Name: in vitro establishment of a genetically engineered murine head and neck cancer cell line using an adeno-associated virus-cas9 system
Uploaded: 2020-01-09T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Establishment of a Genetically Engineered Murine Head and Neck Cancer Cell Line using an Adeno-Associated Virus-Cas9 System at JoVE.com

Dr. Daniel Gitler'a pAd Delta 5 Helper plazmidini sağladığı için teşekkür ederiz. Bu çalışma İsrail Bilim Vakfı (ISF, 700/16) (ME), Amerika Birleşik Devletleri-İsrail Binational Science Foundation (BSF, 2017323) (ME ve MS), İsrail Kanser Derneği (ICA, 20170024) (ME için), İsrail Kanser Araştırma Vakfı (ICRF, 17-1693-RCDA) (ME) ve Endişe Vakfı (ME) tarafından finanse edilmiştir #7895. Fellowship: ME ve SJ ve MP BGU Kreitman burs alon bursu.

Bu çalışma Negev Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi Ben Gurion Üniversitesi tarafından onaylanmıştır. Hayvan deneyleri IACUC (IL.80-12-2015 ve IL.29-05-2018(E)) tarafından onaylanmıştır. Bu çalışmada kullanılan hayvan testleri, barınma ve çevre koşullarının tüm yönleri Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'na uygun olarak hazırlanmıştır13.
1. Adeno ile ilişkili virüs üretimi
<ol><li>1. Gün: Hücre kültürü<ol>
...

