Name: in vitro establishment of a genetically engineered murine head and neck cancer cell line using an adeno-associated virus-cas9 system
Uploaded: 2020-01-09T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Establishment of a Genetically Engineered Murine Head and Neck Cancer Cell Line using an Adeno-Associated Virus-Cas9 System at JoVE.com

Desideriamo ringraziare il Dr. Daniel Gitler per averci fornito il pAd Delta 5 Helper plasmid. Questo lavoro è stato finanziato dalla Israel Science Foundation (ISF, 700/16) (per me), dalla United States-Israel Binational Science Foundation (BSF, 2017323) (per ME e MS), dalla Israel Cancer Association (ICA, 20170024) (per ME), dalla Israel Cancer Research Foundation (ICRF, 17-1693-RCDA) (per ME) e dalla Concern #7895 (ME). Fellowship: la borsa di studio Alon a ME e BGU Kreitman a SJ e MP.

Questo studio è stato approvato dall'Università Ben Gurion del Negev Animal Care and Use Committee. Gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dall'IACUC (IL.80-12-2015 e DAL.29-05-2018(E)). Tutti gli aspetti della sperimentazione animale, dell'alloggio e delle condizioni ambientali utilizzate in questo studio erano conformi alla Guida per la cura el'usodegli animali da laboratorio 13 .
1. Produzione di virus associati ad Adeno
<ol><li>Giorno 1: Coltura cell...

