Name: in vitro establishment of a genetically engineered murine head and neck cancer cell line using an adeno-associated virus-cas9 system
Uploaded: 2020-01-09T12:00:00
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우리는 포드 델타 5 도우미 플라스미드를 제공 해 주신 다니엘 Gitler 박사에게 감사드립니다. 이 작품은 이스라엘 과학 재단 (ISF)에 의해 지원되었다, 700/16) (ME), 미국-이스라엘 양국 과학 재단 (BSF, 2017323) (ME 및 MS), 이스라엘 암 협회 (ICA, 20170024) (ME), 이스라엘 암 연구 재단 (ICRF, 17-1693-RCDA) (ME), 그리고 우려 재단 (#7895 me). 펠로우십: 저와 BGU 크릿만과 SJ 및 MP에 대한 알론 펠로우십.

이 연구는 네게브 동물 관리 및 사용 위원회의 벤 구리온 대학에 의해 승인되었다. 동물 실험은 IACUC(IL.80-12-2015 및 IL.29-05-2018(E))에 의해 승인되었다. 이 연구에 사용된 동물 실험, 주거 및 환경 조건의 모든 측면은 실험실 동물의 관리 및 사용을 위한 가이드13을준수했다.
1. 아데노 관련 바이러스 생산
<ol><li>1일차: 세포 배양<ol>
<li>DMEM의 15 mL에서 14.5 cm 플레이...

