Name: in vitro establishment of a genetically engineered murine head and neck cancer cell line using an adeno-associated virus-cas9 system
Uploaded: 2020-01-09T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Establishment of a Genetically Engineered Murine Head and Neck Cancer Cell Line using an Adeno-Associated Virus-Cas9 System at JoVE.com

نود ان نشكر الدكتور دانيال Gitler لتزويدنا مع pAd دلتا 5 المساعد plasmid. تم تمويل هذا العمل من قبل مؤسسه العلوم الاسرائيليه 700/16) (بالنسبة لي) ، ومؤسسه العلوم الثنائية بين الولايات المتحدة وإسرائيل (بالنسبة لي ، 2017323) ، وجمعيه السرطان الاسرائيليه (ICA ، 20170024) (بالنسبة لي) ، ومؤسسه أبحاث السرطان الاسرائيليه (ICRF ، 17-1693-ركدا) (بالنسبة لي) ، ومؤسسه #7895 الزمالة: زمالة ألون لي وزمالات BGU Kreitman إلى SJ و MP.

وقد تمت الموافقة علي هذه الدراسة من قبل جامعه بن غوريون في لجنه رعاية واستخدام الماشية في النقب. تمت الموافقة علي التجارب الحيوانية من قبل IACUC (80-12-2015 و IL. 29-05-2018 (ه)). وكانت جميع جوانب اختبار الحيوانية ، والإسكان ، والظروف البيئية المستخدمة في هذه الدراسة في الامتثال للدليل لرعاية واستخدام ال...

