotypic delay and influences bacterial evolvability.</a> PLoS Biology. 16 (2), (2018).</li><li>Frenoy, A., Bonhoeffer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Death+and+population+dynamics+affect+mutation+rate+estimates+and+evolvability+under+stress+in+bacteria.">Death and population dynamics affect mutation rate estimates and evolvability under stress in bacteria.</a> PLoS Biology. 16 (5), (2018).</li><li>Foster, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+determining+spontaneous+mutation+rates.">Methods for determining spontaneous mutation rates.</a> Methods in Enzymology. , 195-213 (2006).</li><li>Wrande, M., Roth, J. R., Hughes, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accumulation+of+mutants+in+&amp;#34;aging&amp;#34;+bacterial+colonies+is+due+to+growth+under+selection,+not+stress-induced+mutagenesis.">Accumulation of mutants in &amp;#34;aging&amp;#34; bacterial colonies is due to growth under selection, not stress-induced mutagenesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (33), 11863-11868 (2008).</li><li>Adrien, M., R&#233;my, D., St&#233;phane, D., Bernard, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=flan:+An+R+package+for+inference+on+mutation+models.">flan: An R package for inference on mutation models.</a> The R Journal. 9. 334, (2017).</li><li>Garibyan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+the+rpoB+gene+to+determine+the+specificity+of+base+substitution+mutations+on+the+Escherichia+coli+chromosome.">Use of the rpoB gene to determine the specificity of base substitution mutations on the Escherichia coli chromosome.</a> DNA Repair. 2 (5), 593-608 (2003).</li><li>Stewart, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluctuation+tests:+how+reliable+are+the+estimates+of+mutation+rates?.">Fluctuation tests: how reliable are the estimates of mutation rates?.</a> Genetics. 137 (4), 1139-1146 (1994).</li><li>Baba, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+Escherichia+coli+K-12+in-frame,+single-gene+knockout+mutants:+the+Keio+collection.">Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection.</a> Molecular Systems Biology. 2 (1), (2006).</li><li>Yamagishi, J. -. I., Yoshida, H., Yamayoshi, M., Nakamura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nalidixic+acid-resistant+mutations+of+the+gyrB+gene+of+Escherichia+coli.">Nalidixic acid-resistant mutations of the gyrB gene of Escherichia coli.</a> Molecular and General Genetics MGG. 204 (3), 367-373 (1986).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+novel+mutations+associated+with+cycloserine+resistance+in+Mycobacterium+tuberculosis.">Identification of novel mutations associated with cycloserine resistance in Mycobacterium tuberculosis.</a> Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 72 (12), 3272-3276 (2017).</li><li>Lang, G. I., Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimating+the+per-base-pair+mutation+rate+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Estimating the per-base-pair mutation rate in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 178 (1), 67-82 (2008).</li><li>Uphoff, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+activation+of+a+DNA+damage+response+causes+cell-to-cell+mutation+rate+variation.">Stochastic activation of a DNA damage response causes cell-to-cell mutation rate variation.</a> Science. 351 (6277), 1094-1097 (2016).</li><li>Robert, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation+dynamics+and+fitness+effects+followed+in+single+cells.">Mutation dynamics and fitness effects followed in single cells.</a> Science. 359 (6381), 1283-1286 (2018).</li><li>Kong, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rate+of+de+novo+mutations+and+the+importance+of+father/'s+age+to+disease+risk.">Rate of de novo mutations and the importance of father/'s age to disease risk.</a> Nature. 488 (7412), 471-475 (2012).</li><li>Narasimhan, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimating+the+human+mutation+rate+from+autozygous+segments+reveals+population+differences+in+human+mutational+processes.">Estimating the human mutation rate from autozygous segments reveals population differences in human mutational processes.</a> Nature Communications. 8 (1), 303 (2017).</li></ol>

Författarna har inget att avslöja.