<ol>
	<li>Reyes-Gibby, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+association+study+identifies+genes+associated+with+neuropathy+in+patients+with+head+and+neck+cancer.">Genome-wide association study identifies genes associated with neuropathy in patients with head and neck cancer.</a> Scientific Reports. 8 (1), 8789 (2018).</li><li>Riaz, N., Morris, L. G., Lee, W., Chan, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unraveling+the+molecular+genetics+of+head+and+neck+cancer+through+genome-wide+approaches.">Unraveling the molecular genetics of head and neck cancer through genome-wide approaches.</a> Genes &amp; Diseases. 1 (1), 75 (2014).</li><li>Leemans, C. R., Snijders, P. J. F., Brakenhoff, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+landscape+of+head+and+neck+cancer.">The molecular landscape of head and neck cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 18 (5), 269-282 (2018).</li><li>Jiang, X., Ye, J., Dong, Z., Hu, S., Xiao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+genetic+alterations+and+their+impact+on+target+therapy+response+in+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma.">Novel genetic alterations and their impact on target therapy response in head and neck squamous cell carcinoma.</a> Cancer Management and Research. 11, 1321-1336 (2019).</li><li>Im, W., Moon, J., Kim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+CRISPR/Cas9+for+Gene+Editing+in+Hereditary+Movement+Disorders.">Applications of CRISPR/Cas9 for Gene Editing in Hereditary Movement Disorders.</a> Journal of Movement Disorders. 9 (3), 136-143 (2016).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+analysis+of+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma+cell+lines+and+human+tumors:+a+rational+approach+to+preclinical+model+selection.">Genomic analysis of head and neck squamous cell carcinoma cell lines and human tumors: a rational approach to preclinical model selection.</a> Molecular Cancer Research: MCR. 12 (4), 571-582 (2014).</li><li>AACR Project GENIE Consortium, T.A.P.G.. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AACR+Project+GENIE:+Powering+Precision+Medicine+through+an+International+Consortium.">AACR Project GENIE: Powering Precision Medicine through an International Consortium.</a> Cancer Discovery. 7 (8), 818-831 (2017).</li><li>Suh, Y., Amelio, I., Guerrero Urbano, T., Tavassoli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+update+on+cancer:+molecular+oncology+of+head+and+neck+cancer.">Clinical update on cancer: molecular oncology of head and neck cancer.</a> Cell Death &amp; Disease. 5 (1), e1018 (2014).</li><li>Anderson, J. A., Irish, J. C., Ngan, B. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+of+RAS+oncogene+mutation+in+head+and+neck+carcinomas.">Prevalence of RAS oncogene mutation in head and neck carcinomas.</a> The Journal of Otolaryngology. 21 (5), 321-326 (1992).</li><li>Ryals, R. C., Boye, S. L., Dinculescu, A., Hauswirth, W. W., Boye, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+transduction+efficiencies+of+unmodified+and+tyrosine+capsid+mutant+AAV+vectors+in+vitro+using+two+ocular+cell+lines.">Quantifying transduction efficiencies of unmodified and tyrosine capsid mutant AAV vectors in vitro using two ocular cell lines.</a> Molecular Vision. 17, 1090-1102 (2011).</li><li>Smith-Arica, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+Efficiency+of+Human+and+Mouse+Embryonic+Stem+Cells+Using+Adenoviral+and+Adeno-Associated+Viral+Vectors.">Infection Efficiency of Human and Mouse Embryonic Stem Cells Using Adenoviral and Adeno-Associated Viral Vectors.</a> Cloning and Stem Cells. 5 (1), 51-62 (2003).</li><li>Li, J., Xiao, X., Kenniston, T., Kudlow, J., Giannoukakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV+Vectors.">AAV Vectors.</a> Molecular Therapy. 3 (5), S174-S192 (2001).</li><li>Institute of Laboratory Animal Resources (U.S.). <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Guide for the care and use of laboratory animals. , (1996).</li><li>Platt, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas9+knockin+mice+for+genome+editing+and+cancer+modeling.">CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling.</a> Cell. 159 (2), 440-455 (2014).</li><li>Zhang, Y., Chirmule, N., Gao, G. P., Wilson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD40+ligand-dependent+activation+of+cytotoxic+T+lymphocytes+by+adeno-associated+virus+vectors+in+vivo:+role+of+immature+dendritic+cells.">CD40 ligand-dependent activation of cytotoxic T lymphocytes by adeno-associated virus vectors in vivo: role of immature dendritic cells.</a> Journal of Virology. 74 (17), 8003-8010 (2000).</li><li>Xiao, X., Li, J., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+high-titer+recombinant+adeno-associated+virus+vectors+in+the+absence+of+helper+adenovirus.">Production of high-titer recombinant adeno-associated virus vectors in the absence of helper adenovirus.</a> Journal of Virology. 72 (3), 2224-2232 (1998).