<ol>
	<li>Reyes-Gibby, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+association+study+identifies+genes+associated+with+neuropathy+in+patients+with+head+and+neck+cancer.">Genome-wide association study identifies genes associated with neuropathy in patients with head and neck cancer.</a> Scientific Reports. 8 (1), 8789 (2018).</li><li>Riaz, N., Morris, L. G., Lee, W., Chan, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unraveling+the+molecular+genetics+of+head+and+neck+cancer+through+genome-wide+approaches.">Unraveling the molecular genetics of head and neck cancer through genome-wide approaches.</a> Genes &amp; Diseases. 1 (1), 75 (2014).</li><li>Leemans, C. R., Snijders, P. J. F., Brakenhoff, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+landscape+of+head+and+neck+cancer.">The molecular landscape of head and neck cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 18 (5), 269-282 (2018).</li><li>Jiang, X., Ye, J., Dong, Z., Hu, S., Xiao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+genetic+alterations+and+their+impact+on+target+therapy+response+in+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma.">Novel genetic alterations and their impact on target therapy response in head and neck squamous cell carcinoma.</a> Cancer Management and Research. 11, 1321-1336 (2019).</li><li>Im, W., Moon, J., Kim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+CRISPR/Cas9+for+Gene+Editing+in+Hereditary+Movement+Disorders.">Applications of CRISPR/Cas9 for Gene Editing in Hereditary Movement Disorders.</a> Journal of Movement Disorders. 9 (3), 136-143 (2016).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+analysis+of+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma+cell+lines+and+human+tumors:+a+rational+approach+to+preclinical+model+selection.">Genomic analysis of head and neck squamous cell carcinoma cell lines and human tumors: a rational approach to preclinical model selection.</a> Molecular Cancer Research: MCR. 12 (4), 571-582 (2014).</li><li>AACR Project GENIE Consortium, T.A.P.G.. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AACR+Project+GENIE:+Powering+Precision+Medicine+through+an+International+Consortium.">AACR Project GENIE: Powering Precision Medicine through an International Consortium.</a> Cancer Discovery. 7 (8), 818-831 (2017).</li><li>Suh, Y., Amelio, I., Guerrero Urbano, T., Tavassoli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+update+on+cancer:+molecular+oncology+of+head+and+neck+cancer.">Clinical update on cancer: molecular oncology of head and neck cancer.</a> Cell Death &amp; Disease. 5 (1), e1018 (2014).</li><li>Anderson, J. A., Irish, J. C., Ngan, B. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+of+RAS+oncogene+mutation+in+head+and+neck+carcinomas.">Prevalence of RAS oncogene mutation in head and neck carcinomas.</a> The Journal of Otolaryngology. 21 (5), 321-326 (1992).</li><li>Ryals, R. C., Boye, S. L., Dinculescu, A., Hauswirth, W. W., Boye, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+transduction+efficiencies+of+unmodified+and+tyrosine+capsid+mutant+AAV+vectors+in+vitro+using+two+ocular+cell+lines.">Quantifying transduction efficiencies of unmodified and tyrosine capsid mutant AAV vectors in vitro using two ocular cell lines.</a> Molecular Vision. 17, 1090-1102 (2011).</li><li>Smith-Arica, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+Efficiency+of+Human+and+Mouse+Embryonic+Stem+Cells+Using+Adenoviral+and+Adeno-Associated+Viral+Vectors.">Infection Efficiency of Human and Mouse Embryonic Stem Cells Using Adenoviral and Adeno-Associated Viral Vectors.</a> Cloning and Stem Cells. 5 (1), 51-62 (2003).</li><li>Li, J., Xiao, X., Kenniston, T., Kudlow, J., Giannoukakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV+Vectors.">AAV Vectors.</a> Molecular Therapy. 3 (5), S174-S192 (2001).</li><li>Institute of Laboratory Animal Resources (U.S.). <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Guide for the care and use of laboratory animals. , (1996).</li><li>Platt, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas9+knockin+mice+for+genome+editing+and+cancer+modeling.">CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling.</a> Cell. 159 (2), 440-455 (2014).</li><li>Zhang, Y., Chirmule, N., Gao, G. P., Wilson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD40+ligand-dependent+activation+of+cytotoxic+T+lymphocytes+by+adeno-associated+virus+vectors+in+vivo:+role+of+immature+dendritic+cells.">CD40 ligand-dependent activation of cytotoxic T lymphocytes by adeno-associated virus vectors in vivo: role of immature dendritic cells.</a> Journal of Virology. 74 (17), 8003-8010 (2000).</li><li>Xiao, X., Li, J., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+high-titer+recombinant+adeno-associated+virus+vectors+in+the+absence+of+helper+adenovirus.">Production of high-titer recombinant adeno-associated virus vectors in the absence of helper adenovirus.</a> Journal of Virology. 72 (3), 2224-2232 (1998).