Varje uppskattning av en mutationshastighet måste maximera den precision som uppnåtts för att säkerställa repeterbarhet och reproducerbarhet inom och mellan studierna34. För en fluktuation assay, det finns tre kritiska överväganden. De två första har ställts in i det angivna protokollet men kommer att behöva felsökning (se figur 3) om protokollet är anpassat för att fungera med olika stammar eller miljöer. Först är att välja lämplig fenotypisk markör. För bakterier, det rekommenderas att uppskatta priser på en av två markör loci, rpob eller Gyra, ger resistens mot antibiotika rifampicin och nalidixinsyra Acid, respektive. Målstorleken för mutationer till antibiotikaresistens vid dessa två loci är annorlunda. Det finns 79 och 20 unika mutationer som ger resistens mot rifampicin37 och nalidixinsyra-syra40 respektive. I praktiken innebär detta att i genomsnitt, rifampicin resistenta mutanter oftare observeras. Så den första frågan (Q1 i figur 3) som måste besvaras är huruvida stammen är en Mutator. När konstitutiva mutatorer studeras, där många observerade muterade kolonier förväntas, är det bättre att använda en markör med en mindre Målstorlek (t. ex., nalidixinsyra-syra). Se figur 2B, där Mutations frekvenserna för den konstitutiva Mutatorn E. coli K-12 BW25113 Δmutt beräknades med hjälp av nalidixinsyra-syra som markör. När du arbetar med nonmutator bakteriestammar som har en vild typ (dvs, normal) mutationshastighet, rifampicin är ett bättre val (se figur 2a). Om det av någon anledning mer observerade mutanter behövs, en relevant markör är resistens mot en Cykloserin. För denna markör kan resistensmutationer dyka upp i mer än tio gener41, vilket innebär att målstorleken är ännu större än för rifampicin. När man studerar jäst och arkéer det rekommenderas att uppskatta Mutations hastigheter i 25s ribosomal proteiner och URA3, som ger resistens mot hygromycin B och 5-fluor-orotisk syra (5-FOA), respektive.
Det andra kritiska övervägandet är volymen av parallella kulturer. Vilken volym som ska användas beror på det faktiska antalet observerade mutanter. Det förväntade antalet observerade mutanter påverkas av målstorleken för den valda fenotypiska markören, stammens förmåga att reparera och undvika mutationer (den genomsnittliga Mutations hastigheten) och den bärande kapaciteten hos miljön, som påverkas både av de medier som används och kultur volymen. Om inga parallella kulturer innehåller muterade kolonier resistenta mot rifampicin, bör Cykloserin användas eller antalet pläterade celler bör ökas. Detta kan åstadkommas genom att lägga till mer glukos till ett minimalt medium eller genom att odla celler i en rikare (eller komplett) miljö. Men i många fall, en sådan ökning av befolkningstätheten är förknippad med en minskning av mutationshastighet, vilket resulterar i begränsad, om någon, ökning av antalet muterade kolonier observerade10. Om öka näringsämnena inte är en lösning, sedan öka antalet celler genom att öka volymen av varje parallell kultur är ett alternativ. När miljön innehåller minimala salter med socker som den enda källan till kol och energi (dvs. svaret på Q2 i figur 3 är "minimal medium"), då volymer mellan 0,5 och 1,5 ml bör användas. Om miljön är rik, då bör volymer av parallella kulturer vara mellan 0,35 − 1 mL. Den sista frågan gäller medianantalet resistenta kolonier. Om alltför få muterade kolonier observeras (dvs., svaret på Q3 i figur 3 är 0) och miljön inte ska ändras, då volymen av parallella kulturer bör ökas eller antibiotikum med en större Målstorlek (t. ex. Cykloserin) bör användas. Å andra sidan, om en hel del muterade kolonier observeras på alla selektiva plattor (mer än ~ 150 per tallrik, se figur 3), då antalet pläterade celler bör minskas, vilket vanligtvis innebär att använda en lägre volym eller byta till ett antibiotikum med en mindre Målstorlek (t. ex., nalidixinsyra syra).
När volymen är vald, är det bäst att alla parallella kulturer på 1 96 djupa väl plattan har samma volym. Som möjliggör mer exakt bestämning av den faktiska volymen av parallella kulturer från vikten av plattan. När Mutations frekvenser för en viss genotyp jämförs mellan olika miljöer, är det återigen bäst att använda samma volym av parallella kulturer i alla miljöer. Om nalidixisyra används för att uppskatta vild typ (dvs. normala) Mutations hastigheter eller någon annan fenotypisk markör används som har en ännu mindre Målstorlek än nalidixinsyra-syra, måste volymen ökas ännu mer. Ett alternativ är att göra parallella kulturer i 50 mL-rör med volymer på upp till 15 mL. Till exempel, 10 ml parallella kulturer bereddes i 50 ml rör vid uppskattning av E. coli K-12 MG1655 mutationshastighet till nalidixinsyra syra (se figur 2A). De parallella 10 mL-kulturerna var sedan pläterade på den selektiva TA-agar och hälldes i stora 150 mm plattor i stället för standard 90 mm petriskålar. Nackdelen med att förbereda parallella kulturer i 50 ml rör är att genomströmningen är betydligt lägre jämfört med testmetoder mutation priser i en 96 djup brunn plattan. En lösning är att minska antalet parallella kulturer. Detta kommer dock att påverka precisionen för uppskattningen av m, vilket beror på det förväntade antalet mutationella händelser och antalet parallella kulturer26. Att erhålla en fördelning av observerade mutanter med 14 − 17 parallella kulturer (som skedde i figur 2), är en bra balans mellan en solid genomströmning och en godtagbar precisionsnivå26 på 20%. En median precisionsnivå på 17,5% liknar median precisionen med ett interkvartil intervall på 16,4% (5,7% − 38,9%, n = 580) räknat från en mycket större datamängd10. Det rekommenderas därför att vid beredning av parallella kulturer i 96 djupa plåtar eller 50 mL rör fördelningen av observerade mutanter erhålls med minst 14 parallella kulturer. När Mutations hastigheter uppskattas i olika miljöer är det rekommenderat att testa precisionsnivåer genom att göra ett multiplate-experiment, där alla 96 parallella kulturer på en tallrik odlas i samma miljö. Dessutom, när man förbereder parallella kulturer, är det viktigt att inokulat innehåller ett lågt antal