</li><li>Auricchio, A., Hildinger, M., O'Connor, E., Gao, G. P., Wilson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Highly+Infectious+and+Pure+Adeno-Associated+Virus+Type+2+Vectors+with+a+Single-Step+Gravity-Flow+Column.">Isolation of Highly Infectious and Pure Adeno-Associated Virus Type 2 Vectors with a Single-Step Gravity-Flow Column.</a> Human Gene Therapy. 12 (1), 71-76 (2001).</li><li>Lock, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+Recombinant+Adeno-Associated+Virus+Type+2+Reference+Standard+Material.">Characterization of a Recombinant Adeno-Associated Virus Type 2 Reference Standard Material.</a> Human Gene Therapy. 21 (10), 1273 (2010).</li><li>Challis, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+AAV+vectors+for+widespread+and+targeted+gene+delivery+in+rodents.">Systemic AAV vectors for widespread and targeted gene delivery in rodents.</a> Nature Protocols. 14 (2), 379-414 (2019).</li><li>Rabinowitz, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-packaging+of+a+single+adeno-associated+virus+(AAV)+type+2+vector+genome+into+multiple+AAV+serotypes+enables+transduction+with+broad+specificity.">Cross-packaging of a single adeno-associated virus (AAV) type 2 vector genome into multiple AAV serotypes enables transduction with broad specificity.</a> Journal of Virology. 76 (2), 791-801 (2002).</li><li>Cheng, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Memorial+Sloan+Kettering-Integrated+Mutation+Profiling+of+Actionable+Cancer+Targets+(MSK-IMPACT).">Memorial Sloan Kettering-Integrated Mutation Profiling of Actionable Cancer Targets (MSK-IMPACT).</a> The Journal of Molecular Diagnostics. 17 (3), 251-264 (2015).</li><li>Sun, H., Taneja, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Transformation+and+Tumorigenicity+Using+Mouse+Embryonic+Fibroblast+Cells.">Analysis of Transformation and Tumorigenicity Using Mouse Embryonic Fibroblast Cells.</a> Cancer Genomics and Proteomics. 383, 303-310 (2007).</li><li>Durkin, M., Qian, X., Popescu, N., Lowy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Mouse+Embryo+Fibroblasts.">Isolation of Mouse Embryo Fibroblasts.</a> BIO-PROTOCOL. 3 (18), (2013).</li><li>Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Mouse+Embryonic+Fibroblast+Cells+Suitable+for+Culturing+Human+Embryonic+and+Induced+Pluripotent+Stem+Cells.">Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (64), e3854 (2012).</li><li>Boehm, J. S., Hession, M. T., Bulmer, S. E., Hahn, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+Human+and+Murine+Fibroblasts+without+Viral+Oncoproteins.">Transformation of Human and Murine Fibroblasts without Viral Oncoproteins.</a> Molecular and Cellular Biology. 25 (15), 6464 (2005).</li><li>Gupta, T., S&#225;enz Robles, T. M., Pipas, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+transformation+of+mouse+embryo+fibroblasts+in+the+absence+of+activator+E2Fs.">Cellular transformation of mouse embryo fibroblasts in the absence of activator E2Fs.</a> Journal of Virology. 89 (9), 5124-5133 (2015).</li><li>Leong, H., Blewitt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrovirus+Mediated+Malignant+Transformation+of+Mouse+Embryonic+Fibroblasts.">Retrovirus Mediated Malignant Transformation of Mouse Embryonic Fibroblasts.</a> BIO-PROTOCOL. 3 (15), (2013).</li><li>Parikh, N., Nagarajan, P., Sei-ichi, M., Sinha, S., Garrett-Sinha, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+an+immortalized+oral+keratinocyte+cell+line+of+mouse+origin.">Isolation and characterization of an immortalized oral keratinocyte cell line of mouse origin.</a> Archives of Oral Biology. 53 (11), 1091-1100 (2008).</li><li>Badarni, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repression+of+AXL+expression+by+AP-1/JNK+blockage+overcomes+resistance+to+PI3Ka+therapy.">Repression of AXL expression by AP-1/JNK blockage overcomes resistance to PI3Ka therapy.</a> JCI Insight. 5, 125341 (2019).</li><li>Chen, Y. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+of+mouse+oral+carcinoma+cell+lines+derived+from+transgenic+mice+and+their+use+as+syngeneic+tumorigenesis+models.">Establishing of mouse oral carcinoma cell lines derived from transgenic mice and their use as syngeneic tumorigenesis models.</a> BMC Cancer. 19 (1), 281 (2019).</li><li>Hoover, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Human+Papillomavirus+16+E6+in+Anchorage-Independent+and+Invasive+Growth+of+Mouse+Tonsil+Epithelium.">The Role of Human Papillomavirus 16 E6 in Anchorage-Independent and Invasive Growth of Mouse Tonsil Epithelium.</a> Archives of Otolaryngology-Head &amp; Neck Surgery. 133 (5), 495 (2007).</li><li>Smahel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metastatic+MHC+class+I-negative+mouse+cells+derived+by+transformation+with+human+papillomavirus+type+16.">Metastatic MHC class I-negative mouse cells derived by transformation with human papillomavirus type 16.</a> British Journal of Cancer. 84 (3), 374-380 (2001).</li><li>He, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+Growth+of+a+Newly+Established+Mouse+Epithelial+Cell+Line+Transformed+with+HPV-16+E7+in+Diabetic+Mice.">Increased Growth of a Newly Established Mouse Epithelial Cell Line Transformed with HPV-16 E7 in Diabetic Mice.</a> PloS One. 11 (10), e0164490 (2016).</li></ol>