<ol>
	<li>Reyes-Gibby, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+association+study+identifies+genes+associated+with+neuropathy+in+patients+with+head+and+neck+cancer.">Genome-wide association study identifies genes associated with neuropathy in patients with head and neck cancer.</a> Scientific Reports. 8 (1), 8789 (2018).</li><li>Riaz, N., Morris, L. G., Lee, W., Chan, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unraveling+the+molecular+genetics+of+head+and+neck+cancer+through+genome-wide+approaches.">Unraveling the molecular genetics of head and neck cancer through genome-wide approaches.</a> Genes &amp; Diseases. 1 (1), 75 (2014).</li><li>Leemans, C. R., Snijders, P. J. F., Brakenhoff, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+landscape+of+head+and+neck+cancer.">The molecular landscape of head and neck cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 18 (5), 269-282 (2018).</li><li>Jiang, X., Ye, J., Dong, Z., Hu, S., Xiao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+genetic+alterations+and+their+impact+on+target+therapy+response+in+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma.">Novel genetic alterations and their impact on target therapy response in head and neck squamous cell carcinoma.</a> Cancer Management and Research. 11, 1321-1336 (2019).</li><li>Im, W., Moon, J., Kim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+CRISPR/Cas9+for+Gene+Editing+in+Hereditary+Movement+Disorders.">Applications of CRISPR/Cas9 for Gene Editing in Hereditary Movement Disorders.</a> Journal of Movement Disorders. 9 (3), 136-143 (2016).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+analysis+of+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma+cell+lines+and+human+tumors:+a+rational+approach+to+preclinical+model+selection.">Genomic analysis of head and neck squamous cell carcinoma cell lines and human tumors: a rational approach to preclinical model selection.</a> Molecular Cancer Research: MCR. 12 (4), 571-582 (2014).</li><li>AACR Project GENIE Consortium, T.A.P.G.. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AACR+Project+GENIE:+Powering+Precision+Medicine+through+an+International+Consortium.">AACR Project GENIE: Powering Precision Medicine through an International Consortium.</a> Cancer Discovery. 7 (8), 818-831 (2017).</li><li>Suh, Y., Amelio, I., Guerrero Urbano, T., Tavassoli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+update+on+cancer:+molecular+oncology+of+head+and+neck+cancer.">Clinical update on cancer: molecular oncology of head and neck cancer.</a> Cell Death &amp; Disease. 5 (1), e1018 (2014).</li><li>Anderson, J. A., Irish, J. C., Ngan, B. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+of+RAS+oncogene+mutation+in+head+and+neck+carcinomas.">Prevalence of RAS oncogene mutation in head and neck carcinomas.</a> The Journal of Otolaryngology. 21 (5), 321-326 (1992).</li><li>Ryals, R. C., Boye, S. L., Dinculescu, A., Hauswirth, W. W., Boye, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+transduction+efficiencies+of+unmodified+and+tyrosine+capsid+mutant+AAV+vectors+in+vitro+using+two+ocular+cell+lines.">Quantifying transduction efficiencies of unmodified and tyrosine capsid mutant AAV vectors in vitro using two ocular cell lines.</a> Molecular Vision. 17, 1090-1102 (2011).</li><li>Smith-Arica, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+Efficiency+of+Human+and+Mouse+Embryonic+Stem+Cells+Using+Adenoviral+and+Adeno-Associated+Viral+Vectors.">Infection Efficiency of Human and Mouse Embryonic Stem Cells Using Adenoviral and Adeno-Associated Viral Vectors.</a> Cloning and Stem Cells. 5 (1), 51-62 (2003).</li><li>Li, J., Xiao, X., Kenniston, T., Kudlow, J., Giannoukakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV+Vectors.">AAV Vectors.</a> Molecular Therapy. 3 (5), S174-S192 (2001).</li><li>Institute of Laboratory Animal Resources (U.S.). <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Guide for the care and use of laboratory animals. , (1996).