celler, eftersom det minskar risken för eventuella resistenta celler som finns i inoculum. Redan existerande resistenta mutanter är inte ville i inoculum, eftersom de kommer att öka i antal och skapa en gräsmatta på selektiva plattor och uppskattning av mutationshastighet kommer inte att vara möjligt. Till exempel, i de flesta nonmutator E. coli populationer, mutationshastighet till rifampicin motstånd är i storleksordningen ~ 10-8. Sålunda, för att undvika vaccinera kulturen med en redan existerande resistenta Mutant, måste man Inokulera med färre än 108 celler (t. ex., 103− 104 celler). Det sista kritiska steget är att se till att ytan på de selektiva agarplattorna är helt torr innan selektiva agarplattor inkuberas. Spridare kan inte användas om 6-well plattor används och den initiala volymen av en parallell kultur är 1 mL, till exempel. Plattorna måste lämnas täckta i sterila förhållanden för att låta ytvätskan torka ut. Den tid detta tar kan vara mycket varierande, beroende av omgivningsförhållanden och skicket på plattorna. Denna tid bör minimeras men kan vara upp till flera timmar.
Fluktuationsanalysen har inneboende begränsningar. Den analyser fenotypiska markörer för mutation endast i en liten delmängd av genomet. Analysen kräver därför stora populationer som går igenom ett tillräckligt antal generationer att observera tillräckligt mutationer för att uppskatta en hastighet alls. Detta innebär att fluktuationstester endast kan användas på organismer som är kapabla att gå igenom ett stort antal generationer snabbt, som bakterier, Baker ' s jäst42, eller flytande kultur däggdjursceller30. Mutationer är också sällsynta händelser som inträffar under de specifika biokemiska omständigheterna i en viss cell. Det faktum att fluktuationstester ser över stora populationer av celler över tiden innebär att dessa omständigheter kan skilja sig avsevärt. Med hjälp av denna analys är det därför svårt att studera progressionen av Mutations frekvenser av en viss population från lag-fasen till tidig och sen exponentiell fas och slutligen till en stationär fas. Varje differentiering av mutationshastigheter bland enskilda celler inom populationen är helt dold från fluktuationsanalysen. Encells mutation dynamik kan studeras med en enda molekyl spårning av DNA Repair protein MutS43 eller genom att räkna Foci av ackumulerade mutl proteiner44. De senaste framstegen inom sekvensering av höga dataflöden har också gjort det möjligt att direkt uppskatta mutationshastigheter från föräldra-avkomma trios9,45 och Flergenerationsundersökningar stamtavlor46. Sådana metodologiska framsteg börjar tillåta direkt räkning av mutationer som inträffar inom en enda generation. Emellertid, denna direkta strategi behöver dyra och State-of-the-art teknik som fluorescens mikroskopi, mikrofluidik, eller hela-Genome sekvensering. Å andra sidan är fluktuationsanalysen relativt billig och endast standard laboratorieutrustning behövs. Att göra fler fluktuationstester kommer också att underlätta generering av nya hypoteser som kan testas med mer direkta encellig metoder.
Det finns ett långvarigt intresse för studiet av mutationer, så fluktuationsanalysen kommer sannolikt att förbli en allmänt använd metod. Antalet citat av det nyskapande papperet av Luria och Delbrück5 under de senaste 4 åren (2015-2018) har alla varit bland de fem bästa för citeringar av denna uppsats. Men på grund av en stor mängd exakt manuellt arbete som behövs för att korrekt genomföra en fluktuation assay, de flesta studier utför bara en handfull fluktuation analyser. Detta är dock inte tillräckligt för att avslöja de miljömässiga beroenden av mutationshastighet. Genom att effektivisera fluktuationstester med hjälp av multispot plattor, som förklaras i detta papper, den nuvarande maximala genomströmningen möjligt är 11 djupa plattor (55 fluktuation analyser) parallellt, som beskrivs här. Kör två uppsättningar av fluktuation analyser vacklade av en dag parallellt, gör det möjligt att utföra upp till 110 analyser per vecka. En annan steg förändring i genomströmningen kan ändå vara möjligt genom att automatisera olika steg i fluktuationstester från rent manuella protokollet ges. För att studera miljö beroenden av mutationshastigheten måste befolkningstätheten också beaktas. Tidigare resultat10 visar att när kända faktorer som påverkar mutationshastighet redovisas, kan kontrollen av befolkningstätheten minska variationen i Mutations uppskattningar med mer än 90%. För att kontrollera densiteten rekommenderar vi att Nt (används för uppskattning av mutationshastighet) bestäms oberoende av den metod som används för att bestämma befolkningstätheten. Hos bakterier kan Nt bestämmas med hjälp av CFU och densitet, till exempel med ett ATP-baserat luminiscens-test10.
Hög genomströmning och kontroll av densitet är båda viktiga när man studerar hur en organism ekologiska sammanhang påverkar spontan mutationshastighet. Att veta förekomsten av mutationshastighet plasticitet är viktigt, men att förstå dess orsaker och effekter är viktiga utmaningar som måste uppfyllas om mutationshastighet plasticitet ska införlivas i ett bredare biologiskt sammanhang. Fluktuationen analysen är ett bra verktyg som kan användas för att testa många hypoteser, eftersom resultaten erhålls snabbt, och analyser är billiga i förhållande till andra metoder. Scenen är inställd, till exempel, att studera miljö beroende av mutationshastighet i bakteriesamhällen och mikrobiomer. Att anpassa fluktuationsanalysen till cocultures kan testa hypotesen att stammar påverkar varandras Mutations hastigheter via små molekyler. Att göra tusentals fluktuation analyser med cocultures kan avgöra om stammar varierar både i deras förmåga att ändra varandras mutation priser och i deras känslighet för att få sin mutation hastighet ändras av andra. Kanske variation bland stammar i känslighet för mutation hastighet manipulation är hänförlig till specifik genetisk variation. Detta kan förändra vår syn på hur evolutionen fungerar i komplexa samhällen, inte minst i exempel på stor betydelse som hur antimikrobiell resistens framträder.