</li><li>Auricchio, A., Hildinger, M., O'Connor, E., Gao, G. P., Wilson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Highly+Infectious+and+Pure+Adeno-Associated+Virus+Type+2+Vectors+with+a+Single-Step+Gravity-Flow+Column.">Isolation of Highly Infectious and Pure Adeno-Associated Virus Type 2 Vectors with a Single-Step Gravity-Flow Column.</a> Human Gene Therapy. 12 (1), 71-76 (2001).</li><li>Lock, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+Recombinant+Adeno-Associated+Virus+Type+2+Reference+Standard+Material.">Characterization of a Recombinant Adeno-Associated Virus Type 2 Reference Standard Material.</a> Human Gene Therapy. 21 (10), 1273 (2010).</li><li>Challis, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+AAV+vectors+for+widespread+and+targeted+gene+delivery+in+rodents.">Systemic AAV vectors for widespread and targeted gene delivery in rodents.</a> Nature Protocols. 14 (2), 379-414 (2019).</li><li>Rabinowitz, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-packaging+of+a+single+adeno-associated+virus+(AAV)+type+2+vector+genome+into+multiple+AAV+serotypes+enables+transduction+with+broad+specificity.">Cross-packaging of a single adeno-associated virus (AAV) type 2 vector genome into multiple AAV serotypes enables transduction with broad specificity.</a> Journal of Virology. 76 (2), 791-801 (2002).</li><li>Cheng, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Memorial+Sloan+Kettering-Integrated+Mutation+Profiling+of+Actionable+Cancer+Targets+(MSK-IMPACT).">Memorial Sloan Kettering-Integrated Mutation Profiling of Actionable Cancer Targets (MSK-IMPACT).</a> The Journal of Molecular Diagnostics. 17 (3), 251-264 (2015).</li><li>Sun, H., Taneja, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Transformation+and+Tumorigenicity+Using+Mouse+Embryonic+Fibroblast+Cells.">Analysis of Transformation and Tumorigenicity Using Mouse Embryonic Fibroblast Cells.</a> Cancer Genomics and Proteomics. 383, 303-310 (2007).</li><li>Durkin, M., Qian, X., Popescu, N., Lowy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Mouse+Embryo+Fibroblasts.">Isolation of Mouse Embryo Fibroblasts.</a> BIO-PROTOCOL. 3 (18), (2013).</li><li>Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Mouse+Embryonic+Fibroblast+Cells+Suitable+for+Culturing+Human+Embryonic+and+Induced+Pluripotent+Stem+Cells.">Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (64), e3854 (2012).</li><li>Boehm, J. S., Hession, M. T., Bulmer, S. E., Hahn, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+Human+and+Murine+Fibroblasts+without+Viral+Oncoproteins.">Transformation of Human and Murine Fibroblasts without Viral Oncoproteins.</a> Molecular and Cellular Biology. 25 (15), 6464 (2005).</li><li>Gupta, T., S&#225;enz Robles, T. M., Pipas, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+transformation+of+mouse+embryo+fibroblasts+in+the+absence+of+activator+E2Fs.">Cellular transformation of mouse embryo fibroblasts in the absence of activator E2Fs.</a> Journal of Virology. 89 (9), 5124-5133 (2015).</li><li>Leong, H., Blewitt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrovirus+Mediated+Malignant+Transformation+of+Mouse+Embryonic+Fibroblasts.">Retrovirus Mediated Malignant Transformation of Mouse Embryonic Fibroblasts.</a> BIO-PROTOCOL. 3 (15), (2013).</li><li>Parikh, N., Nagarajan, P., Sei-ichi, M., Sinha, S., Garrett-Sinha, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+an+immortalized+oral+keratinocyte+cell+line+of+mouse+origin.">Isolation and characterization of an immortalized oral keratinocyte cell line of mouse origin.</a> Archives of Oral Biology. 53 (11), 1091-1100 (2008).</li><li>Badarni, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repression+of+AXL+expression+by+AP-1/JNK+blockage+overcomes+resistance+to+PI3Ka+therapy.">Repression of AXL expression by AP-1/JNK blockage overcomes resistance to PI3Ka therapy.</a> JCI Insight. 5, 125341 (2019).</li><li>Chen, Y. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+of+mouse+oral+carcinoma+cell+lines+derived+from+transgenic+mice+and+their+use+as+syngeneic+tumorigenesis+models.">Establishing of mouse oral carcinoma cell lines derived from transgenic mice and their use as syngeneic tumorigenesis models.</a> BMC Cancer. 19 (1), 281 (2019).</li><li>Hoover, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Human+Papillomavirus+16+E6+in+Anchorage-Independent+and+Invasive+Growth+of+Mouse+Tonsil+Epithelium.">The Role of Human Papillomavirus 16 E6 in Anchorage-Independent and Invasive Growth of Mouse Tonsil Epithelium.</a> Archives of Otolaryngology-Head &amp; Neck Surgery. 133 (5), 495 (2007).</li><li>Smahel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metastatic+MHC+class+I-negative+mouse+cells+derived+by+transformation+with+human+papillomavirus+type+16.">Metastatic MHC class I-negative mouse cells derived by transformation with human papillomavirus type 16.</a> British Journal of Cancer. 84 (3), 374-380 (2001).</li><li>He, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+Growth+of+a+Newly+Established+Mouse+Epithelial+Cell+Line+Transformed+with+HPV-16+E7+in+Diabetic+Mice.">Increased Growth of a Newly Established Mouse Epithelial Cell Line Transformed with HPV-16 E7 in Diabetic Mice.</a> PloS One. 11 (10), e0164490 (2016).</li></ol>