</li><li>Platt, R. 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T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Memorial+Sloan+Kettering-Integrated+Mutation+Profiling+of+Actionable+Cancer+Targets+(MSK-IMPACT).">Memorial Sloan Kettering-Integrated Mutation Profiling of Actionable Cancer Targets (MSK-IMPACT).</a> The Journal of Molecular Diagnostics. 17 (3), 251-264 (2015).</li><li>Sun, H., Taneja, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Transformation+and+Tumorigenicity+Using+Mouse+Embryonic+Fibroblast+Cells.">Analysis of Transformation and Tumorigenicity Using Mouse Embryonic Fibroblast Cells.</a> Cancer Genomics and Proteomics. 383, 303-310 (2007).</li><li>Durkin, M., Qian, X., Popescu, N., Lowy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Mouse+Embryo+Fibroblasts.">Isolation of Mouse Embryo Fibroblasts.</a> BIO-PROTOCOL. 3 (18), (2013).</li><li>Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Mouse+Embryonic+Fibroblast+Cells+Suitable+for+Culturing+Human+Embryonic+and+Induced+Pluripotent+Stem+Cells.">Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (64), e3854 (2012).</li><li>Boehm, J. S., Hession, M. T., Bulmer, S. E., Hahn, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+Human+and+Murine+Fibroblasts+without+Viral+Oncoproteins.">Transformation of Human and Murine Fibroblasts without Viral Oncoproteins.</a> Molecular and Cellular Biology. 25 (15), 6464 (2005).</li><li>Gupta, T., S&#225;enz Robles, T. M., Pipas, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+transformation+of+mouse+embryo+fibroblasts+in+the+absence+of+activator+E2Fs.">Cellular transformation of mouse embryo fibroblasts in the absence of activator E2Fs.</a> Journal of Virology. 89 (9), 5124-5133 (2015).</li><li>Leong, H., Blewitt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrovirus+Mediated+Malignant+Transformation+of+Mouse+Embryonic+Fibroblasts.">Retrovirus Mediated Malignant Transformation of Mouse Embryonic Fibroblasts.</a> BIO-PROTOCOL. 3 (15), (2013).</li><li>Parikh, N., Nagarajan, P., Sei-ichi, M., Sinha, S., Garrett-Sinha, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+an+immortalized+oral+keratinocyte+cell+line+of+mouse+origin.">Isolation and characterization of an immortalized oral keratinocyte cell line of mouse origin.</a> Archives of Oral Biology. 53 (11), 1091-1100 (2008).</li><li>Badarni, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repression+of+AXL+expression+by+AP-1/JNK+blockage+overcomes+resistance+to+PI3Ka+therapy.">Repression of AXL expression by AP-1/JNK blockage overcomes resistance to PI3Ka therapy.</a> JCI Insight. 5, 125341 (2019).</li><li>Chen, Y. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+of+mouse+oral+carcinoma+cell+lines+derived+from+transgenic+mice+and+their+use+as+syngeneic+tumorigenesis+models.">Establishing of mouse oral carcinoma cell lines derived from transgenic mice and their use as syngeneic tumorigenesis models.</a> BMC Cancer. 19 (1), 281 (2019).</li><li>Hoover, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Human+Papillomavirus+16+E6+in+Anchorage-Independent+and+Invasive+Growth+of+Mouse+Tonsil+Epithelium.">The Role of Human Papillomavirus 16 E6 in Anchorage-Independent and Invasive Growth of Mouse Tonsil Epithelium.</a> Archives of Otolaryngology-Head &amp; Neck Surgery. 133 (5), 495 (2007).</li><li>Smahel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metastatic+MHC+class+I-negative+mouse+cells+derived+by+transformation+with+human+papillomavirus+type+16.">Metastatic MHC class I-negative mouse cells derived by transformation with human papillomavirus type 16.</a> British Journal of Cancer. 84 (3), 374-380 (2001).</li><li>He, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+Growth+of+a+Newly+Established+Mouse+Epithelial+Cell+Line+Transformed+with+HPV-16+E7+in+Diabetic+Mice.">Increased Growth of a Newly Established Mouse Epithelial Cell Line Transformed with HPV-16 E7 in Diabetic Mice.</a> PloS One. 11 (10), e0164490 (2016).</li></ol>