År 1901 myntade den nederländske botanikern Hugo de Vries termen mutation1. Tjugosex år senare, när Hermann Joseph Muller upptäckte den mutagena verkan av röntgenstrålar2, var mutationer redan uppfattas som en av de drivande krafterna för evolution. Mutationernas karaktär var dock inte tydlig. För att besvara den grundläggande frågan om mutationer uppstår spontant (dvs. en spontan mutation) eller som svar på val (dvs. en inducerad mutation), en metod behövdes för att observera mutationella händelser. En sådan metod skulle mäta det förväntade antalet mutationer per celldelning eller vad som redan var känt som en mutationshastighet på3,4.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60406/60406fig1a.jpg"> Figur 1: Schematisk illustration av hur man utför fluktuationsanalysen med en mikrobiell stam i en 96 djup borrnings platta. A) Inokulera och anpassa sig-celler i 50 ml-rör som innehåller fem olika miljöer ("rött", "blått", "grönt", "lila" och "orange" analyser). (B) förbereda parallella kulturer med ett litet antal känsliga celler i en 96 djup brunn plattan. Den "röda" analysen har 20 parallella kulturer, medan den "blå", "grön", "lila", och "orange" analyser har alla 19 parallella kulturer. Positionerna för parallell kulturerna på 96 djup plattan är slumpmässiga. Randomisering kan göras med det kompletterande LayoutGenerator. R-skriptet eller något annat verktyg. Layouten uppe till höger är randomiserings resultatet. (C) inkubera 96 djup brunnen plattan och låta cellerna att dela och spontant mutera. Sex kulturer från djupa brunnar a1, B1, C1, E1, F1 och G1 visar hur antalet mutanter fluktuerar: 4, 0, 2, 2, 1 och 4 röda blodkroppar efter den tredje celldelningen respektive. Antalet mutanter skiljer sig inte bara på grund av det olika antalet spontana mutationer (0,1, eller 2 som den första röda cellen visar), utan också för att det är viktigt när en motstånds mutation under en kultur cykel spontant framträder (celldelningen 1, 2 eller 3). (D) efter inkubationen av 96 djup brunn plattan antalet mutanter bestäms genom plätering 81 parallella kulturer. På layouten är dessa cirklar utan fetstil kanter. Hela parallell kulturen pläteras på en brunn av en 6 brunn pläterar att innehålla en selektiv agar. Ede återstående 15 kulturerna späds och pläteras på den icke-selektiva agar för att bestämma det genomsnittliga antalet celler (Nt). På layouten är dessa märkta som ntwells och har fetstil kanter. För varje test är Nt medelvärde för tre parallella kulturer. Längst ner till höger är en petriskål som innehåller en icke-selektiv agar tallrik med 25 CFUs av en utspädd kultur som odlas i en djup brunn D1 (del av en "grön" analys). Fefter inkubation av de selektiva 6-plattorna räknades antalet observerade mutanter och det förväntade antalet mutationella händelser, m, beräknades med hjälp av en maximal sannolikhet estimator. (G) med vetskap om både antalet mutationer, moch antalet celler per analys, Nt, beräknades Mutations hastigheten som m/Nt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60406/60406fig1alarge.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
Salvador Luria och max Delbrück i 1943 gav en sinnrik lösning på detta problem med fluktuationsanalysen5 (se figur 1). Analysen inleds med flera populationer (namngivna parallella kulturer) som initieras med ett litet antal mikrobiella celler (figur 1a, B). Efter tillväxt i en godartad, icke-selektiv miljö (figur 1C), överförs parallella kulturer på plattor som innehåller en selektiv markör (Fager, antibiotika, etc.), där endast celler med en motstånds mutation överlever och kan producera en koloni (figur 1D). Den huvudsakliga förväntningen var att om resistens mutationer induceras, antalet celler som bär en mutation bör fördelas mellan olika populationer med medelvärdet lika med variansen. Vad Luria och Delbrück hittade med fluktuationsanalysen är att antalet mutanter fluktuerade drastiskt och att variationen i antalet mutanter mellan olika populationer var betydligt större än medelvärdet. Luria och Delbrück visade därmed att mutationer är spontana. De visade att mutationer spontant uppstår närhelst DNA replikeras, och antalet mutanter beror på när mutationen inträffar under befolkningstillväxten. Se figur 1C, där sex populationer, var och en initierades med en mikrobiell cell (i blått), upplever ingen, 1 eller 2 enstaka mutationer. Populationer a1, E1 och F1 upplevde en enda mutation (första röda cellen), men eftersom en enda mutation spontant framträder vid olika tidpunkter under en kultur cykel, hamnade populationer med ett helt annat antal observerade mutanter (fyra, två respektive en). Å andra sidan, populationer C1 och G1 slutade med samma antal observerade mutanter som E1 och a1, trots upplever två mutationella händelser snarare än en. Fluktuationen av observerade mutanter bland populationer inte bara gav analysen namnet, men visade också att en muterad frekvens (dvs. andelen mutanta celler) är en otillräcklig indikator på Mutations hastigheten.
Det övergripande målet för fluktuationsanalysen är att uppskatta den spontana Mutations hastigheten hos en viss genotyp av bakterier eller andra enkelcellade organismer som växer i en viss vätske miljö. Fluktuationsanalysen är fortfarande det lämpligaste verktyget för att studera miljö beroende av mikrobiell mutationshastighet och möjliggör en snabb och billig mutationsfrekvens uppskattning. Alternativa metoder för uppskattning av mutationshastighet, såsom maximal djupsekvensering6, populations sekvensering7, experiment med mutationsackumulering8, eller jämförelse av arvsmassa sekvenser av en avkomma till föräldrarna9 är mycket mer mödosamma, och därmed dåligt lämpade för att potentiellt upptäcka miljö beroenden. Emellertid, dynamiska aspekter av en mutation generation och reparation är till stor del otillgängliga för en fluktuation assay eller någon av metoderna för att testmetoder en mutationshastighet som anges ovan. För att studera hur antalet mutationer förändras i tid, rum, eller mellan enskilda celler i en population, en enda cell närmar sig11,12 är nödvändiga, som, förutom att vara mer mödosam än fluktuation analyser, kräver mycket specialiserade färdigheter och utrustning.
I praktiken, en fluktuation assay räknar celler få en fenotypisk markör på grund av en mutation som uppstår i en miljö som saknar val för den markören. Meta-analysen av hundratals publicerade analyser10 visar att minst 39 olika fenotypiska markörer har använts sedan analysens start i 1943. Fluktuationen analysen kan användas för att jämföra medelvärden och miljö beroende av mutation priser bland laboratorium, klinisk, nonmutator, och Mutator stammar växer i tillåtande miljöer. Analysen möjliggör mutation hastighet uppskattning i celler med olika genetiska bakgrunder växer i antingen minimal eller rika miljöer. Analysen är lämplig inte bara för populationer som växer som en monokultur men kan också användas för att studera effekterna av cell-cell interaktioner på mutation priser11. När stammen av intresse är coculodlas med en andra stam, och en neutral markör används för att skilja stammarna, Mutations hastigheter kan analyseras för två stammar i samma rör på samma gång.
Fluktuationstester har visat att den spontana Mutations hastigheten beror på både en cells genotyp och dess miljö12 och är ett drag som i sig utvecklas13. När mutationshastigheten för en viss genotyp ändras med miljön, beskrivs den som mutationsbaserad plasticitet11. Plast Mutations hastigheter har mest noggrant behandlats för stressinducerad mutagenes (SIM)14. Dessutom, med hjälp av fluktuationstester, det har nyligen visat att densiteten som en population av celler växer (typiskt en sats kultur vid transportkapacitet) är nära förknippad med mutation priser över bakterier och encelliga eukaryotes. Mutationshastigheten per genomet per generation minskar i täta populationer med så mycket som 23-faldigt10,11. Denna densitet-associerad mutation hastighet plasticitet (fuktig) kan bero på ett kvorum-Sensing system15 och agera oberoende av SIM16.
Här, ett detaljerat protokoll presenteras för fluktuation analysen används för att studera Escherichia coli stam K-12 få resistens mot antibiotika rifampicin i en glukos minimal mediemiljö. Emellertid, detta protokoll bör ses som en grundläggande mall som kan utnyttjas för att studera en mängd olika mikrober genom att helt enkelt ändra odlingsförhållanden och fenotypiska markörer av mutation. Protokollet har utvecklats från starten5,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29 genom dess användning på ett brett spektrum av mikrober och även cancerceller30 och har modifierats för att öka den genomströmning, vilket var viktigt för att korrekt testa miljö beroenden av mikrobiell mutation priser10,11,16. Det protokoll som beskrivs här omfattar inte alla metodologiska och analytiska frågor av fluktuationsanalysen som redan har diskuterats väl i litteraturen, särskilt Fitness effekter av resistenta mutationer31, fenotypisk fördröjning32, celldöd33, och lämpligheten av olika algoritmer tillgängliga för att uppskatta Mutations hastigheter26,34. Detta kan vara viktigt, till exempel närmiljö beroendet av konditions effekter kan ge upphov till en felaktig variation i beräkningarna av mutationshastigheten35. Vi noterar dock att de analytiska verktyg som vi använder här kan hantera variationen i Mutant fitness och celldöd. Som behandlas i noterna och diskussionen, det rekommenderas också att flera fenotypiska markörer som sannolikt inte har samma miljö beroende Fitness effekter övervägas. Detta protokoll kommer att göra det möjligt för människor att rutinmässigt analys miljö beroenden av Mutations hastigheter i mångfalden av mikrobiella stammar och miljöer. Assaying mutationer i olika miljöer har ännu inte testats grundligt och när befolkningstäthet anses, fluktuation analyser kan ge en mer exakt uppskattning av mutationshastighet10. Detta protokoll kommer att göra det möjligt att utföra fler fluktuationsanalyser, vilket är nödvändigt för att förstå mekanismerna bakom mutationshastigheter, vilket i sin tur är avgörande för förståelsen av evolution, carcinogenes, åldrande och antimikrobiell resistens.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 ml Microcentrifuge tubes</td>
			<td>Starlab International GmbH</td>
			<td>S1615-5550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8877-10g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>REF 657102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>90mm Petri Dishes Triple Vented</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>REF 120189</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 deep-well plate (Masterblock 2 ml)</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>REF 780270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium sulfate</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A/6440/53</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Agar</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>REF 214010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto yeast extract</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>REF 212750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cycloserine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1158005-250MG</td>
			<td>Only for assaying an alternative phenotypic marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose anhydrous</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>G/0500/61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml Centrifuge Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>REF 430828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-(+)-Arabinose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3256-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>M/1050/53</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalidixic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N8878-5G</td>
			<td>Only for assaying an alternative phenotypic marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate dibasic trihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5504-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0662-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rifampicin</td>
			<td>EMD Millipore Corp, USA</td>
			<td>557303-1GM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S/3160/60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectophotometer</td>
			<td>Jenway</td>
			<td>6320D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiamine hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4625-25g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trisodium citrate dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S1804-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>1278-7099</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring microbial mutation rates with the fluctuation assay

