Name: in vitro establishment of a genetically engineered murine head and neck cancer cell line using an adeno-associated virus-cas9 system
Uploaded: 2020-01-09T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Establishment of a Genetically Engineered Murine Head and Neck Cancer Cell Line using an Adeno-Associated Virus-Cas9 System at JoVE.com

Wir danken Dr. Daniel Gitler für die Bereitstellung des pAd Delta 5 Helper Plasmids. Diese Arbeit wurde von der Israel Science Foundation (ISF, 700/16) (to ME), der United States-Israel Binational Science Foundation (BSF, 2017323) (an ME und MS), der Israel Cancer Association (ICA, 20170024) (to ME), der Israel Cancer Research Foundation (ICRF, 17-1693-RCDA) (to ME) und der Foundation Concern (#7895) (ME) (ME) (an ME) finanziert. Stipendium: das Alon-Stipendium für ME- und BGU Kreitman-Stipendien an SJ und MP.

Diese Studie wurde von der Ben Gurion University of the Negev Animal Care and Use Committee genehmigt. Tierversuche wurden von der IACUC genehmigt (IL.80-12-2015 und IL.29-05-2018(E)). Alle Aspekte von Tierversuchen, -unterkünften und Umweltbedingungen, die in dieser Studie verwendet wurden, entsprachen dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren13.
1. Adeno-assoziierte Virusproduktion
<ol><li>Tag 1: Zellkultur<ol>
<li>Samen 4 x 106 HEK293...

<ol>
	<li>Reyes-Gibby, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+association+study+identifies+genes+associated+with+neuropathy+in+patients+with+head+and+neck+cancer.">Genome-wide association study identifies genes associated with neuropathy in patients with head and neck cancer.</a> Scientific Reports. 8 (1), 8789 (2018).</li><li>Riaz, N., Morris, L. G., Lee, W., Chan, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unraveling+the+molecular+genetics+of+head+and+neck+cancer+through+genome-wide+approaches.">Unraveling the molecular genetics of head and neck cancer through genome-wide approaches.</a> Genes &amp; Diseases. 1 (1), 75 (2014).</li><li>Leemans, C. R., Snijders, P. J. F., Brakenhoff, R. 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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+AAV+vectors+for+widespread+and+targeted+gene+delivery+in+rodents.">Systemic AAV vectors for widespread and targeted gene delivery in rodents.</a> Nature Protocols. 14 (2), 379-414 (2019).</li><li>Rabinowitz, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-packaging+of+a+single+adeno-associated+virus+(AAV)+type+2+vector+genome+into+multiple+AAV+serotypes+enables+transduction+with+broad+specificity.">Cross-packaging of a single adeno-associated virus (AAV) type 2 vector genome into multiple AAV serotypes enables transduction with broad specificity.</a> Journal of Virology. 76 (2), 791-801 (2002).</li><li>Cheng, D. 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(64), e3854 (2012).</li><li>Boehm, J. S., Hession, M. T., Bulmer, S. E., Hahn, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+Human+and+Murine+Fibroblasts+without+Viral+Oncoproteins.">Transformation of Human and Murine Fibroblasts without Viral Oncoproteins.</a> Molecular and Cellular Biology. 25 (15), 6464 (2005).</li><li>Gupta, T., S&#225;enz Robles, T. M., Pipas, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+transformation+of+mouse+embryo+fibroblasts+in+the+absence+of+activator+E2Fs.">Cellular transformation of mouse embryo fibroblasts in the absence of activator E2Fs.</a> Journal of Virology. 89 (9), 5124-5133 (2015).</li><li>Leong, H., Blewitt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrovirus+Mediated+Malignant+Transformation+of+Mouse+Embryonic+Fibroblasts.">Retrovirus Mediated Malignant Transformation of Mouse Embryonic Fibroblasts.</a> BIO-PROTOCOL. 3 (15), (2013).</li><li>Parikh, N., Nagarajan, P., Sei-ichi, M., Sinha, S., Garrett-Sinha, L. 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F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+of+mouse+oral+carcinoma+cell+lines+derived+from+transgenic+mice+and+their+use+as+syngeneic+tumorigenesis+models.">Establishing of mouse oral carcinoma cell lines derived from transgenic mice and their use as syngeneic tumorigenesis models.</a> BMC Cancer. 19 (1), 281 (2019).</li><li>Hoover, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Human+Papillomavirus+16+E6+in+Anchorage-Independent+and+Invasive+Growth+of+Mouse+Tonsil+Epithelium.">The Role of Human Papillomavirus 16 E6 in Anchorage-Independent and Invasive Growth of Mouse Tonsil Epithelium.</a> Archives of Otolaryngology-Head &amp; Neck Surgery. 133 (5), 495 (2007).</li><li>Smahel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metastatic+MHC+class+I-negative+mouse+cells+derived+by+transformation+with+human+papillomavirus+type+16.">Metastatic MHC class I-negative mouse cells derived by transformation with human papillomavirus type 16.</a> British Journal of Cancer. 84 (3), 374-380 (2001).</li><li>He, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+Growth+of+a+Newly+Established+Mouse+Epithelial+Cell+Line+Transformed+with+HPV-16+E7+in+Diabetic+Mice.">Increased Growth of a Newly Established Mouse Epithelial Cell Line Transformed with HPV-16 E7 in Diabetic Mice.</a> PloS One. 11 (10), e0164490 (2016).</li></ol>