<ol>
	<li>Reyes-Gibby, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+association+study+identifies+genes+associated+with+neuropathy+in+patients+with+head+and+neck+cancer.">Genome-wide association study identifies genes associated with neuropathy in patients with head and neck cancer.</a> Scientific Reports. 8 (1), 8789 (2018).</li><li>Riaz, N., Morris, L. G., Lee, W., Chan, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unraveling+the+molecular+genetics+of+head+and+neck+cancer+through+genome-wide+approaches.">Unraveling the molecular genetics of head and neck cancer through genome-wide approaches.</a> Genes &amp; Diseases. 1 (1), 75 (2014).</li><li>Leemans, C. R., Snijders, P. J. F., Brakenhoff, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+landscape+of+head+and+neck+cancer.">The molecular landscape of head and neck cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 18 (5), 269-282 (2018).</li><li>Jiang, X., Ye, J., Dong, Z., Hu, S., Xiao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+genetic+alterations+and+their+impact+on+target+therapy+response+in+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma.">Novel genetic alterations and their impact on target therapy response in head and neck squamous cell carcinoma.</a> Cancer Management and Research. 11, 1321-1336 (2019).</li><li>Im, W., Moon, J., Kim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+CRISPR/Cas9+for+Gene+Editing+in+Hereditary+Movement+Disorders.">Applications of CRISPR/Cas9 for Gene Editing in Hereditary Movement Disorders.</a> Journal of Movement Disorders. 9 (3), 136-143 (2016).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+analysis+of+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma+cell+lines+and+human+tumors:+a+rational+approach+to+preclinical+model+selection.">Genomic analysis of head and neck squamous cell carcinoma cell lines and human tumors: a rational approach to preclinical model selection.</a> Molecular Cancer Research: MCR. 12 (4), 571-582 (2014).</li><li>AACR Project GENIE Consortium, T.A.P.G.. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AACR+Project+GENIE:+Powering+Precision+Medicine+through+an+International+Consortium.">AACR Project GENIE: Powering Precision Medicine through an International Consortium.</a> Cancer Discovery. 7 (8), 818-831 (2017).</li><li>Suh, Y., Amelio, I., Guerrero Urbano, T., Tavassoli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+update+on+cancer:+molecular+oncology+of+head+and+neck+cancer.">Clinical update on cancer: molecular oncology of head and neck cancer.</a> Cell Death &amp; Disease. 5 (1), e1018 (2014).</li><li>Anderson, J. A., Irish, J. C., Ngan, B. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+of+RAS+oncogene+mutation+in+head+and+neck+carcinomas.">Prevalence of RAS oncogene mutation in head and neck carcinomas.</a> The Journal of Otolaryngology. 21 (5), 321-326 (1992).</li><li>Ryals, R. C., Boye, S. L., Dinculescu, A., Hauswirth, W. W., Boye, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+transduction+efficiencies+of+unmodified+and+tyrosine+capsid+mutant+AAV+vectors+in+vitro+using+two+ocular+cell+lines.">Quantifying transduction efficiencies of unmodified and tyrosine capsid mutant AAV vectors in vitro using two ocular cell lines.</a> Molecular Vision. 17, 1090-1102 (2011).</li><li>Smith-Arica, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+Efficiency+of+Human+and+Mouse+Embryonic+Stem+Cells+Using+Adenoviral+and+Adeno-Associated+Viral+Vectors.">Infection Efficiency of Human and Mouse Embryonic Stem Cells Using Adenoviral and Adeno-Associated Viral Vectors.</a> Cloning and Stem Cells. 5 (1), 51-62 (2003).</li><li>Li, J., Xiao, X., Kenniston, T., Kudlow, J., Giannoukakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV+Vectors.">AAV Vectors.</a> Molecular Therapy. 3 (5), S174-S192 (2001).</li><li>Institute of Laboratory Animal Resources (U.S.). <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Guide for the care and use of laboratory animals. , (1996).</li><li>Platt, R. 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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+AAV+vectors+for+widespread+and+targeted+gene+delivery+in+rodents.">Systemic AAV vectors for widespread and targeted gene delivery in rodents.</a> Nature Protocols. 14 (2), 379-414 (2019).