Fluktuationstester används ofta för att uppskatta Mutations hastigheter i mikrober som växer i flytande miljöer. Många kulturer är varje inokuleras med några tusen celler, varje känslig för en selektiv markör som kan analyseras fenotypiskt. Dessa parallella kulturer växer för många generationer i avsaknad av fenotypisk markör. En delmängd av kulturer används för att uppskatta det totala antalet celler som riskerar mutationer (dvs. befolkningsstorleken i slutet av tillväxtperioden, eller Nt). De återstående kulturerna är pläterade på den selektiva agar. Fördelningen av observerade resistenta mutanter bland parallella kulturer används sedan för att uppskatta det förväntade antalet mutationella händelser, m, med hjälp av en matematisk modell. Dividera m med Nt ger en uppskattning av mutationshastigheten per Locus per generation. Analysen har tre kritiska aspekter: den valda fenotypiska markören, den valda volymen av parallella kulturer, och se till att ytan på den selektiva agar är helt torr före inkubationen. Analysen är relativt billig och behöver bara standard laboratorieutrustning. Det är också mindre mödosamt än alternativa metoder, såsom mutation ackumulering och Single-cell assays. Analysen fungerar på organismer som går igenom många generationer snabbt och det beror på antaganden om Fitness effekter av markörer och celldöd. Men, nyligen utvecklade verktyg och teoretiska studier innebär dessa frågor kan nu behandlas analytiskt. Analysen tillåter mutationshastighet uppskattning av olika fenotypiska markörer i celler med olika genotyper växer i isolering eller i en gemenskap. Genom att utföra flera analyser parallellt kan analyser användas för att studera hur en organismens miljö sammanhang påverkar spontan mutationshastighet, vilket är avgörande för förståelsen av antimikrobiell resistens, karcinogenicitet, åldrande och evolution.