Mehrere Methoden wurden zuvor verwendet, um primäre Zellen in Kultur mit variablen Erfolgsgraden25,26,27,28zu transformieren. Die meisten dieser Methoden verwenden Maus-Fibroblastenzellen für die Transformation14,17,18,19 oder verwenden Karzinogene wie 4-Nitrochinol...

HNC ist eine häufige Bösartigkeit weltweit1. Die Modellierung der Entstehung der HNC Neoplasie befindet sich derzeit an einem wissenschaftlichen Wendepunkt2. Während viele genetische Mutationen in HNC2,3,4 (z. B. TP53, PIK3CA, NOTCH1, FAT1 und RAS) identifiziert wurden, bleiben die spezifischen Kombinationen genomischer Veränderungen, die zusammen erforderlich sind, um HNC zu induzieren, unklar.
Die aktuelle Verwendung menschlicher HNC-Zelllinien hat wesentlich dazu beigetragen, die Mechanismen im Zusammenhang mit Pathogenese und Behandlung zu klären3. Die Untersuchung menschlicher Zelllinien in immungeschwächten murinen Systemen hat jedoch ihre Grenzen, da diese Systeme den in vivo neoplastischen Prozess, die Rolle spezifischer Genmutationen und Behandlungsreaktionen in einer Immunmikroumgebung nicht behandeln. Daher ist die Entwicklung und Etablierung von murinen Zelllinien mit spezifischen genetischen Veränderungen von vorrangiger Bedeutung, um zu untersuchen, wie verschiedene Gene zum Transformationsprozess beitragen, und um neuartige molekülbasierte Therapien an immunkompetenten Mäusen zu testen.
Genfunktionsstudien in der biomedizinischen Forschung wurden durch Fortschritte in der DNA-Editing-Technologien erheblich beeinflusst, indem beispielsweise Doppelstrangbrüche (DSBs) eingeführt wurden, zum Beispiel5. Diese Technologien, einschließlich der Verwendung von Zinkfingernukleasen, Transkriptionsaktivator-ähnlichen Effektornukleasen und gruppierten regulatorischen interspaceierten kurzen palindromischen Wiederholungen (CRISPR/Cas9), ermöglichen die Manipulation jedes Gens, das an seinem Ort von Interesse ist. Die neuesten CRISPR/Cas9-Systeme bestehen aus einer Guide-RNA (gRNA), die die Cas9-Nuklease anweist, um ein DSB an einem bestimmten Standort im Genom zu erzeugen. Dieses System hat eine umfassende Anerkennung bei der Modifizieren endogener Gene in jeder Zelle oder Zielgewebe gewonnen, selbst in den traditionell schwer zu behandelnden Organismen5. Es hat mehrere Vorteile gegenüber anderen Systemen aufgrund seiner Einfachheit, Geschwindigkeit und Effizienz.
In der Onkologie hat die CRISPR/CAS9-Technologie die Notwendigkeit erfüllt, Krebszellen effektiv zu imitieren. Um dieses System im HNC zu etablieren, haben wir das potente KRAS-Onkogen und zwei wichtige Tumorsuppressorgene, APC und p536,manipuliert. Laut der GENIE-Datenbank7ist diese Kombination im HNC selten. RAS-Mutationen (HRAS, NRAS und KRAS) sind nur in 7 % aller HNC-Populationen vorhanden. Diese Tumoren neigen dazu, resistent gegen Therapie8,9.
Die Lieferung von Cas9 und seiner gRNA erfolgt durch virale Transduktion mit AAVs oder Lentiviren. Rekombinantes AAV ist oft die bevorzugte Methode zur Bereitstellung von Genen an Zielzellen aufgrund seiner hohen Titer, milde Immunantwort, Fähigkeit, eine breite Palette von Zellen zu transduzieren, und allgemeine Sicherheit. Mit Hilfe eines AAV-Systems wurden verschiedene gewebespezifische Mauszelllinien generiert, und neue Zelllinien werden noch entwickelt10,11,12. Es muss jedoch noch ein effizientes genomisches Bearbeitungssystem entwickelt werden, das murine HNC-Zelllinienmodelle erzeugen kann. In dieser Studie versuchten wir, ein in vitro AAV-Cas9-basiertes System zur Umwandlung von primären murinen Zungenzellen in einen tumorgenen Zustand zu entwickeln. Dieses einzigartige CRISPR/Cas9-Transformationsprotokoll und die etablierte Tumorzelllinie können verwendet werden, um die Biologie von HNC, die durch eine Vielzahl von genomischen Veränderungen induziert wird, besser zu verstehen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti mouse HRP</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>115-035-146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti rabbit HRP</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>711-035-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cas9 Mouse mAb</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>14697</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cre</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>900901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3-AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>115-165-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy-AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>111-165-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-9996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>4370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit monoclonal anti E cadherin</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>3195S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit monoclonal anti-KRT 14</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB-ab181595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946; actin</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>691001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946; catenin</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9582S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell lines</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK93T</td>