Çeşitli yöntemler daha önce başarı 25 değişken dereceleri ile kültürbirincil hücreleri dönüştürmek için kullanılmıştır25,26,27,28. Bu yöntemlerin çoğu dönüşüm için fare fibroblast hücreleri kullanın14,17,18,19 veya 4-nitroquinoline-1-oksi...

HNC dünya çapında yaygın bir malignitedir1. HNC neoplazi sinin oluşumunun modelleştirilmesi şu anda bilimsel bir dönüm noktasında2. HNC2,3,4 (örneğin, TP53, PIK3CA, NOTCH1, FAT1 ve RAS) birçok genetik mutasyon tespit edilmiş olsa da, HNC indüklemek için konser de gerekli genomik değişikliklerin belirli kombinasyonları belirsizliğini koruyor.
İnsan HNC hücre hatlarının mevcut kullanımı önemli ölçüde patogenez ve tedavi ile ilişkili mekanizmaları naçıklığa kavuşturmak için yardımcı oldu3. Ancak, immün azat lı murine sistemlerinde insan hücre hatlarının incelenmesinin sınırlamaları vardır, çünkü bu sistemler in vivo neoplastik prosese, spesifik gen mutasyonlarının rolüne ve immün mikroortamdaki tedavi yanıtlarına hitap etmez. Bu nedenle, farklı genlerin dönüşüm sürecine nasıl katkıda bulundugunu incelemek ve immünyonlu farelerde yeni molekül temelli tedavileri test etmek için spesifik genetik degistirimlere sahip murin hücre hatlarınin geliþimi ve kurulmasý birincil öneme sahiptir.
Biyomedikal araştırmalarda gen fonksiyon çalışmaları, örneğin5,çift iplikçikli sonları (DSBs) tanıtarak, DNA düzenleme teknolojilerinde gelişmelerden önemli ölçüde etkilenmiştir. Çinko parmak nükleazlarının kullanımı, transkripsiyon aktivatör benzeri efektör nükleazlar ve kümelenmiş düzenleyici aralıklı kısa palindromik tekrarlar (CRISPR/Cas9) dahil olmak üzere bu teknolojiler, çekirgesinde ilgi çeken herhangi bir genin manipülasyonuna olanak sağlar. En son CRISPR/Cas9 sistemleri, Cas9 nükleazını genomdaki belirli bir bölgede DSB oluşturmak üzere yönlendiren bir kılavuz RNA'dan (gRNA) oluşur. Bu sistem, en geleneksel olarak tedavi edilmesi en zor organizmalar5'te bile, herhangi bir hücre veya hedef dokudaki endojengenlerindeğiştirilmesinde geniş bir tanıma kazanmıştır. Sadeliği, hızı ve verimliliği sayesinde diğer sistemlere göre birden fazla avantajı vardır.
Onkolojide CRISPR/CAS9 teknolojisi kanser hücrelerini etkin bir şekilde taklit etme ihtiyacını karşılamıştır. HNC bu sistemi kurmak için, biz güçlü KRAS onkogen ve iki önemli tümör baskılayıcı genler, APC ve p536manipüle. GENIE veritabanı7göre, Bu kombinasyon HNC nadirdir. RAS mutasyonları (HRAS, NRAS ve KRAS) tüm HNC popülasyonlarının sadece ~%7'sinde mevcuttur. Bu tümörler tedaviye dirençli olma eğilimindedir8,9.
Cas9 ve gRNA'sının teslimi, aav veya lentivirüsler kullanılarak viral transdüksiyon yoluyla sağlanır. Rekombinant AAV genellikle yüksek titreşme, hafif bağışıklık yanıtı, geniş bir hücre yelpazesi nekadar bilgi verme yeteneği ve genel güvenlik sayesinde genleri hedef hücrelere ulaştırmak için tercih edilen bir yöntemdir. Bir AAV sistemi kullanılarak, çeşitli dokuya özgü fare hücre hatları oluşturuldu ve yeni hücre hatları halageliştiriliyor 10,11,12. Ancak, murine HNC hücre hattı modelleri hücreleri üretebilir verimli bir genomik düzenleme sistemi geliştirilmeye devam etmektedir. Bu çalışmada, primer minyon dil hücrelerini tümörijenik duruma dönüştürmek için in vitro AAV-Cas9 tabanlı bir sistem geliştirmeye çalıştık. Bu eşsiz CRISPR/Cas9 dönüşüm protokolü ve kurulan tümör hücre hattı, genomik değişikliklerin çeşitliliğiile indüklenen HNC'nin biyolojisini daha iyi anlamak için kullanılabilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti mouse HRP</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>115-035-146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti rabbit HRP</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>711-035-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cas9 Mouse mAb</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>14697</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cre</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>900901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3-AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>115-165-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy-AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>111-165-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-9996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>4370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit monoclonal anti E cadherin</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>3195S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit monoclonal anti-KRT 14</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB-ab181595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946; actin</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>691001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946; catenin</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9582S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell lines</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK93T</td>
			<td>ATCC</td>
			<td><a href="https://www.atcc.org/en/Products/All/CRL-3216.aspx" target="_blank">CRL-3216</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture Media, Chemicals and Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford Reagent</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>30015484</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0332-TAM-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI fluoromount</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>0100-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd.</td>
			<td>01-055-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL (Westar Supernova and Westar Nova 2.0)</td>
			<td>Cyanagen</td>
			<td>XLS3.0100 and XLS071.0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd.</td>
			<td>04-127-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H6648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin - Agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H6508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolate II Genomic DNA Kit</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-52066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Panreac AppliChem</td>
			<td>300283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Bio Lab Ltd</td>
			<td>1903059100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd.</td>
			<td>02-023-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEI</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>23966-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen Strep Solution</td>
			<td>Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd.</td>
			<td>03-031-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>30525-89-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatase inhibitor cocktail</td>
			<td>Biotool</td>
			<td>B15001A/B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>P2714-1BTL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris buffer</td>
			<td>MERCK Millipore</td>
			<td>648311-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enzymes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E1014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase IV</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17104019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>18047019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>H3506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd.</td>
			<td>03-050-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass wares</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover slips</td>
			<td>Bar Naor</td>
			<td>BNCB00130RA1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides</td>
			<td>Bar Naor</td>
			<td>BN9308C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse strains</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6</td>
			<td>Envigo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6;129-Gt(ROSA)26Sortm1(CAG-cas9*,-EGFP)Fezh/J</td>
			<td>Jackson labs</td>
			<td>24857</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOD.CB17-Prkdc-scid/NCr Hsd (Nod.Scid)</td>
			<td>Envigo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV pCM109 EFS Cre sg APC sg Kras sg P53- Kras HDR</td>
			<td>Broad Institute of MIT</td>
			<td></td>
			<td>Kind gift from Dr Randall J Platt and Dr. Joseph Rosenbluh, Broad Institute of MIT and Harvard, Cambridge, MA 02142, USA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV 2/9 capsid vector</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>112865</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAD Delta F5 helper</td>
			<td>Ben Gurion University of the Negev</td>
			<td></td>
			<td>Provided by Dr Daniel Gitler, Department of Physiology and Cell Biology, Faculty of Health Sciences, and Zlotowski Center for Neuroscience, Ben-Gurion University of the Negev, Beer-Sheva 84105, Israel.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic wares</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon-ULTRA filter 100 KDa</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC910024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m sterile filters, 4 mm</td>
			<td>Millex</td>
			<td>SLGV004SL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45 &#181;m sterile filters, 13 mm</td>
			<td>Millex</td>
			<td>SLHV013SL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture plates</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro establishment of a genetically engineered murine head and neck cancer cell line using an adeno-associated virus-cas9 system