Resultaten samlades in med det rapporterade protokollet i fyra olika veckor av tre olika enskilda forskare, där varje vecka en 96 djup brunn plattan användes för att generera fem mutationshastighet uppskattningar. Alldeles 3 96 djupa tallrikar genererade 15 mutationshastighet uppskattningar (± 95% konfidensintervall, CI) i E. coli K-12 MG1655 (figur 2a, som används i protokollet), medan 1 96 djup väl plattan användes för fem uppskattningar (± 95% CI) av e. coli k-12 BW25113 Δmutt Mutant (figur 2B). I figur 2 är median precisionen med interkvartilintervall intervall för uppskattning av m 17,5% (1,00% − 28,9%, n = 20). Precision är koefficienten för variationen av förväntat antal mutationella händelser (m) beräknat som σm / m x 100% (där σ beräknas som tidigare visad38). Rådata för figur 2 finns i den kompletterande datafilen "Krasovec_etal_JoVE_data. csv". Den kompletterande data filen åtföljs av ett R-skript för att generera diagram 2. Se även tilläggstabell 2 för mer information om bakteriestammar och tilläggstabell 3, där kolumner i datafilen förklaras. Data punkter som erhållits med rifampicin och nalidixisyra har tidigare publicerats i Krašovec et al.10 och har samma ID här som när de först publicerades.
I figur 2A presenteras MG1655-mutationshastigheter av tre olika fenotypiska markörer, Cykloserin, rifampicin och nalidixisyra. Här, mutation priser bedömdes i Davis minimal medium med 80, 125, och 250 mg/L glukos, som förklaras i protokollet. I ett fall användes 1 000 mg/L glukos (figur 1B). I praktiken kan varje initial glukoskoncentration användas. Som förväntat, Mutations hastigheter var högre för Cykloserin resistens, lägst för nalidixinsyra Acid resistens, och graden av rifampicin resistens var i mitten. Detta är i överensstämmelse med de kända mål storlekarna för dessa tre motstånd, där den största är för Cykloserin och den minsta för nalidixinsyra syran. Diskussionen och figur 3 ger information om hur man utnyttjar mål storlekarna, volymerna av parallella kulturer och nivån av näringsämnen i miljön för att optimera mätningen av mikrobiell mutationsfrekvens med fluktuationsanalysen.
Fluktuationsanalysen visar tydligt vilken stam som är en konstitutiv Mutator och som har normala Mutations hastigheter. Δmutt -stammen hade en cirka 50x högre mutationshastighet till nalidixinsyra-syra resistens (figur 2B) som MG1655 (figur 2a). För att bestämma mutationshastigheten för en viss genotyp i olika miljöer rekommenderas dock att göra minst fem replikat per genotyp per miljö med endast en fenotypisk markör. För en detaljerad beskrivning av de statistiska metoder som tidigare använts för att analysera denna typ av experiment, se kompletterande information i Krašovec et al.10.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60406/60406fig2a.jpg"> Figur 2: representativ siffra för mutationshastigheter som uppskattas av fluktuationsanalysen i populationer av Escherichia coli . A) mutationshastigheten enligt det rapporterade protokollet i Wild Type MG1655 (cirklar). Figuren visar mutationshastigheter i närvaro av rifampicin (ljusblå cirklar), nalidixinsyra Acid (röda cirklar), och cykloserin (mörkblå cirklar) motstånd. För nalidixinsyra-syra användes större odlings volymer på 10 ml (se kompletterande datafil). Data för rifampicin och nalidixisyra replotted från figur 2a i krašovec et al.10. (B) mutationshastigheten till nalidixinsyra Acid resistens i Keio39 Δmutt Mutant (röda trianglar). Anteckna den logaritmiska skalan på mutationsfrekvens axeln. Felstaplar = 95% konfidensintervall beräknas enligt beskrivningen i protokollet. Data replotted från figur 4a i krašovec et al.10. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60406/60406fig2alarge.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60406/60406fig3a.jpg"> Bild 3: ett flödesschema för felsökning av fluktuationsanalysen. Flödesschemat ska följas uppifrån, och adressera de tre frågorna i de gula diamanterna i tur och ordning, justera protokollet enligt innehållet i de gröna rutorna och implementera det protokoll som anges i de röda ovalerna. Se de tre första styckena i diskussionen för mer information om hur du felsöker. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60406/60406fig3large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
Tilläggstabell 1: formler för mediet som används i protokollet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60406/supptable1.xlsx" target="_blank">Vänligen klicka här för att se denna tabell (Högerklicka för att ladda ner).</a>
Kompletterande tabell 2: bakteriestammar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60406/supptable2.xlsx" target="_blank">Vänligen klicka här för att se denna tabell (Högerklicka för att ladda ner).</a>
Tilläggstabell 3: detaljerad beskrivning av kolumnerna i rådatafilen Krasovec_etal_JoVE_data. csv. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60406/supptable3.xlsx" target="_blank">Vänligen klicka här för att se denna tabell (Högerklicka för att ladda ner).</a>
Kompletterande datafiler. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60406/Supplemental_Data_Files.zip" target="_blank">Vänligen klicka här för att ladda ner dessa filer.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Microbial Mutation Rates with the Fluctuation Assay at JoVE.com