</li><li>Rabinowitz, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-packaging+of+a+single+adeno-associated+virus+(AAV)+type+2+vector+genome+into+multiple+AAV+serotypes+enables+transduction+with+broad+specificity.">Cross-packaging of a single adeno-associated virus (AAV) type 2 vector genome into multiple AAV serotypes enables transduction with broad specificity.</a> Journal of Virology. 76 (2), 791-801 (2002).</li><li>Cheng, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Memorial+Sloan+Kettering-Integrated+Mutation+Profiling+of+Actionable+Cancer+Targets+(MSK-IMPACT).">Memorial Sloan Kettering-Integrated Mutation Profiling of Actionable Cancer Targets (MSK-IMPACT).</a> The Journal of Molecular Diagnostics. 17 (3), 251-264 (2015).</li><li>Sun, H., Taneja, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Transformation+and+Tumorigenicity+Using+Mouse+Embryonic+Fibroblast+Cells.">Analysis of Transformation and Tumorigenicity Using Mouse Embryonic Fibroblast Cells.</a> Cancer Genomics and Proteomics. 383, 303-310 (2007).</li><li>Durkin, M., Qian, X., Popescu, N., Lowy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Mouse+Embryo+Fibroblasts.">Isolation of Mouse Embryo Fibroblasts.</a> BIO-PROTOCOL. 3 (18), (2013).</li><li>Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Mouse+Embryonic+Fibroblast+Cells+Suitable+for+Culturing+Human+Embryonic+and+Induced+Pluripotent+Stem+Cells.">Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (64), e3854 (2012).</li><li>Boehm, J. S., Hession, M. T., Bulmer, S. E., Hahn, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+Human+and+Murine+Fibroblasts+without+Viral+Oncoproteins.">Transformation of Human and Murine Fibroblasts without Viral Oncoproteins.</a> Molecular and Cellular Biology. 25 (15), 6464 (2005).</li><li>Gupta, T., S&#225;enz Robles, T. M., Pipas, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+transformation+of+mouse+embryo+fibroblasts+in+the+absence+of+activator+E2Fs.">Cellular transformation of mouse embryo fibroblasts in the absence of activator E2Fs.</a> Journal of Virology. 89 (9), 5124-5133 (2015).</li><li>Leong, H., Blewitt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrovirus+Mediated+Malignant+Transformation+of+Mouse+Embryonic+Fibroblasts.">Retrovirus Mediated Malignant Transformation of Mouse Embryonic Fibroblasts.</a> BIO-PROTOCOL. 3 (15), (2013).</li><li>Parikh, N., Nagarajan, P., Sei-ichi, M., Sinha, S., Garrett-Sinha, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+an+immortalized+oral+keratinocyte+cell+line+of+mouse+origin.">Isolation and characterization of an immortalized oral keratinocyte cell line of mouse origin.</a> Archives of Oral Biology. 53 (11), 1091-1100 (2008).</li><li>Badarni, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repression+of+AXL+expression+by+AP-1/JNK+blockage+overcomes+resistance+to+PI3Ka+therapy.">Repression of AXL expression by AP-1/JNK blockage overcomes resistance to PI3Ka therapy.</a> JCI Insight. 5, 125341 (2019).</li><li>Chen, Y. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+of+mouse+oral+carcinoma+cell+lines+derived+from+transgenic+mice+and+their+use+as+syngeneic+tumorigenesis+models.">Establishing of mouse oral carcinoma cell lines derived from transgenic mice and their use as syngeneic tumorigenesis models.</a> BMC Cancer. 19 (1), 281 (2019).</li><li>Hoover, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Human+Papillomavirus+16+E6+in+Anchorage-Independent+and+Invasive+Growth+of+Mouse+Tonsil+Epithelium.">The Role of Human Papillomavirus 16 E6 in Anchorage-Independent and Invasive Growth of Mouse Tonsil Epithelium.</a> Archives of Otolaryngology-Head &amp; Neck Surgery. 133 (5), 495 (2007).</li><li>Smahel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metastatic+MHC+class+I-negative+mouse+cells+derived+by+transformation+with+human+papillomavirus+type+16.">Metastatic MHC class I-negative mouse cells derived by transformation with human papillomavirus type 16.</a> British Journal of Cancer. 84 (3), 374-380 (2001).</li><li>He, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+Growth+of+a+Newly+Established+Mouse+Epithelial+Cell+Line+Transformed+with+HPV-16+E7+in+Diabetic+Mice.">Increased Growth of a Newly Established Mouse Epithelial Cell Line Transformed with HPV-16 E7 in Diabetic Mice.</a> PloS One. 11 (10), e0164490 (2016).</li></ol>