وقد استخدمت عده طرق سابقا لتحويل الخلايا الاساسيه في الثقافة مع درجات متفاوتة من النجاح25,26,27,28. معظم هذه الطرق استخدام خلايا الخلية الليفية الماوس للتحول14،17،18،<...

HNC هو الخبيثة الشائعة في جميع انحاء العالم1. نمذجة نشاه الأورام HNC حاليا في نقطه تحول العلمية2. في حين تم التعرف علي العديد من الطفرات الجينية في hnc2،3،4 (مثل ، TP53 ، PIK3CA ، NOTCH1 ، FAT1 ، وراس) التوليفات محدده من التعديلات الجينية المطلوبة في الحفل للحث علي hnc تبقي غير واضحة.
وقد ساعد الاستخدام الحالي للخطوط الخلوية HNC البشرية بشكل كبير لتوضيح أليات المرتبطة بالتسبب والعلاج3. ومع ذلك ، فان دراسة خطوط الخلايا البشرية في أنظمه الجينات المناعية لها حدودها ، لان هذه الانظمه لا تعالج عمليه الأورام المجهرية ، ودور طفرات جينيه محدده ، واستجابات العلاج في بيئة ميكرومناعيه. التالي ، فان تطوير وإنشاء خطوط خلايا murine مع التعديلات الجينية المحددة هي ذات اهميه أساسيه لدراسة كيفيه مساهمه الجينات المختلفة في عمليه التحول واختبار العلاجات الجديدة القائمة علي جزيء في الفئران المناعية.
وقد تاثرت دراسات وظائف الجينات في البحوث الطبية الحيوية بشكل كبير بالتقدم في تكنولوجيات تحرير الحمض النووي ، من خلال إدخال فواصل مزدوجة الحبل (DSBs) ، علي سبيل المثال5. هذه التكنولوجيات ، بما في ذلك استخدام الزنك الاصبع السبابة ، النسخ المنشط مثل المنحرف المستجيب ، وتكرار الفاصلة التنظيمية متباعدة المتداخلة (CRISPR/كاس 9) ، تسمح للتلاعب من اي جين الفائدة في موضعها. وتتالف أحدث أنظمه CRISPR/كاس 9 من دليل RNA (gRNA) الذي يوجه النيوداز كاس 9 لتوليد DSB في موقع معين في الجينوم. وقد اكتسب هذا النظام اعترافا واسع النطاق في تعديل الجينات الذاتية في اي خليه أو الانسجه المستهدفة ، حتى في الكائنات الأكثر صعوبة لعلاج التقليدية5. لديها مزايا متعددة علي الانظمه الأخرى نظرا لبساطتها ، والسرعة ، والكفاءة.
في مجال الأورام ، حققت تقنيه CRISPR/كاس 9 الحاجة إلى تقليد الخلايا السرطانية بشكل فعال. لإنشاء هذا النظام في hnc ، ونحن التلاعب القوية kras ورمي واثنين من الجينات المثبطة الأورام الهامه ، APC و p536. وفقا لقاعده بيانات الجني7، وهذا المزيج هو نادر في hnc. الطفرات RAS (HRAS ، NRAS ، و KRAS) موجودة في فقط ~ 7 ٪ من جميع السكان HNC. هذه الأورام تميل إلى ان تكون مقاومه للعلاج8،9.
ويتحقق تسليم كاس 9 والgrna من خلال المحولات الفيروسية باستخدام الطائرات بالطائرة أو اللينتيفيروسيس. المؤتلف AAV غالبا ما يكون الأسلوب المفضل لتقديم الجينات إلى الخلايا المستهدفة نظرا لارتفاع titer ، استجابه مناعية خفيفه ، والقدرة علي نقل مجموعه واسعه من الخلايا ، والسلامة العامة. باستخدام نظام AAV ، تم إنشاء خطوط خلايا الماوس المختلفة الانسجه الخاصة ، وخطوط الخلايا الجديدة لا تزال قيد التطوير10،11،12. ومع ذلك ، فان نظام التحرير الجيني الفعال الذي يمكن ان يولد خلايا نماذج خطوط الخلية التي لا يزال يتعين تطويرها. في هذه الدراسة ، سعينا لتطوير نظام القائم علي كاس 9 في المختبر لتحويل خلايا اللسان الاوليه murine إلى حاله الأورام. ويمكن استخدام هذا البروتوكول فريدة من نوعها CRISPR/كاس 9 التحول وخط الخلايا السرطانية التي أنشئت لفهم أفضل بيولوجيا HNC الناجمة عن تنوع التغييرات الجينوم.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti mouse HRP</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>115-035-146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti rabbit HRP</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>711-035-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cas9 Mouse mAb</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>14697</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cre</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>900901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3-AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>115-165-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy-AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>111-165-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-9996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>4370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit monoclonal anti E cadherin</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>3195S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit monoclonal anti-KRT 14</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB-ab181595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946; actin</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>691001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946; catenin</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9582S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell lines</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK93T</td>
			<td>ATCC</td>
			<td><a href="https://www.atcc.org/en/Products/All/CRL-3216.aspx" target="_blank">CRL-3216</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture Media, Chemicals and Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford Reagent</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>30015484</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0332-TAM-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI fluoromount</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>0100-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd.</td>
			<td>01-055-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL (Westar Supernova and Westar Nova 2.0)</td>
			<td>Cyanagen</td>
			<td>XLS3.0100 and XLS071.0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd.</td>
			<td>04-127-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H6648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin - Agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H6508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolate II Genomic DNA Kit</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-52066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Panreac AppliChem</td>
			<td>300283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Bio Lab Ltd</td>
			<td>1903059100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd.</td>
			<td>02-023-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEI</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>23966-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen Strep Solution</td>
			<td>Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd.</td>
			<td>03-031-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>30525-89-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatase inhibitor cocktail</td>
			<td>Biotool</td>
			<td>B15001A/B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>P2714-1BTL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris buffer</td>
			<td>MERCK Millipore</td>
			<td>648311-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enzymes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E1014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase IV</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17104019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>18047019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>H3506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd.</td>
			<td>03-050-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass wares</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover slips</td>
			<td>Bar Naor</td>
			<td>BNCB00130RA1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides</td>
			<td>Bar Naor</td>
			<td>BN9308C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse strains</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6</td>
			<td>Envigo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6;129-Gt(ROSA)26Sortm1(CAG-cas9*,-EGFP)Fezh/J</td>
			<td>Jackson labs</td>
			<td>24857</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOD.CB17-Prkdc-scid/NCr Hsd (Nod.Scid)</td>
			<td>Envigo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV pCM109 EFS Cre sg APC sg Kras sg P53- Kras HDR</td>
			<td>Broad Institute of MIT</td>
			<td></td>
			<td>Kind gift from Dr Randall J Platt and Dr. Joseph Rosenbluh, Broad Institute of MIT and Harvard, Cambridge, MA 02142, USA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV 2/9 capsid vector</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>112865</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAD Delta F5 helper</td>
			<td>Ben Gurion University of the Negev</td>
			<td></td>
			<td>Provided by Dr Daniel Gitler, Department of Physiology and Cell Biology, Faculty of Health Sciences, and Zlotowski Center for Neuroscience, Ben-Gurion University of the Negev, Beer-Sheva 84105, Israel.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic wares</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon-ULTRA filter 100 KDa</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC910024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m sterile filters, 4 mm</td>
			<td>Millex</td>
			<td>SLGV004SL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45 &#181;m sterile filters, 13 mm</td>
			<td>Millex</td>
			<td>SLHV013SL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture plates</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro establishment of a genetically engineered murine head and neck cancer cell line using an adeno-associated virus-cas9 system