Measuring Microbial Mutation Rates with the Fluctuation Assay

Här presenteras ett protokoll för att utföra en fluktuationsanalys och uppskatta mikrobiell mutationshastighet med hjälp av fenotypiska markörer. Detta protokoll kommer att göra det möjligt för forskare att assay mutationer i olika mikrober och miljöer, fastställa hur genotyp och ekologiska sammanhang påverkar spontan mutation priser.

Mätning av mikrobiell mutationsfrekvens med Fluktuationsanalysen

Fluctuation assays are widely used for estimating mutation rates in microbes growing in liquid environments. Many cultures are each inoculated with a few ...

Protokollet tillåter mutationsskattning i mikrober. Det kan visa hur en organismer miljökontext effekter sannolikheten för spontan mutation. Den största fördelen med detta protokoll är att det är billigt och effektivt.Många uppskattningar av mutationshastigheten kan göras parallellt. Mutationer som detta protokoll åtgärder kan följa resistens mot antibiotika. Så detta protokoll kan användas för att studera en av världens största utmaning, antimikrobiell resistens.Denna metod kan ge insikt i hur celler ekologiska sammanhang kan påverka utvecklingen av antimikrobiell resistens. Detta protokoll uppskattar mutational priser i monokultur av laboratoriet stam, men vi har tillämpat det på kliniska stammar och samkultur av två stammar för att skilja bioneutral molekyl. De mest farliga reaktioner som används i detta protokoll är antibiotikum rifampicin och metanol.Så se till att använda skyddshandskar och skyddsglasögon när rifampicin är upplöst i metanol. För att påbörja detta förfarande inokulera tre mL flytande lysogeny buljong med en skrapa av is från E.coli K12 glycerol lager. Skaka LB-kulturen vid 120 rpm och vid 37 grader celsius i cirka sju timmar.Efter detta späder man kulturen 2000-faldig med saltlösningen. Tillsätt 10 mL flytande Davis minimalt medium till varje rör med varje innehållande en annan koncentration av glukos som visas här. Tillsätt 100 mikroliter av den utspädda odlingen till tre 50 mL skärmlock koniska botten polymerrör.Förbered 22 mL av fem olika lösningar av flytande Davis minimalt medium med glukos, var och en i sin egen 50 mL rör som kontur i textprotokollet. För att förbereda inokulär för miljöerna, mäta först den optiska densiteten hos övernattningskulturerna vid 600 nanometer. Späd ut odlingarna med saltlösning och lägg till mellan 2200 och 110000 celler i varje miljö.Detta kommer att säkerställa att inokulat för en mL av miljön innehåller mellan 1000 och 5000 celler. Därefter skapa en slumpmässig layout av parallella kulturer för 196 djupa väl plattan. Överför ett mL av det inokulerade mediet i varje brunn av plattan enligt layouten.Sedan, fixera locket på plattan med tejp och väg hela plattan med locket och tejp. Skaka plattan vid 250 rpm och vid 37 grader Celsius i 24 timmar. Efter detta, placera två L av destillerat vatten i inkubatorn för att stabilisera mängden avdunstning bland de experimentella uppsättningar.Bestäm inokulatstorleken genom att plätera 10 mikroliter av var och en av de inokulerade medierna på en icke-selektiv TA-agarplatta. Använd en steril L-formad spridare tills agarytan är torr. Sedan, förbereda selektiv TA agar som innehåller rifampicin i sex brunnsplattor.Pipett fem mL av den selektiva TA-agaren in i varje brunn av de sex brunnsplåtarna. Räkna kolonin som bildar enheter på de icke-selektiva agarplattorna, och bestäm storlekens inokula. Efter 24 timmars inkubation, väg hela djup väl plattan för att bestämma mängden avdunstning, som sannolikt är runt 10%Överför tre slumpmässigt valda kulturer per analys i märkta microcentrifugrör.Platta de återstående 81 parallella kulturerna från den djupa brunnsplattan på den selektiva TA-agar som innehåller rifampicin. Därefter tar du bort locken från de selektiva agarplattorna och låt dem inte avslöjas i sterila förhållanden för att torka ut all vätska på agarens yta. Bestäm antalet kolonibildande enheter genom att späda ut odlingarna från mikrocentrifugrören med hjälp av fem 10-faldiga utspädningssteg genom att blanda och virveli 900 mikroliter av saltlösning med 100 mikroliter av odlingen per utspädningssteg.Plåt 40 mikroliter av den slutliga utspädningen på den icke-selektiva TA-agarn och placera locket på plattorna. Inkubera över natten vid 37 grader Celsius. När alla brunnar på en sex brunnsplatta är fria från odlingsvätskan, placera locket igen.Sedan inkubera plattorna med locket på i 37 grader Celsius i 44-48 timmar. På dag fyra, räkna kolonin som bildar enheter på de icke-selektiva agarplattorna. På dag fem, räkna antalet kolonier som är resistenta mot antibiotikan på de selektiva TA-agarplattorna.Registrera fördelningen mellan parallella kulturer av det observerade antalet mutanter för en viss analys. Öppna lämplig programvara på datorn. I hypotestestfliken lämnar du värdena vid sina standardvärden.Klicka på Bläddra och markera textfilen med fördelningen av observerade mutanter. Efter uppladdning av filen, klicka på utfört test. På höger sida, under resultatet av testet, under One Sample ML-test, hitta mutationen nummer.Detta är m, det förväntade antalet mutationshändelser. Sedan, uppskatta mutationshastigheten för viss genotyp i en viss miljö som disposition i textprotokollet. MG1655 mutationsfrekvens av tre olika fenotypiska markörer, cycloserin, rifampicin och nalidixic syra visas här.Mutationsfrekvenserna bedöms i Davis minimalt medium med glukoskoncentrationen 80 mg/L, 125 mg/L och 250 mg/L. I ett fall används en glukoskoncentration på 1000 mg/L. Som väntat är mutationshastigheter högre för cykloskristen resistens, lägst för nalidixsyraresistens, och graden av rifampicin resistens är i mitten.Fluktuationsanalysen visar tydligt vilken stam som är en kontitutiv mutator och som har normala mutationshastigheter. Som mutT deletant stammen hade en mutationshastighet till nalidixic syra resistens som är ungefär 50x högre än kontrollen MG1655 stam. Medan du förformar detta protokoll, se till att dina celler växer bra.De bör växa till en enhetlig täthet över parallella kulturer med samma miljö. En följ upp till detta tillvägagångssätt är att bestämma DNA-sekvensen av rpoB-genen i resistenta kolonier. För att bestämma hur spektrumet av mutationer till rifampicin resistens varierar med miljö-mikrobiell genotyp.Fluktuationsanalyser under 1900-talet visade hur mutation är spontan och slumpmässig med avseende på miljön. Nu sprider de nytt ljus över hur mutationsfrekvensen varierar med miljön genetiskt, ekologiskt, även socialt.