Diversi metodi sono stati precedentemente utilizzati per trasformare le cellule primarie nella coltura con gradi variabili di successo25,26,27,28. La maggior parte di questi metodi utilizza cellule fibroblaste di topi per la trasformazione14,17,18,19 o utilizzare agen...

HNC è una malignità comune in tutto il mondo1. La modellazione della genesi della neoplasia HNC è attualmente a un punto di svolta scientifica2. Mentre molte mutazioni genetiche sono state identificate nell'HNC2,3,4 (ad esempio, TP53, PIK3CA, NOTCH1, FAT1 e RAS) le combinazioni specifiche di alterazioni genomiche necessarie in concerto per indurre HNC rimangono poco chiare.
L'attuale uso di linee cellulari umane di HNC ha contribuito in modo significativo a chiarire i meccanismi associati alla patogenesi e al trattamento3. Tuttavia, lo studio delle linee cellulari umane nei sistemi murini immunocompromessi ha i suoi limiti, perché questi sistemi non affrontano il processo neoplastico in vivo, il ruolo di specifiche mutazioni genetiche e le risposte al trattamento in un microambiente immunitario. Di conseguenza, lo sviluppo e la creazione di linee cellulari murine con specifiche alterazioni genetiche sono di primaria importanza per studiare come diversi geni contribuiscono al processo di trasformazione e per testare nuove terapie basate su molecole in topi immunocompetenti.
Gli studi sulle funzioni geniche nella ricerca biomedica sono stati significativamente influenzati dai progressi nelle tecnologie di editing del DNA, introducendo interruzioni a doppio filamento (DSB), per esempio5. Queste tecnologie, tra cui l'uso di nucleasi per dita di zinco, nucleasi effettore simili all'attivatore di trascrizione e brevi ripetizioni palindromiche regolatorie raggruppate (CRISPR/Cas9), consentono la manipolazione di qualsiasi gene di interesse nel suo locus. Gli ultimi sistemi CRISPR/Cas9 sono costituiti da una guida RNA (gRNA) che dirige la nucleacanda Cas9 per generare un DSB in un sito specifico del genoma. Questo sistema ha ottenuto un ampio riconoscimento nella modifica dei geni endogeni in qualsiasi cellula o tessuto bersaglio, anche negli organismi più tradizionalmente difficili da trattare5. Ha molteplici vantaggi rispetto ad altri sistemi grazie alla sua semplicità, velocità ed efficienza.
In oncologia, la tecnologia CRISPR/CAS9 ha soddisfatto la necessità di imitare efficacemente le cellule tumorali. Per stabilire questo sistema in HNC, abbiamo manipolato il potente oncogene KRAS e due importanti geni soppressori tumorali, APC e p536. Secondo il database GENIE7, questa combinazione è rara in HNC. Le mutazioni RAS (HRAS, NRAS e KRAS) sono presenti solo nel 7% di tutte le popolazioni di HNC. Questi tumori tendono ad essere resistenti alla terapia8,9.
La consegna di Cas9 e del suo gRNA si ottiene attraverso la trasduzione virale utilizzando AAV o lentivirus. L'AAV ricombinante è spesso il metodo preferito per fornire geni alle cellule bersaglio a causa del suo alto titro, della risposta immunitaria lieve, della capacità di trasdurli di un'ampia gamma di cellule e della sicurezza generale. Utilizzando un sistema AAV, sono state generate varie linee cellulari del topo specifiche del tessuto e nuove linee cellulari sono ancora in fase di sviluppo10,11,12. Tuttavia, rimane da sviluppare un efficiente sistema di editing genomico in grado di generare murini modelli di linee cellulari HNC. In questo studio, abbiamo cercato di sviluppare un sistema in vitro basato su AAV-Cas9 per trasformare le cellule primarie della lingua murina in uno stato tumorale. Questo protocollo unico di trasformazione CRISPR/Cas9 e la linea cellulare tumorale stabilita possono essere utilizzati per comprendere meglio la biologia dell'HNC indotta da una diversità di alterazioni genomiche.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti mouse HRP</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>115-035-146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti rabbit HRP</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>711-035-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cas9 Mouse mAb</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>14697</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cre</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>900901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3-AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>115-165-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy-AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>111-165-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-9996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>4370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit monoclonal anti E cadherin</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>3195S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit monoclonal anti-KRT 14</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB-ab181595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946; actin</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>691001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946; catenin</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9582S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell lines</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK93T</td>
			<td>ATCC</td>
			<td><a href="https://www.atcc.org/en/Products/All/CRL-3216.aspx" target="_blank">CRL-3216</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture Media, Chemicals and Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford Reagent</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>30015484</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0332-TAM-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI fluoromount</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>0100-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd.</td>
			<td>01-055-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL (Westar Supernova and Westar Nova 2.0)</td>
			<td>Cyanagen</td>
			<td>XLS3.0100 and XLS071.0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd.</td>
			<td>04-127-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H6648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin - Agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H6508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolate II Genomic DNA Kit</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-52066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Panreac AppliChem</td>
			<td>300283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Bio Lab Ltd</td>
			<td>1903059100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd.</td>
			<td>02-023-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEI</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>23966-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen Strep Solution</td>
			<td>Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd.</td>
			<td>03-031-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>30525-89-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatase inhibitor cocktail</td>
			<td>Biotool</td>
			<td>B15001A/B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>P2714-1BTL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris buffer</td>
			<td>MERCK Millipore</td>
			<td>648311-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enzymes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E1014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase IV</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17104019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>18047019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>H3506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd.</td>
			<td>03-050-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass wares</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover slips</td>
			<td>Bar Naor</td>
			<td>BNCB00130RA1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides</td>
			<td>Bar Naor</td>
			<td>BN9308C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse strains</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6</td>
			<td>Envigo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6;129-Gt(ROSA)26Sortm1(CAG-cas9*,-EGFP)Fezh/J</td>
			<td>Jackson labs</td>
			<td>24857</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOD.CB17-Prkdc-scid/NCr Hsd (Nod.Scid)</td>
			<td>Envigo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV pCM109 EFS Cre sg APC sg Kras sg P53- Kras HDR</td>
			<td>Broad Institute of MIT</td>
			<td></td>
			<td>Kind gift from Dr Randall J Platt and Dr. Joseph Rosenbluh, Broad Institute of MIT and Harvard, Cambridge, MA 02142, USA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV 2/9 capsid vector</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>112865</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAD Delta F5 helper</td>
			<td>Ben Gurion University of the Negev</td>
			<td></td>
			<td>Provided by Dr Daniel Gitler, Department of Physiology and Cell Biology, Faculty of Health Sciences, and Zlotowski Center for Neuroscience, Ben-Gurion University of the Negev, Beer-Sheva 84105, Israel.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic wares</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon-ULTRA filter 100 KDa</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC910024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m sterile filters, 4 mm</td>
			<td>Millex</td>
			<td>SLGV004SL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45 &#181;m sterile filters, 13 mm</td>
			<td>Millex</td>
			<td>SLHV013SL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture plates</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro establishment of a genetically engineered murine head and neck cancer cell line using an adeno-associated virus-cas9 system