여러 가지 방법은 이전에 성공25,26,27,28의가변 학위를 가진 배양에서 1 차 세포를 형질전환하는 데 사용되어 왔다. 이들 방법의 대부분은 마우스 섬유아세포변형14,17,18,19 또는 4-니트로퀴놀린-1-산화물(4-NQ...

HNC는전세계적으로 일반적인 악성 1입니다. HNC 신생물의 기원을 모델링하는 것은 현재 과학적 전환점2. 많은 유전 적 돌연변이가 HNC2,3,4 (예를 들어, TP53, PIK3CA, NOTCH1, FAT1 및 RAS)에서 확인되었지만 HNC를 유도하기 위해 함께 요구되는 유전체 변종의 특정 조합은 불분명하게 남아 있다.
인간 HNC 세포주의 현재 사용은 크게 병인 및 치료와 관련된 메커니즘을 해명하는 데 도움이3. 그러나, 면역 타협 된 뮤린 시스템에서 인간 세포주의 연구는 그 한계를 가지고, 이러한 시스템은 생체 내 신생물 과정, 특정 유전자 돌연변이의 역할, 및 면역 미세 환경에서 치료 반응을 해결하지 않기 때문에. 그러므로, 특정 유전 변경을 가진 murine 세포주의 발달 그리고 설치는 다른 유전자가 어떻게 다른 유전자가 변환 프로세스에 기여하는지 공부하고 면역 적격 마우스에 있는 새로운 분자 기지를 둔 치료를 시험하기 위하여 1 차적인 중요합니다.
생물 의학 연구에서 유전자 기능 연구는 DNA 편집 기술의 발전에 의해 크게 영향을 받았습니다, 이중 가닥 휴식 (DSBs)를 도입 하 여, 예를 들어5. 아연 핑거 뉴클레아제, 전사 활성제 와 같은 이펙터 뉴클레아제, 클러스터된 조절 식 간 짧은 팔린드로믹 반복(CRISPR/Cas9)의 사용을 포함한 이러한 기술은 궤적에서 관심 있는 유전자의 조작을 허용합니다. 최신 CRISPR/Cas9 시스템은 게놈의 특정 부위에서 DSB를 생성하기 위해 Cas9 뉴클레아제에게 지시하는 가이드 RNA(gRNA)로 구성됩니다. 이 시스템은 어떤 세포 또는 표적 조직에서 내인성 유전자를 수정하는 데 있어, 심지어 가장 전통적으로 치료하기 어려운 유기체에서도5. 단순성, 속도 및 효율성으로 인해 다른 시스템에 비해 여러 가지 장점이 있습니다.
종양학에서 CRISPR/CAS9 기술은 암세포를 효과적으로 모방할 필요성을 충족시켰습니다. HNC에 있는 이 시스템을 설치하기 위하여는, 우리는 강력한 KRAS 종양유전자 및 2개의 중요한 종양 억제유전자, APC 및 p536를조작했습니다. GENIE 데이터베이스7에따르면, 이 조합은 HNC에서 드물다. RAS 돌연변이 (HRAS, NRAS 및 KRAS)는 모든 HNC 인구의 단지 ~7%에서 존재합니다. 이러한 종양은 치료8,9에내성이있는 경향이있다.
Cas9 및 그 gRNA의 전달은 AAV 또는 렌티바이러스를 사용하여 바이러스 성 전달을 통해 달성된다. 재조합 AAV는 종종 그것의 높은 역가, 온화한 면역 반응, 세포의 넓은 범위를 변환 하는 능력, 그리고 전반적인 안전 으로 인해 대상 세포에 유전자를 제공 하기 위한 바람직한 방법. AAV 시스템을 사용하여 다양한 조직 특이적 마우스 세포주가 생성되고 있으며, 새로운 세포주는 여전히10,11,12로개발되고 있다. 그러나, 뮤린 HNC 세포주 모델 세포를 생성할 수 있는 효율적인 게놈 편집 시스템은 여전히 개발되고 있다. 이 연구에서, 우리는 1 차적인 뮤린 혀 세포를 종양성 상태로 변형시키기 위한 시험관 내 AAV-Cas9 기반 시스템을 개발하고자 했습니다. 이러한 독특한 CRISPR/Cas9 형질전환 프로토콜 및 확립된 종양 세포주들은 다양한 게놈 변화에 의해 유도된 HNC의 생물학을 더 잘 이해하는데 사용될 수 있다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti mouse HRP</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>115-035-146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti rabbit HRP</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>711-035-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cas9 Mouse mAb</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>14697</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cre</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>900901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3-AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>115-165-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy-AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>111-165-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-9996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>4370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit monoclonal anti E cadherin</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>3195S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit monoclonal anti-KRT 14</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB-ab181595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946; actin</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>691001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946; catenin</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9582S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell lines</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK93T</td>
			<td>ATCC</td>
			<td><a href="https://www.atcc.org/en/Products/All/CRL-3216.aspx" target="_blank">CRL-3216</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture Media, Chemicals and Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford Reagent</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>30015484</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0332-TAM-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI fluoromount</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>0100-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd.</td>
			<td>01-055-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL (Westar Supernova and Westar Nova 2.0)</td>
			<td>Cyanagen</td>
			<td>XLS3.0100 and XLS071.0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd.</td>
			<td>04-127-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H6648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin - Agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H6508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolate II Genomic DNA Kit</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-52066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Panreac AppliChem</td>
			<td>300283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Bio Lab Ltd</td>
			<td>1903059100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd.</td>
			<td>02-023-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEI</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>23966-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen Strep Solution</td>
			<td>Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd.</td>
			<td>03-031-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>30525-89-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatase inhibitor cocktail</td>
			<td>Biotool</td>
			<td>B15001A/B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>P2714-1BTL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris buffer</td>
			<td>MERCK Millipore</td>
			<td>648311-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enzymes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E1014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase IV</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17104019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>18047019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>H3506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd.</td>
			<td>03-050-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass wares</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover slips</td>
			<td>Bar Naor</td>
			<td>BNCB00130RA1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides</td>
			<td>Bar Naor</td>
			<td>BN9308C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse strains</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6</td>
			<td>Envigo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6;129-Gt(ROSA)26Sortm1(CAG-cas9*,-EGFP)Fezh/J</td>
			<td>Jackson labs</td>
			<td>24857</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOD.CB17-Prkdc-scid/NCr Hsd (Nod.Scid)</td>
			<td>Envigo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV pCM109 EFS Cre sg APC sg Kras sg P53- Kras HDR</td>
			<td>Broad Institute of MIT</td>
			<td></td>
			<td>Kind gift from Dr Randall J Platt and Dr. Joseph Rosenbluh, Broad Institute of MIT and Harvard, Cambridge, MA 02142, USA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV 2/9 capsid vector</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>112865</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAD Delta F5 helper</td>
			<td>Ben Gurion University of the Negev</td>
			<td></td>
			<td>Provided by Dr Daniel Gitler, Department of Physiology and Cell Biology, Faculty of Health Sciences, and Zlotowski Center for Neuroscience, Ben-Gurion University of the Negev, Beer-Sheva 84105, Israel.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic wares</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon-ULTRA filter 100 KDa</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC910024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m sterile filters, 4 mm</td>
			<td>Millex</td>
			<td>SLGV004SL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45 &#181;m sterile filters, 13 mm</td>
			<td>Millex</td>
			<td>SLHV013SL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture plates</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro establishment of a genetically engineered murine head and neck cancer cell line using an adeno-associated virus-cas9 system