			<td>ATCC</td>
			<td><a href="https://www.atcc.org/en/Products/All/CRL-3216.aspx" target="_blank">CRL-3216</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture Media, Chemicals and Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford Reagent</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>30015484</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0332-TAM-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI fluoromount</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>0100-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd.</td>
			<td>01-055-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL (Westar Supernova and Westar Nova 2.0)</td>
			<td>Cyanagen</td>
			<td>XLS3.0100 and XLS071.0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd.</td>
			<td>04-127-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H6648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin - Agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H6508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolate II Genomic DNA Kit</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-52066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Panreac AppliChem</td>
			<td>300283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Bio Lab Ltd</td>
			<td>1903059100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd.</td>
			<td>02-023-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEI</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>23966-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen Strep Solution</td>
			<td>Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd.</td>
			<td>03-031-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>30525-89-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatase inhibitor cocktail</td>
			<td>Biotool</td>
			<td>B15001A/B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>P2714-1BTL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris buffer</td>
			<td>MERCK Millipore</td>
			<td>648311-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enzymes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E1014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase IV</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17104019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>18047019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>H3506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd.</td>
			<td>03-050-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass wares</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover slips</td>
			<td>Bar Naor</td>
			<td>BNCB00130RA1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides</td>
			<td>Bar Naor</td>
			<td>BN9308C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse strains</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6</td>
			<td>Envigo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6;129-Gt(ROSA)26Sortm1(CAG-cas9*,-EGFP)Fezh/J</td>
			<td>Jackson labs</td>
			<td>24857</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOD.CB17-Prkdc-scid/NCr Hsd (Nod.Scid)</td>
			<td>Envigo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV pCM109 EFS Cre sg APC sg Kras sg P53- Kras HDR</td>
			<td>Broad Institute of MIT</td>
			<td></td>
			<td>Kind gift from Dr Randall J Platt and Dr. Joseph Rosenbluh, Broad Institute of MIT and Harvard, Cambridge, MA 02142, USA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV 2/9 capsid vector</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>112865</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAD Delta F5 helper</td>
			<td>Ben Gurion University of the Negev</td>
			<td></td>
			<td>Provided by Dr Daniel Gitler, Department of Physiology and Cell Biology, Faculty of Health Sciences, and Zlotowski Center for Neuroscience, Ben-Gurion University of the Negev, Beer-Sheva 84105, Israel.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic wares</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon-ULTRA filter 100 KDa</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC910024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m sterile filters, 4 mm</td>
			<td>Millex</td>
			<td>SLGV004SL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45 &#181;m sterile filters, 13 mm</td>
			<td>Millex</td>
			<td>SLHV013SL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture plates</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro establishment of a genetically engineered murine head and neck cancer cell line using an adeno-associated virus-cas9 system