استخدام الخلايا الظهاريه العادية الاوليه يجعل من الممكن التكرار الحث علي التغييرات الجينية اللازمة للتحول الخلوي من خلال إدخال طفرات محدده في الجينات المثبطة والجينات القمعية الورم ، وذلك باستخدام متفاوت المسافات التنظيمية المتداخلة تقنيه تحرير الجينوم القائمة علي الجينات القصيرة (CRISPR) في الفئران. هذه التكنولوجيا تسمح لنا لمحاكاة بدقه التغيرات الجينية التي تحدث في السرطانات البشرية باستخدام الفئران. من خلال تحويل وراثيا الخلايا الاوليه murine ، يمكننا دراسة أفضل لتطوير السرطان ، والتقدم ، والعلاج ، والتشخيص. في هذه الدراسة ، استخدمنا Cre-المحرض كاس 9 اللسان الماوس الخلايا الظهاريه لتمكين الجينوم التحرير باستخدام الفيروسات المرتبطة adeno (AAV) في المختبر. علي وجه التحديد ، عن طريق تغيير KRAS ، p53 ، و APC في الخلايا الظهاريه اللسان العادية ، ونحن ولدت الراس والرقبة murine السرطان (HNC) خط الخلية في المختبر ، والذي هو توموريغينيك في الفئران المتزامنة. تصف الطريقة المعروضة هنا بالتفصيل كيفيه توليد الخطوط الخلوية HNC مع التعديلات الجينية محدده ويشرح ملاءمتها للتنبؤ تطور الورم في الفئران المتزامنة. ونحن نتصور ان هذه الطريقة الواعدة ستكون مفيده لدراسة البيولوجيا السرطانية والعلاج من HNC.