Primer normal epitel hücrelerinin kullanımı, onkogenlerde ve tümör baskılayıcı genlerde spesifik mutasyonlar getirerek hücresel dönüşüm için gerekli genomik değişiklikleri tekrarlanabilir bir şekilde tetiklemelerini mümkün kılar. farelerde kısa palindromik tekrar (CRISPR) tabanlı genom düzenleme teknolojisi. Bu teknoloji, fare kullanarak insan kanserlerinde meydana gelen genetik değişiklikleri doğru bir şekilde taklit etmemizi sağlar. Genetik olarak murine primer hücreleri dönüştürerek, daha iyi kanser gelişimi, ilerleme, tedavi ve tanı inceleyebilirsiniz. Bu çalışmada, adeno ilişkili virüs (AAV) in vitro kullanarak genom düzenleme sağlamak için Cre-indüklanabilir Cas9 fare dil epitel hücreleri kullanılır. Özellikle, normal dil epitel hücrelerinde KRAS, p53 ve APC değiştirerek, biz bir murine baş ve boyun kanseri üretti (HNC) in vitro hücre hattı, hangi syngeneic farelerde tümörijenik. Burada sunulan yöntem, belirli genomik değişikliklerle HNC hücre hatlarının nasıl üretilebildiğini ayrıntılı olarak açıklar ve sinjenezik farelerde tümör ilerlemesini tahmin etmeye uygunluklarını açıklar. Bu umut verici yöntemin hnc tümör biyolojisi ve tedavisi için bilgilendirici ve yararlı olacağını öngörüyoruz.