L'uso di cellule epiteliali normali primarie consente di indurre riproducibilmente alterazioni genomiche necessarie per la trasformazione cellulare introducendo mutazioni specifiche negli oncogeni e nei geni soppressori tumorali, utilizzando interspazii normativi raggruppati tecnologia di editing del genoma a breve ripetizione palindromica (CRISPR) nei topi. Questa tecnologia ci permette di imitare con precisione i cambiamenti genetici che si verificano nei tumori umani usando i topi. Trasformando geneticamente le cellule primarie del murino, possiamo studiare meglio lo sviluppo, la progressione, il trattamento e la diagnosi del cancro. In questo studio, abbiamo usato cellule epiteliali della lingua di topo Cas9 inducibili in Cre-inducibili per consentire l'editing del genoma utilizzando il virus adeno-associato (AAV) in vitro. In particolare, alterando KRAS, p53 e APC nelle normali cellule epiteliali della lingua, abbiamo generato una linea cellulare di cancro della testa e del collo murino (HNC) in vitro, che è cancerogena nei topi sinogene. Il metodo qui presentato descrive in dettaglio come generare linee cellulari HNC con specifiche alterazioni genomiche e spiega la loro idoneità per prevedere la progressione del tumore nei topi sinosgenici. Abbiamo immaginato che questo promettente metodo sarà informativo e utile per studiare la biologia del tumore e la terapia di HNC.

Utilizzo del sistema AAV per trasformare le normali celle Cas9 La figura 1 fornisce una mappa vettoriale dettagliata del plasmide transgene AAV utilizzato in questo studio. Figura 2 delinea la progettazione e il funzionamento del sistema basato AAV-Cas9. Per produrre particelle virali, le cellule HEK293T sono state trafette con il vettore transgene AAV e altri vettori di imballaggio virali utilizzando il metod...

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In Vitro Establishment of a Genetically Engineered Murine Head and Neck Cancer Cell Line using an Adeno-Associated Virus-Cas9 System

Per la comprensione della neoplasia è necessario lo sviluppo di modelli murini con geni specifici mutati nei pazienti affetti da cancro alla testa e al collo. Qui, presentiamo un protocollo per la trasformazione in vitro delle cellule primarie della lingua murina utilizzando un sistema adeno-associato al virus-Cas9 per generare linee cellulari MURine HNC con specifiche alterazioni genomiche.

In Vitro Creazione di una linea cellulare di cancro di Murine geneticamente ingegnerizzato e collo utilizzando un sistema Adeno-Associated Virus-Cas9

The use of primary normal epithelial cells makes it possible to reproducibly induce genomic alterations required for cellular transformation by ...