원발성 정상 상피 세포의 사용은 군집된 조절 식 인터스페이스를 사용하여 종양 유전자 및 종양 억제 유전자에 특정 돌연변이를 도입하여 세포 변형에 필요한 게놈 변경을 재현가능하게 유도할 수 있게 합니다. 마우스에 있는 짧은 palindromic 반복 (CRISPR) 기지를 둔 게놈 편집 기술. 이 기술은 우리가 정확하게 마우스를 사용하여 인간적인 암에서 일어나는 유전 변경을 모방하는 것을 허용합니다. 뮤린 원발성 세포를 유전적으로 변형시킴으로써 암 발병, 진행, 치료 및 진단을 더 잘 연구할 수 있습니다. 이 연구에서는, 우리는 시험관에서 아데노 관련 바이러스 (AAV)를 사용하여 게놈 편집을 가능하게 하기 위하여 Cre 유도가능한 Cas9 마우스 혀 상피 세포를 이용했습니다. 구체적으로, KRAS, p53 및 APC를 정상 혀 상피 세포에서 변경함으로써, 우리는 생체 외에서 뮤린 두경부암(HNC) 세포주생성, 이는 합성 마우스에서 종양발생이다. 여기에 제시된 방법은 특정 게놈 변경을 가진 HNC 세포주를 생성하는 방법을 상세히 기술하고 syngeneic 마우스에 있는 종양 진행을 예측하기 위한 그들의 적합성을 설명합니다. 우리는 이 유망한 방법이 HNC의 종양 생물학 그리고 치료를 공부하는 유익하고 유용할 것이라는 점을 구상합니다.

AAV 시스템을 사용하여 일반 Cas9 셀 변환 도 1은 본 연구에서 사용된 AAV 이식유전자 플라스미드의 상세한 벡터 맵을 제공한다. 그림 2는 AAV-Cas9 기반 시스템의 설계 및 작동을 간략하게 설명합니다. 바이러스 성 입자를 생성하기 위해, HEK293T 세포는 PEI 형질감염 방법을 사용하여 AAV 이식 유전자 벡터 및 기타 바이러?...

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In Vitro Establishment of a Genetically Engineered Murine Head and Neck Cancer Cell Line using an Adeno-Associated Virus-Cas9 System

두경부암 환자에서 돌연변이된 특정 유전자를 가진 뮤린 모델의 개발은 신생물의 이해를 위해 요구된다. 여기서, 우리는 특정 게놈 변경을 가진 뮤린 HNC 세포주를 생성하기 위하여 아데노 관련 바이러스 Cas9 시스템을 사용하여 1 차적인 뮤린 혀 세포의 시험관 내 형형변환을 위한 프로토콜을 제시한다.

아데노 관련 바이러스-Cas9 시스템을 사용하여 유전자 조작 된 뮤린 머리와 목 암 세포라인의 시험관 내 설립

The use of primary normal epithelial cells makes it possible to reproducibly induce genomic alterations required for cellular transformation by ...