Die Verwendung von primären normalen Epithelzellen ermöglicht es, genomische Veränderungen, die für die zelluläre Transformation erforderlich sind, reproduzierbar zu induzieren, indem spezifische Mutationen in Onkogene und Tumorsuppressor-Gene eingeführt werden, indem clustered regulatory interspaced kurze palindromische Wiederholung (CRISPR)-basierte Genom-Editing-Technologie bei Mäusen. Diese Technologie ermöglicht es uns, die genetischen Veränderungen, die bei menschlichen Krebserkrankungen auftreten, mit Mäusen genau nachzuahmen. Durch die genetische Umwandlung muriner Primärzellen können wir die Entwicklung von Krebs, progression, Behandlung und Diagnose besser untersuchen. In dieser Studie verwendeten wir creinduzible Cas9-Maus-Zungenepithelzellen, um die Genombearbeitung mit Adeno-assoziiertem Virus (AAV) in vitro zu ermöglichen. Insbesondere durch veränderung von KRAS, p53 und APC in normalen Zungenepithelzellen, erzeugten wir eine murine Kopf- und Halskrebs-Zelllinie (HNC) in vitro, die bei syngenischen Mäusen tumoriogen ist. Die hier vorgestellte Methode beschreibt detailliert, wie MAN HNC-Zelllinien mit spezifischen genomischen Veränderungen erzeugt und erklärt ihre Eignung zur Vorhersage der Tumorprogression bei syngenischen Mäusen. Wir stellen uns vor, dass diese vielversprechende Methode informativ und nützlich sein wird, um Tumorbiologie und Therapie von HNC zu studieren.

Verwenden des AAV-Systems zum Transformieren normaler Cas9-Zellen Abbildung 1 enthält eine detaillierte Vektorkarte des in dieser Studie verwendeten Transgenplasmids AAV. Abbildung 2 zeigt das Design und die Funktionsweise des AAV-Cas9-basierten Systems. Um virale Partikel zu produzieren, wurden die HEK293T-Zellen mit dem AAV-Transgenvektor und anderen viralen Verpackungsvektoren mit der PEI-Transfektionsmeth...

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In Vitro Establishment of a Genetically Engineered Murine Head and Neck Cancer Cell Line using an Adeno-Associated Virus-Cas9 System

Für das Verständnis von Neoplasie ist die Entwicklung von murinen Modellen mit spezifischen Genen erforderlich, die bei Kopf- und Nackenkrebspatienten mutiert sind. Hier stellen wir ein Protokoll zur In-vitro-Transformation von primären murinen Zungenzellen unter Verwendung eines adeno-assoziierten Virus-Cas9-Systems vor, um murine HNC-Zelllinien mit spezifischen genomischen Veränderungen zu erzeugen.

In Vitro Einrichtung einer gentechnisch veränderten Murine Kopf- und Halskrebszelllinie mit einem Adeno-assoziierten Virus-Cas9-System

The use of primary normal epithelial cells makes it possible to reproducibly induce genomic alterations required for cellular transformation by ...