استخدام نظام AAV لتحويل خلايا كاس 9 العادية ويقدم الشكل 1 خريطة مفصله لناقلات البلازما المستخدمة في هذه الدراسة. ويبين الشكل 2 تصميم وعمل النظام القائم علي كاس 9. ولإنتاج جزيئات فيروسية ، تم تحويل الخلايا HEK293T إلى ناقلات الجينات ال?...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Establishment of a Genetically Engineered Murine Head and Neck Cancer Cell Line using an Adeno-Associated Virus-Cas9 System at JoVE.com

In Vitro Establishment of a Genetically Engineered Murine Head and Neck Cancer Cell Line using an Adeno-Associated Virus-Cas9 System

مطلوب تطوير نماذج murine مع جينات محدده تحور في مرضي سرطان الراس والرقبة لفهم الأورام. هنا ، ونحن نقدم بروتوكول للتحول في المختبر من خلايا اللسان الاوليه murine باستخدام نظام الفيروسات المرتبطة adeno-كاس 9 لتوليد murine الخلايا HNC خطوط مع التعديلات الجينية محدده.

في المختبر إنشاء خط الخلايا السرطانية للراس والرقبة المهندسة جينيا باستخدام نظام كاس 9 الفيروسات المرتبطة Adeno

The use of primary normal epithelial cells makes it possible to reproducibly induce genomic alterations required for cellular transformation by ...