Questo protocollo ha permesso lo sviluppo di modelli di cancro alla testa e al collo con specifiche operazioni genomiche, influenzando significativamente la nostra comprensione del ruolo di specifiche mutazioni geniche nel processo di neoplasia. Il vantaggio principale di questa tecnica è la facilità con cui la linea cellulare può essere sviluppata praticamente da qualsiasi organo. A dimostrare la procedura sarà Manu Prasad, uno studente laureato del mio laboratorio.Inizia usando forbici chirurgiche per raccogliere la lingua da un topo transgenico B6 di sei settimane. Utilizzare un bisturi per tritare il tessuto in frammenti molto piccoli e raccogliere i pezzi in un tubo da 15 millilitri contenente 4,5 millilitri di mezzo semplice RPMI senza siero. Aggiungere 200 microlitri di miscela di tripli enzimi al tubo e incubare il campione a 37 gradi Celsius per 30 minuti toccando il tubo ogni 10 minuti per migliorare la dissociazione enzimatica del tessuto.Al termine dell'incubazione, interrompere la reazione con 5%FBS in PBS e filtrare la sospensione cellulare attraverso un colino a rete da 70 micro metri per separare le cellule dai frammenti di tessuto più grandi. Raccogliere le cellule per centrifugazione e sospendere di nuovo il pellet in tre millilitri di mezzo completo. Quindi placcare le cellule in tre millilitri di mezzo completo per piatto da 16 millimetri.Trasferire gli aggregati cellulari trattenuti sopra il filtro in un piatto di coltura separato di 16 millimetri e aggiungere tre millilitri di mezzo completo. Tenere entrambi i piatti nell'incubatrice fino a formare colonie cellulari distinte. Dopo una settimana di coltura, esaminare microscopicamente le colture cellulari primarie per la presenza di contaminazione da fibroblasti, trattando le cellule con il 25% di tripside nel 02%EDTA a 37 gradi Celsius per un minuto e rimuovere eventuali fibroblasti.Il giorno 10 della coltura utilizzare il 25% di tripsiderina nello 02%EDTA per tre o cinque minuti a 37 gradi Celsius per raccogliere le cellule dalla sospensione cellulare o colture di aggregati cellulari e vedere due volte 10 alla quinta cella primaria in due millilitri di mezzo per pozzo in ogni pozzo della piastra a 6 pozzi. Il giorno dopo trasduci le cellule con uno per 10 al genoma virale 12 per millilitro e incuba le cellule nel mezzo contenente particelle virali per 48 ore a 37 gradi Celsius. Al termine dell'incubazione, sostituire i supernaganti di coltura con due millilitri di mezzo fresco completo per pozzo e riportare le cellule all'incubatore di coltura cellulare.Dopo due settimane di espansione della coltura, seminare le cellule per la convalida e gli esperimenti tumorigeni in vivo. Utilizzando il vettore AAV CAS9, uno per 10 ai 12 genomi virali per millilitro del virus sono stati determinati per trasformare in modo efficiente le cellule di metra primaria in mappe tumorigeniche utilizzando il protocollo come dimostrato. Le cellule trasdotto Express Cre, CAS9 e Green Fluorescent Protein.L'iniezione di cinque volte 10 alla quinta mappa primaria trasdutta AAV nella lingua, nel labbro e nella pelle dei topi SCID NOD, si traduce in formazione tumorale in questi animali a differenza dell'iniezione di mappe primarie, che non inducono tumori. La trasformazione tumorigenica delle cellule epiteliali della lingua primaria può essere confermata usando l'immunofluorescenza e l'assorbimento occidentale. L'analisi genomica mediante sequenziamento profondo del DNA, isolato dalle cellule trasformate, conferma l'efficace editing genico e il frameshift della proteina tumorale 53 e dei geni APC da parte del sistema AAV CAS9.Inoltre, le cellule della lingua trasformate formano efficacemente tumori in sei topi neri di tipo C57 selvatici. L'analisi immunoistochimica delle cellule tumorali neoplastiche rivela l'espressione citoplasmatica di E-Cadherin e Cheratina 14, entrambi marcatori del tessuto epiteliale. Quando si tenta questa procedura, tenere sempre presente che un'eccessiva tritacarne o troppa reazione enzimatica porta a una ridotta vitalità delle cellule, portando a una riduzione dell'efficienza delle transazioni virali.Utilizzando questa procedura, le linee cellulari possono essere geneticamente modificate per ottenere informazioni sul potenziale tumorigenico e metastatico delle cellule tumorali da qualsiasi tessuto di interesse.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Model for Perineural Invasion in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