이 프로토콜은 특정 게놈 수술을 가진 두경부 암 모형의 발달을 가능하게 했습니다, 신생물의 프로세스에 있는 특정 유전자 돌연변이의 역할의 우리의 이해에 크게 영향을 미칩니다. 이 기술의 주요 장점은 셀라인이 거의 모든 기관에서 개발 될 수있는 용이성입니다. 절차를 시연하는 것은 마누 프라사드 (Manu Prasad)가 내 실험실에서 졸업생이 될 것입니다.6 주 된 남성 또는 여성 B6 형질 형 질 성 마우스에서 혀를 수확 하는 수술 가위를 사용 하 여 시작. 메스를 사용하여 조직을 매우 작은 조각으로 다진 다음 혈청없이 RPMI 일반 매체의 4.5 밀리리터를 포함하는 15 밀리리터 튜브로 조각을 수집합니다. 튜브에 200 마이크로리터의 삼중 효소 믹스를 추가하고 조직의 효소 해리를 향상시키기 위해 10 분마다 튜브를 두드리는 30 분 동안 37섭씨37도에서 샘플을 배양합니다.인큐베이션의 끝에서, PBS에서 5%FBS로 반응을 중지하고 더 큰 조직 단편에서 세포를 분리하기 위해 70 마이크로 미터 메쉬 스트레이너를 통해 세포 현탁액을 필터링합니다. 원심분리에 의해 세포를 수집하고 완전한 매체의 3밀리리터에서 펠릿을 다시 중단한다. 그런 다음 16mm 접시당 완전한 중간 크기의 3밀리리터로 세포를 플레이트합니다.필터 위에 유지된 셀 응집체를 별도의 16mm 배양 접시에 전달하고 3밀리리터의 완전한 배지를 추가합니다. 뚜렷한 세포 식민지가 형성될 때까지 두 요리를 인큐베이터에 보관하십시오. 배양 1주일 후 섬유아세포 오염의 존재를 위해 1차 세포 배양을 현미경으로 검사하고, 세포를 02%EDTA에서 02%의 트립신으로 1분 동안 섭씨 37도로 치료하고 섬유아세포를 제거합니다.배양 첫날10일 에는 섭씨 37도에서 3~5분 동안 25%의 트립신을 사용하여 세포 현탁액 또는 세포 골재 배양으로부터 세포를 수확하고 6웰 플레이트의 각 웰에 우물당 2밀리리터에서 5차 세포에 2회 10을 본다. 다음 날 세포는 밀리리터 당 10~12개의 바이러스 게놈으로 세포를 1회 변환하고 37°C에서 48시간 동안 바이러스 입자 함유 배지에서 세포를 배양한다. 인큐베이션의 끝에서, 배양 슈퍼네이터를 웰당 2밀리리터의 신선한 완전한 배지로 대체하고 세포를 세포 배양 인큐베이터로 되돌려 보라고 한다.배양 확장의 2 주 후, 유효성 검사 및 생체 종양 유발 실험을 위해 세포를 시드. AAV CAS9 벡터를 사용하여, 바이러스의 밀리리터 당 12개의 바이러스 게놈에 10회 10회 는 입증된 프로토콜을 사용하여 1차 메타세포를 종양성 지도로 효율적으로 변환하도록 결정되었다. 변환 된 세포 익스프레스 Cre, CAS9 및 녹색 형광 단백질.NOD SCID 마우스의 혀, 입술 및 피부로 지도를 5회 10회 주사하면 종양을 유발하지 않는 1차 맵의 주사와 달리 이들 동물의 종양 형성이 발생한다. 1 차적인 혀 상피 세포의 종양 생성 변환은 면역 형광 및 서쪽 얼룩을 사용하여 확인할 수 있습니다. 변형된 세포로부터 분리된 DNA의 깊은 시퀀싱에 의한 유전체 분석은 AAV CAS9 시스템에 의한 종양 단백질 53 및 APC 유전자의 효과적인 유전자 편집 및 프레임 변이를 확인한다.또한, 변형된 혀 세포는 야생형 C57 블랙 6마우스에서 종양을 효율적으로 형성한다. 신성형 종양 세포의 면역 조직 화학 적 분석은 E-Cadherin과 Keratin 14의 세포질 발현을 밝혀, 두 상피 조직 마커. 이 절차를 시도할 때, 항상 너무 많은 다진 또는 너무 많은 효소 반응이 세포의 생존가능성을 감소시켜 바이러스 트랜잭션 효율성을 감소시키는 것을 기억하십시오.이 절차를 사용하여, 세포선은 관심있는 어떤 조직에서 암 세포의 종양 유발 및 전이성 잠재력에 대한 통찰력을 얻기 위해 유전자 변형 될 수있다.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Model for Perineural Invasion in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