وقد مكّن هذا البروتوكول من تطوير نماذج لسرطان الرأس والرقبة مع عملية جينومية محددة، مما أثر بشكل كبير على فهمنا لدور الطفرات الجينية المحددة في عملية الأورام. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي السهولة التي يمكن تطوير خط الخلية من أي جهاز تقريبا. إثبات الإجراء سيكون مانو براساد طالب غراد من مختبري.تبدأ باستخدام مقص الجراحية لحصاد اللسان من ستة أسابيع من العمر الذكور أو الإناث B6 الفأر المعدلة وراثيا. استخدام مشرط ل mince الأنسجة إلى شظايا صغيرة جدا وجمع القطع في أنبوب 15 ملليلتر التي تحتوي على 4.5 ملليلتر من 111000000 1000 1000 1000 1000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 إضافة 200 ميكرولترات من مزيج انزيم الثلاثي إلى أنبوب واحتضان العينة في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة التنصت على الأنبوب كل 10 دقائق لتعزيز تفكك الأنزيمية من الأنسجة.في نهاية الحضانة، ووقف التفاعل مع 5٪ FBS في برنامج تلفزيوني وتصفية تعليق الخلية من خلال مصفاة شبكة متر 70 ميكرو لفصل الخلايا من شظايا الأنسجة أكبر. جمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي وإعادة تعليق بيليه في ثلاثة ملليلتر من المتوسط الكامل. ثم قم بلوحة الخلايا في ثلاثة ملليلترات من المتوسط الكامل لكل طبق 16 ملليمتر.نقل مجاميع الخلية الاحتفاظ بها على رأس المرشح إلى طبق ثقافة منفصلة 16 ملليمتر وإضافة ثلاثة ملليلتر من المتوسط الكامل. حافظ على كل من الأطباق في الحاضنة حتى تتشكل مستعمرات الخلايا المتميزة. بعد أسبوع واحد من الثقافة، فحص مجهري الثقافات الخلية الأولية لوجود التلوث الليفي، وعلاج الخلايا مع 25٪ التربسين في EDTA 02٪في 37 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة، وإزالة أي الخلايا الليفية.في اليوم 10 من الثقافة استخدام 25٪ التربسين في 02٪ EDTA لمدة ثلاث إلى خمس دقائق في 37 درجة مئوية لحصاد الخلايا من خلية تعليق أو الخلايا الثقافات الكلية ونرى مرتين 10 إلى الخلايا الأولية الخامسة في مليلترين المتوسطة في بئر في كل بئر من لوحة 6-جيدا. في اليوم التالي تحويل الخلايا مع مرة واحدة 10 إلى 12 الجينوم الفيروسي لكل ملليلتر واحتضان الخلايا في المتوسطة المحتوية على الجسيمات الفيروسية لمدة 48 ساعة في 37 درجة مئوية. في نهاية الحضانة، استبدال عظمى الثقافة مع مليلتر اثنين من المتوسطة كاملة جديدة في البئر وإعادة الخلايا إلى حاضنة ثقافة الخلية.بعد أسبوعين من التوسع في الثقافة، بذور الخلايا للتحقق من صحة وفي التجارب ورمويجيني في الجسم الحي. باستخدام AAV CAS9 ناقلات، مرة واحدة 10 إلى 12 الجينوم الفيروسي لكل ملليلتر من الفيروس وقد تم تحديد لتحويل بكفاءة خلايا الميث الأولية إلى خرائط الأورام باستخدام البروتوكول كما هو موضح. الخلايا العابرة اكسبرس كري، CAS9 وبروتين الفلورسنت الأخضر.حقن خمس مرات 10 إلى الخرائط AAV الأولية الخامسة التي تم تحويلها إلى اللسان والشفة والجلد من الفئران NOD SCID ، يؤدي إلى تكوين الورم في هذه الحيوانات على عكس حقن الخرائط الأولية ، والتي لا تحفز الأورام. يمكن تأكيد التحول الأورام من الخلايا الظهارية الرئيسية اللسان باستخدام immunofluorescence وغرب النشاف. يؤكد التحليل الجينومي عن طريق التسلسل العميق للحمض النووي ، المعزول عن الخلايا المتحولة ، تحرير الجينات الفعالة وshiftshift من بروتين الورم 53 والجينات APC من قبل نظام AAV CAS9.بالإضافة إلى ذلك ، فإن خلايا اللسان المحولة تشكل بشكل فعال الأورام في النوع البري C57 الأسود ستة الفئران. يكشف التحليل المناعي الرثولوجي للخلايا السرطانية النائية عن التعبير السيتوبلازمي لـ E-Cadherin و Keratin 14 ، وكلاهما علامات الأنسجة الظهارية. عند محاولة هذا الإجراء، تذكر دائما أن الكثير من الالغام أو الكثير من التفاعل الأنزيمي يؤدي إلى انخفاض صلاحية الخلايا، مما يؤدي إلى انخفاض كفاءة معاملة الفيروس.باستخدام هذا الإجراء، يمكن تعديل خطوط الخلايا وراثيا للحصول على نظرة ثاقبة إمكانات الأورام والنابث للخلايا السرطانية من أي نسيج الفائدة.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Model for Perineural Invasion in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