Un modello per perineurale Invasion in testa e del collo carcinoma a cellule squamose

Perineural invasion (PNI) is found in approximately 40% of head and neck squamous cell carcinomas (HNSCC). Despite multimodal treatment with surgery, ...

Ricerca

Ricerca sul cancro

Four-color Fluorescence Immunohistochemistry of T-cell Subpopulations in Archival Formalin-fixed, Paraffin-embedded Human Oropharyngeal Squamous Cell Carcinoma Samples

Immunohistochemia di fluorescenza a quattro colori delle sottopopolazioni delle cellule T in campioni di carcinoma a cellule squamose orofaringe umane incorporate in paraffina

The four-color fluorescence immunohistochemistry (IHC) technique is a method to quantify cell populations of interest while taking into account their ...

A Genetically Engineered Mouse Model of Sporadic Colorectal Cancer

Un modello di mouse geneticamente modificato del cancro colorettale sporadico

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, colorectal cancer mouse models based on tumor cell injection have severe limitations ...

The Establishment of a Lung Colonization Assay for Circulating Tumor Cell Visualization in Lung Tissues

L'istituzione di un'analisi di colonizzazione del polmone per la visualizzazione di cellule del tumore nei tessuti polmonari di circolazione

Metastasis is the major cause of cancer death. The role of circulating tumor cells (CTCs) in promoting cancer metastasis, in which lung colonization by ...

Therapy Testing in a Spheroid-based 3D Cell Culture Model for Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

Terapia test in un modello di coltura cellulare 3D basati su sferoide per testa e collo a cellule squamose

Current treatment options for advanced and recurrent head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) enclose radiation and chemo-radiation approaches with ...

Enrichment and Characterization of the Tumor Immune and Non-immune Microenvironments in Established Subcutaneous Murine Tumors

Arricchimento e caratterizzazione dei tumore immuni e Non immuni microambienti in tumori murini sottocutanei stabiliti

The tumor immune microenvironment (TIME) has recently been recognized as a critical mediator of treatment response in solid tumors, especially for ...

Live Cell Imaging of the TGF-	&beta;/Smad3 Signaling Pathway In Vitro and In Vivo Using an Adenovirus Reporter System

Live Cell Imaging of the TGF-	ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²/Smad3 Signaling Pathway In Vitro and In Vivo Using an Adenovirus Reporter System

Live Cell Imaging del TGF-β/Smad3 Signaling Pathway In Vitro e In Vivo utilizzando un sistema di Reporter dell'Adenovirus

Transforming Growth Factor &#946; (TGF-&#946;) signaling regulates many important functions required for cellular homeostasis and is commonly found ...

Assessing Cell Viability and Death in 3D Spheroid Cultures of Cancer Cells

Valutare la vitalità cellulare e la morte nelle colture di sferoidi 3D delle cellule tumorali

Three-dimensional spheroids of cancer cells are important tools for both cancer drug screens and for gaining mechanistic insight into cancer cell biology. ...

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

Stabilimento di modelli Xenograft derivati dal paziente derivato dal paziente e linee cellulari primarie

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

In Vitro Assay to Study Tumor-macrophage Interaction

In Vitro Analisi per studiare l'interazione tumora-macrophage

Tumor associated macrophages (TAMs) account for a large percentage of cells in the tumor mass for different types of cancers. Glioblastoma (GBM), a ...