Normal Cas9 hücrelerini dönüştürmek için AAV sistemini kullanma Şekil 1 bu çalışmada kullanılan AAV transgen plazmidinin ayrıntılı bir vektör haritasını sunmaktadır. Şekil 2, AAV-Cas9 tabanlı sistemin tasarımını ve çalışmasını özetler. Viral parçacıklar üretmek için HEK293T hücreleri PEI transfeksiyon yöntemi kullanılarak AAV transgen vektörü ve diğer viral ambalaj vektö...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Establishment of a Genetically Engineered Murine Head and Neck Cancer Cell Line using an Adeno-Associated Virus-Cas9 System at JoVE.com

In Vitro Establishment of a Genetically Engineered Murine Head and Neck Cancer Cell Line using an Adeno-Associated Virus-Cas9 System

Neoplazi anlayışı için baş ve boyun kanseri hastalarında mutasyona uğramış spesifik genler ile murine modellerinin geliştirilmesi gereklidir. Burada, belirli genomik değişikliklerile murine HNC hücre hatları oluşturmak için adeno-ilişkili bir virüs-Cas9 sistemi kullanarak primer minür dil hücrelerinin in vitro dönüşümü için bir protokol salıyoruz.

Adeno-Associated Virus-Cas9 Sistemi Kullanılarak Genetiği Değiştirilmiş Bir Murine Baş ve Boyun Kanseri Hücre Hattı In Vitro Kurulması

The use of primary normal epithelial cells makes it possible to reproducibly induce genomic alterations required for cellular transformation by ...