Dieses Protokoll ermöglichte die Entwicklung von Kopf- und Halskrebsmodellen mit spezifischer genomischer Operation, was unser Verständnis der Rolle spezifischer Genmutationen im Prozess der Neoplasie erheblich beeinflusste. Der Hauptvorteil dieser Technik ist die Leichtigkeit, mit der die Zelllinie aus praktisch jedem Organ entwickelt werden kann. Demonstrieren das Verfahren wird Manu Prasad ein Grad Student aus meinem Labor sein.Beginnen Sie mit einer chirurgischen Schere, um die Zunge von einer sechs Wochen alten männlichen oder weiblichen B6-Transgenmaus zu ernten. Verwenden Sie ein Skalpell, um das Gewebe in sehr kleine Fragmente zu zerkleinern und die Stücke in ein 15-Milliliter-Rohr mit 4,5 Milliliter n.R. RUM ohne Serum zu sammeln. Fügen Sie 200 Mikroliter dreifachen Enzymmix in die Röhre und inkubieren Sie die Probe bei 37 Grad Celsius für 30 Minuten tippen Sie auf die Röhre alle 10 Minuten, um die enzymatische Dissoziation des Gewebes zu verbessern.Beenden Sie am Ende der Inkubation die Reaktion mit 5%FBS in PBS und filtern Sie die Zellsuspension durch ein 70 Mikrometer Maschensieb, um die Zellen von den größeren Gewebefragmenten zu trennen. Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation und setzen Sie das Pellet in drei Millilitern des gesamten Mediums wieder auf. Dann die Zellen in drei Milliliter komplettes Medium pro 16 Millimeter Schale auffüllen.Übertragen Sie Zellaggregate, die auf dem Filter zurückgehalten werden, auf eine separate 16-Millimeter-Kulturschale und fügen Sie drei Milliliter komplettes Medium hinzu. Halten Sie beide Gerichte im Brutkasten, bis sich verschiedene Zellkolonien bilden. Nach einer Woche Kultur, mikroskopisch untersuchen die primären Zellkulturen auf das Vorhandensein von Fibroblasten Kontamination, Behandlung der Zellen mit 25%Trypsin in 02%EDTA bei 37 Grad Celsius für eine Minute, und entfernen Sie alle Fibroblasten.Am Tag 10 der Kultur verwenden Sie 25%Trypsin in 02%EDTA für drei bis fünf Minuten bei 37 Grad Celsius, um die Zellen aus der Zellsuspension oder Zellaggregatkulturen zu ernten und zwei mal 10 bis fünf primäre Zellen in zwei Millilitern Medium pro Brunnen in jeden Brunnen der 6-Well-Platte zu sehen. Am nächsten Tag transducieren sie die Zellen mit einem Mal 10 zum 12 viralen Genom pro Milliliter und inkubieren die Zellen im viralen partikelhaltigen Medium für 48 Stunden bei 37 Grad Celsius. Am Ende der Inkubation die Kulturüberstandmittel durch zwei Milliliter frisches komplettes Medium pro Brunnen ersetzen und die Zellen an den Zellkultur-Inkubator zurückgeben.Nach zwei Wochen Kulturerweiterung, Samen die Zellen für die Validierung und in vivo tumorigenic Experimente. Mit Dem AAV CAS9-Vektor wurden ein mal 10 bis die 12 viralen Genome pro Milliliter Virus bestimmt, um primäre Meth-Zellen mithilfe des protokolls effizient in tumorgene Karten umzuwandeln. Die transduzierten Zellen Express Cre, CAS9 und Green Fluorescent Protein.Die Injektion von fünf mal 10 in die fünfte primäre AAV-transduzierte Karten in die Zunge, Lippe und Haut von NOD SCID Mäusen, führt zu Tumorbildung bei diesen Tieren im Gegensatz zur Injektion von primärkarten, die keine Tumoren induzieren. Die tumorgene Transformation von primären Zungenepithelzellen kann durch Immunfluoreszenz und Western-Blotting bestätigt werden. Die Genomanalyse durch tiefe Sequenzierung der DNA, die aus den transformierten Zellen isoliert wird, bestätigt die effektive Genbearbeitung und Frameverschiebung der Tumorproteine 53 und APC-Gene durch das AAV CAS9-System.Darüber hinaus bilden die transformierten Zungenzellen effizient Tumore in wilden Typ C57 schwarz sechs Mäuse. Die immunhistochemische Analyse der neoplastischen Tumorzellen zeigt die zytoplasmatische Expression von E-Cadherin und Keratin 14, beides Epithelgewebemarker. Denken Sie beim Versuch dieses Verfahrens immer daran, dass zu viel Hacken oder zu viel enzymatische Reaktion zu einer verminderten Lebensfähigkeit der Zellen führen, was zu einer verringerten Effizienz der Virustransaktion führt.Mit diesem Verfahren können die Zelllinien genetisch verändert werden, um Einblicke in das tumorgene und metastasierende Potenzial von Krebszellen aus jedem Gewebe von Interesse zu gewinnen.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Model for Perineural Invasion in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