Research

JoVE Journal

Genetics

Monitoring Spatial Segregation in Surface Colonizing Microbial Populations

Övervakning Rumslig segregation i Surface kolonisera mikrobiella populationer

Microbes provide an intriguing system to study social interaction among individuals within a population. The short generation times and relatively simple ...

Purification of High Molecular Weight Genomic DNA from Powdery Mildew for Long-Read Sequencing

Rening av hög molekylvikt Genomiskt DNA från mjöldagg för lång Läs Sequencing

The powdery mildew fungi are a group of economically important fungal plant pathogens. Relatively little is known about the molecular biology and genetics ...

Measuring mRNA Levels Over Time During the Yeast S. cerevisiae Hypoxic Response

Measuring mRNA Levels Over Time During the Yeast S. cerevisiae Hypoxic Response

Mäta mRNA nivåer över tid under den jäst S. cerevisiae hypoxisk svar

Complex changes in gene expression typically mediate a large portion of a cellular response. Each gene may change expression with unique kinetics as the ...

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

Generation av en gen-stört Streptococcus mutans stam utan genen kloning

Typical methods for the elucidation of the function of a particular gene involve comparative phenotypic analyses of the wild-type strain and a strain in ...

Determining Genome-wide Transcript Decay Rates in Proliferating and Quiescent Human Fibroblasts

Fastställande av Genome-wide avskrift Decay priser i prolifererande och Quiescent mänskliga fibroblaster

Quiescence is a temporary, reversible state in which cells have ceased cell division, but retain the capacity to proliferate. Multiple studies, including ...

Measuring Gene Expression in Bombarded Barley Aleurone Layers with Increased Throughput

Mäta genuttryck i bombarderade korn Aleurone lager med ökad genomströmning

The aleurone layer of barley grains is an important model system for hormone-regulated gene expression in plants. In aleurone cells, genes required for ...

Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere

Utforska den roten mikrobiomet: extrahera bakteriell gemenskapen Data från jord, odlingsbädden och rot Endosphere

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to ...

Measuring Exercise Levels in Drosophila melanogaster Using the Rotating Exercise Quantification System (REQS)

Measuring Exercise Levels in Drosophila melanogaster Using the Rotating Exercise Quantification System REQS

Mäta motion nivåer i Drosophila melanogaster använder den roterande motion kvantifiering systemet (REQS)

Drosophila melanogaster is a new model organism for studies in exercise biology. To date, two main exercise systems, the Power Tower and the Treadwheel ...

Determining 3'-Termini and Sequences of Nascent Single-Stranded Viral DNA Molecules during HIV-1 Reverse Transcription in Infected Cells

Avgörande 3'-Termini och sekvenser av begynnande enkelsträngat virala DNA-molekyler under HIV-1 omvänd Transkription i infekterade celler

Monitoring of nucleic acid intermediates during virus replication provides insights into the effects and mechanisms of action of antiviral compounds and ...