Bu protokol, belirli genomik operasyonla baş boyun kanseri modellerinin geliştirilmesini sağladı ve neoplazi sürecinde spesifik gen mutasyonlarının rolünü anlamamızı önemli ölçüde etkiledi. Bu tekniğin en büyük avantajı, hücre hattının hemen hemen her organdan geliştirilme kolaylığıdır. Prosedürü gösteren Manu Prasad benim laboratuvarımdan yüksek lisans öğrencisi olacak.Altı haftalık erkek veya kadın B6 transgenik fare dil hasat için cerrahi makas kullanarak başlayın. Çok küçük parçalar halinde doku kıyma ve serum olmadan RPMI düz orta 4,5 mililitre içeren 15 mililitrelik tüp içine parçaları toplamak için bir neşter kullanın. Tüpün enzim karışımına 200 mikrolitre üçlü enzim karışımı ekleyin ve tüpün enzimasyonunu geliştirmek için her 10 dakikada bir 30 dakika boyunca numuneyi 37 derecede kuluçkaya yatırın.Kuluçka sonunda, PBS%5 FBS ile reaksiyonu durdurun ve hücreleri büyük doku parçalarından ayırmak için hücre süspansiyonunu 70 mikro metrelik bir örgü süzgeçten filtreleyin. Santrifüj ile hücreleri toplamak ve tam orta üç mililitre pelet yeniden askıya. Sonra 16 milimetrelik çanak başına tam orta üç mililitre hücreleri plaka.Filtrenin üstünde tutulan hücre agregalarını ayrı bir 16 milimetrelik kültür yemeğine aktarın ve üç mililitre tam ortam ekleyin. Farklı hücre kolonileri oluşana kadar her iki yemeği de kuvözde saklayın. Kültür bir hafta sonra, mikroskobik fibroblast kontaminasyon varlığı için birincil hücre kültürleri incelemek, bir dakika için 37 santigrat derece 02% EDTA% 25 tripsin ile hücreleri tedavi ve herhangi bir fibroblastlar kaldırın.Kültürün 10. gününde hücre süspansiyonu veya hücre agrega kültürlerinden hücreleri hasat etmek için 37 santigrat derecede 3ila beş dakika boyunca %02 EDTA'da %25 tripsin kullanın ve 6 kuyulu plakanın her kuyunun her kuyusu için iki mililitre orta daki iki kat 10 ile beşinci birincil hücreleri görürsünüz. Ertesi gün mililitre başına 12 viral genomun bir katı ile hücreleri aktarın ve 37 santigrat derecede 48 saat boyunca viral parçacık içeren ortamdaki hücreleri kuluçkaya yatırın. Kuluçka sonunda, iyi başına taze tam orta iki mililitre ile kültür supernatants değiştirin ve hücre kültürü kuluçka hücreleri dönmek.Kültür genişleme iki hafta sonra, doğrulama ve in vivo tümörijenik deneyler için hücreleri tohum. AAV CAS9 vektörü kullanılarak, virüs mililitrebaşına 10 ila 12 viral genomun, gösterildiği gibi protokolü kullanarak primer meth hücrelerini tümörijenik haritalara verimli bir şekilde dönüştürdüğu tespit edilmiştir. Transduced hücreleri Express Cre, CAS9 ve Yeşil Floresan Protein.NOD SCID farelerin dil, dudak ve deriiçine beş kez 10 transduced haritalar enjeksiyonu, tümörlerneden olmayan primer haritalar enjeksiyon aksine bu hayvanlarda tümör oluşumu ile sonuçlanır. Primer dil epitel hücrelerinin tümörijenik dönüşümü immünfloresans ve batı blotlama kullanılarak doğrulanabilir. Dönüştürülmüş hücrelerden izole edilen DNA'nın derin dizilemesi ile genomik analiz, AAV CAS9 sistemi tarafından tümör proteini 53 ve APC genlerinin etkili gen düzenlemesini ve çerçeve değişimini doğrular.Buna ek olarak, dönüştürülmüş dil hücreleri verimli vahşi tip C57 siyah altı farelerde tümörler oluşturur. Neoplastik tümör hücrelerinin immünohistokimyasal analizi, her ikisi de epitel doku belirteçleri olan E-Kadherin ve Keratin 14'ün sitoplazmik ekspresyonunu ortaya koymaktadır. Bu yordamı denerken, her zaman çok fazla kıyma veya çok fazla enzimatik reaksiyon hücrelerin azaltılmış canlılık yol unutmayın, azaltılmış virüs işlem verimliliği yol açan.Bu prosedürü kullanarak, hücre hatları genetik ilgi herhangi bir doku dan kanser hücrelerinin tümörijenik ve metastatik potansiyeli içine fikir kazanmak için değiştirilebilir.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Model for Perineural Invasion in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