Ein Modell für Perineurale Invasion in Kopf- und Hals-Plattenepithelkarzinom

Perineural invasion (PNI) is found in approximately 40% of head and neck squamous cell carcinomas (HNSCC). Despite multimodal treatment with surgery, ...

Forschung

Krebsforschung

Four-color Fluorescence Immunohistochemistry of T-cell Subpopulations in Archival Formalin-fixed, Paraffin-embedded Human Oropharyngeal Squamous Cell Carcinoma Samples

Vier-Farb-Fluoreszenz-Immunhistochemie von T-Zell-Subpopulationen im Archiv Formalin-fixierte, Paraffin-eingebettete menschliche Oropharynx-Plattenepithelkarzinom-Proben

The four-color fluorescence immunohistochemistry (IHC) technique is a method to quantify cell populations of interest while taking into account their ...

A Genetically Engineered Mouse Model of Sporadic Colorectal Cancer

Ein genetisch manipuliertes Mausmodell des sporadischen Darmkrebses

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, colorectal cancer mouse models based on tumor cell injection have severe limitations ...

The Establishment of a Lung Colonization Assay for Circulating Tumor Cell Visualization in Lung Tissues

Die Einrichtung eines Lunge Kolonisation Assays für zirkulierenden Tumor Zelle Visualisierung im Lungengewebe

Metastasis is the major cause of cancer death. The role of circulating tumor cells (CTCs) in promoting cancer metastasis, in which lung colonization by ...

Therapy Testing in a Spheroid-based 3D Cell Culture Model for Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

Therapie, die Tests in einem Sphäroid-basierten 3D Kultur Zellmodell für Kopf und Hals Squamous Zelle Krebsgeschwür

Current treatment options for advanced and recurrent head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) enclose radiation and chemo-radiation approaches with ...

Enrichment and Characterization of the Tumor Immune and Non-immune Microenvironments in Established Subcutaneous Murine Tumors

Bereicherung und Charakterisierung von dem Tumor immun und nicht-immunen Mikroumgebungen in etablierte subkutane murinen Tumoren

The tumor immune microenvironment (TIME) has recently been recognized as a critical mediator of treatment response in solid tumors, especially for ...

Live Cell Imaging of the TGF-	&beta;/Smad3 Signaling Pathway In Vitro and In Vivo Using an Adenovirus Reporter System

Live Cell Imaging of the TGF-	ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²/Smad3 Signaling Pathway In Vitro and In Vivo Using an Adenovirus Reporter System

Live Cell Imaging der TGF-β/Smad3 Signalisierung Pathway In Vitro und In Vivo mit einem Adenovirus-Reporter-System

Transforming Growth Factor &#946; (TGF-&#946;) signaling regulates many important functions required for cellular homeostasis and is commonly found ...

Assessing Cell Viability and Death in 3D Spheroid Cultures of Cancer Cells

Beurteilung der Zelllebensfähigkeit und des Todes in 3D-Sphäroidkulturen von Krebszellen

Three-dimensional spheroids of cancer cells are important tools for both cancer drug screens and for gaining mechanistic insight into cancer cell biology. ...

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

Etablierung von vom Magenkrebs abgeleiteten Xenograft-Modellen und Primärzelllinien

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

In Vitro Assay to Study Tumor-macrophage Interaction

In Vitro-Assay zur Untersuchung der Tumor-Makrophage-Interaktion

Tumor associated macrophages (TAMs) account for a large percentage of cells in the tumor mass for different types of cancers. Glioblastoma (GBM), a ...