머리와 목 편평 ​​세포 암에서 신경초 침략을위한 모델

Perineural invasion (PNI) is found in approximately 40% of head and neck squamous cell carcinomas (HNSCC). Despite multimodal treatment with surgery, ...

연구

암 연구학

Four-color Fluorescence Immunohistochemistry of T-cell Subpopulations in Archival Formalin-fixed, Paraffin-embedded Human Oropharyngeal Squamous Cell Carcinoma Samples

포르말린 - 고정, 파라핀 - 임베디드 인간 구강 성 편평 세포 암종 샘플에서의 T 세포 아군의 4 색 형광 면역 조직 화학

The four-color fluorescence immunohistochemistry (IHC) technique is a method to quantify cell populations of interest while taking into account their ...

A Genetically Engineered Mouse Model of Sporadic Colorectal Cancer

산발성 대장 암의 유 전적으로 조작 된 마우스 모델

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, colorectal cancer mouse models based on tumor cell injection have severe limitations ...

The Establishment of a Lung Colonization Assay for Circulating Tumor Cell Visualization in Lung Tissues

순환 종양 세포 시각화 폐 조직에 대 한 폐 식민 분석 결과의 설립

Metastasis is the major cause of cancer death. The role of circulating tumor cells (CTCs) in promoting cancer metastasis, in which lung colonization by ...

Therapy Testing in a Spheroid-based 3D Cell Culture Model for Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

머리와 목 편평 상피 세포 암에 대 한 회전 타원 체 기반 3D 셀 문화 모델에서 테스트 하는 치료

Current treatment options for advanced and recurrent head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) enclose radiation and chemo-radiation approaches with ...

Enrichment and Characterization of the Tumor Immune and Non-immune Microenvironments in Established Subcutaneous Murine Tumors

농축 및 설립된 피하 Murine 종양에서 종양 면역 및 비 면역 Microenvironments의 특성

The tumor immune microenvironment (TIME) has recently been recognized as a critical mediator of treatment response in solid tumors, especially for ...

Live Cell Imaging of the TGF-	&beta;/Smad3 Signaling Pathway In Vitro and In Vivo Using an Adenovirus Reporter System

Live Cell Imaging of the TGF-	ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²/Smad3 Signaling Pathway In Vitro and In Vivo Using an Adenovirus Reporter System

라이브 셀 이미징 TGF-β/Smad3 신호 통로 생체 외에서 그리고 Vivo에서 아 데 노 바이러스 기자 시스템을 사용 하 여

Transforming Growth Factor &#946; (TGF-&#946;) signaling regulates many important functions required for cellular homeostasis and is commonly found ...

Assessing Cell Viability and Death in 3D Spheroid Cultures of Cancer Cells

암세포의 3D 스페로이드 배양에서 세포 생존력과 사망 평가

Three-dimensional spheroids of cancer cells are important tools for both cancer drug screens and for gaining mechanistic insight into cancer cell biology. ...

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

위암 환자 유래 이종이식 모델 및 1차 세포주 구축

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

In Vitro Assay to Study Tumor-macrophage Interaction

종양 대식 세포 상호 작용을 연구 하는 시험관 내 분석

Tumor associated macrophages (TAMs) account for a large percentage of cells in the tumor mass for different types of cancers. Glioblastoma (GBM), a ...