Baş ve Boyun Skuamöz Hücre Karsinomu içinde perinöral invazyon İçin Bir Model

Perineural invasion (PNI) is found in approximately 40% of head and neck squamous cell carcinomas (HNSCC). Despite multimodal treatment with surgery, ...

Four-color Fluorescence Immunohistochemistry of T-cell Subpopulations in Archival Formalin-fixed, Paraffin-embedded Human Oropharyngeal Squamous Cell Carcinoma Samples

Arşiv Formalin Sabitlenmiş, Parafin Gömülü İnsan Orofaringeal Skuamöz Hücreli Karsinoma Örneklerinde T-hücresi Subpopülasyonlarının Dört Renkli Floresan İmmunohistokimyası

The four-color fluorescence immunohistochemistry (IHC) technique is a method to quantify cell populations of interest while taking into account their ...

A Genetically Engineered Mouse Model of Sporadic Colorectal Cancer

Sporadik Kolorektal Kanserin Genetik Olarak Geliştirilmiş Fare Modeli

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, colorectal cancer mouse models based on tumor cell injection have severe limitations ...

The Establishment of a Lung Colonization Assay for Circulating Tumor Cell Visualization in Lung Tissues

Tümör hücre görselleştirme akciğer dokusu içinde dolaşan bir akciğer kolonizasyon tahlil kurulması

Metastasis is the major cause of cancer death. The role of circulating tumor cells (CTCs) in promoting cancer metastasis, in which lung colonization by ...

Therapy Testing in a Spheroid-based 3D Cell Culture Model for Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

Baş ve boyun Skuamöz hücreli karsinom için bir küresel tabanlı 3D hücre kültür modelinde test terapi

Current treatment options for advanced and recurrent head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) enclose radiation and chemo-radiation approaches with ...

Enrichment and Characterization of the Tumor Immune and Non-immune Microenvironments in Established Subcutaneous Murine Tumors

Zenginleştirme ve kurulan subkutan fare tümör tümör bağışıklık ve Non-immün Microenvironments karakterizasyonu

The tumor immune microenvironment (TIME) has recently been recognized as a critical mediator of treatment response in solid tumors, especially for ...

Live Cell Imaging of the TGF-	&beta;/Smad3 Signaling Pathway In Vitro and In Vivo Using an Adenovirus Reporter System

Live Cell Imaging of the TGF-	ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²/Smad3 Signaling Pathway In Vitro and In Vivo Using an Adenovirus Reporter System

Hücre görüntüleme TGF-β/Smad3 sinyal yolu Vitro ve Adenovirus muhabir sistemiyle Vivo içinde yaşamak

Transforming Growth Factor &#946; (TGF-&#946;) signaling regulates many important functions required for cellular homeostasis and is commonly found ...

Assessing Cell Viability and Death in 3D Spheroid Cultures of Cancer Cells

Hücre viability ve ölüm kanser hücrelerinin 3D Küroid kültürlerde değerlendirilmesi

Three-dimensional spheroids of cancer cells are important tools for both cancer drug screens and for gaining mechanistic insight into cancer cell biology. ...

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

Mide kanseri hasta-türetilen xenograft modelleri ve primer hücre hatları kurulması

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

In Vitro Assay to Study Tumor-macrophage Interaction

In vitro assay tümör çalışma-macrophage etkileşim

Tumor associated macrophages (TAMs) account for a large percentage of cells in the tumor mass for different types of cancers. Glioblastoma (GBM), a ...