نموذج للمحيط بالعصب الغزو في الرأس والرقبة قشري سرطان الخلايا

Perineural invasion (PNI) is found in approximately 40% of head and neck squamous cell carcinomas (HNSCC). Despite multimodal treatment with surgery, ...

Four-color Fluorescence Immunohistochemistry of T-cell Subpopulations in Archival Formalin-fixed, Paraffin-embedded Human Oropharyngeal Squamous Cell Carcinoma Samples

أربعة ألوان مضان المناعية من الخلايا السكانية الفرعية T- خلية في الأرشيفية الفورمالين ثابتة، جزءا لا يتجزأ من البارافين الإنسان البلعوم الخلايا الحرشفية سرطان الخلايا العينات

The four-color fluorescence immunohistochemistry (IHC) technique is a method to quantify cell populations of interest while taking into account their ...

A Genetically Engineered Mouse Model of Sporadic Colorectal Cancer

نموذج الفأر المهندسة وراثيا لسرطان القولون والمستقيم المتفرقة

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, colorectal cancer mouse models based on tumor cell injection have severe limitations ...

The Establishment of a Lung Colonization Assay for Circulating Tumor Cell Visualization in Lung Tissues

إنشاء مقايسة الاستعمار الرئة لتعميم التصور خلية الورم في أنسجة الرئة

Metastasis is the major cause of cancer death. The role of circulating tumor cells (CTCs) in promoting cancer metastasis, in which lung colonization by ...

Therapy Testing in a Spheroid-based 3D Cell Culture Model for Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

اختبار في نموذج ثقافة خلية 3D على أساس كروي للرأس والرقبة الحرشفية خلية العلاج

Current treatment options for advanced and recurrent head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) enclose radiation and chemo-radiation approaches with ...

Enrichment and Characterization of the Tumor Immune and Non-immune Microenvironments in Established Subcutaneous Murine Tumors

تخصيب اليورانيوم وتوصيف ميكرونفيرونمينتس المناعي والمناعة غير ورم في المنشأة الأورام مورين تحت الجلد

The tumor immune microenvironment (TIME) has recently been recognized as a critical mediator of treatment response in solid tumors, especially for ...

Live Cell Imaging of the TGF-	&beta;/Smad3 Signaling Pathway In Vitro and In Vivo Using an Adenovirus Reporter System

Live Cell Imaging of the TGF-	ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²/Smad3 Signaling Pathway In Vitro and In Vivo Using an Adenovirus Reporter System

يعيش خلية تصوير TGF-β/Smad3 مما يشير إلى المسار في المختبر و في فيفو باستخدام نظام مراسل إتش

Transforming Growth Factor &#946; (TGF-&#946;) signaling regulates many important functions required for cellular homeostasis and is commonly found ...

Assessing Cell Viability and Death in 3D Spheroid Cultures of Cancer Cells

تقييم صلاحية الخلية والموت في الثقافات الكروية ثلاثية الأبعاد للخلايا السرطانية

Three-dimensional spheroids of cancer cells are important tools for both cancer drug screens and for gaining mechanistic insight into cancer cell biology. ...

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

إنشاء نماذج Xenograft المستمدة من سرطان المعدة وخطوط الخلايا الأولية

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

In Vitro Assay to Study Tumor-macrophage Interaction

في المختبر الاختبار لدراسة التفاعل الورم الضامة

Tumor associated macrophages (TAMs) account for a large percentage of cells in the tumor mass for different types of cancers. Glioblastoma (GBM), a ...