Name: detecting establishment of shared blood supply in parabiotic mice by caudal vein glucose injection
Uploaded: 2020-02-06T12:30:00
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Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Nature Science Foundation of China (81570399 e 81773735), dal National Key Research and Development Program of China - Traditional Medicine Modernization Research (2017YFC1702003) e da Hei Long Jiang Eccezionale Fondo scientifico giovanile (JC2017020).

Tutte le procedure che coinvolgono gli animali e la loro cura sono state approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università di Harbin Medical.
NOTA: gli strumenti e le attrezzature necessari per il metodo sono elencati nella Tabella dei materiali.
1. Preparazione di materiali e animali
<ol><li>Ordinare c57BL/6 topi maschi con peso compreso tra 20 g-25 g da un fornitore di animali da laboratorio standard.</li>
	...

<ol>
	<li>Baruch, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging-induced+type+I+interferon+response+at+the+choroid+plexus+negatively+affects+brain+function.">Aging-induced type I interferon response at the choroid plexus negatively affects brain function.</a> Science. 346 (6205), 89-93 (2014).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positional+cloning+of+the+mouse+obese+gene+and+its+human+homologue.">Positional cloning of the mouse obese gene and its human homologue.</a> Nature. 372 (6505), 425-432 (1994).</li><li>Torres, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parabiotic+model+for+differentiating+local+and+systemic+effects+of+continuous+and+intermittent+hypoxia.">Parabiotic model for differentiating local and systemic effects of continuous and intermittent hypoxia.</a> Journal of Applied Physiology (1985). 118 (1), 42-47 (2015).</li><li>Loffredo, F. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+differentiation+factor+11+is+a+circulating+factor+that+reverses+age-related+cardiac+hypertrophy.">Growth differentiation factor 11 is a circulating factor that reverses age-related cardiac hypertrophy.</a> Cell. 153 (4), 828-839 (2013).</li><li>Kamran, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parabiosis+in+mice:+a+detailed+protocol.">Parabiosis in mice: a detailed protocol.</a> Journal of Visualized Experiments. (80), e50556 (2013).</li><li>Conboy, M. J., Conboy, I. M., Rando, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterochronic+parabiosis:+historical+perspective+and+methodological+considerations+for+studies+of+aging+and+longevity.">Heterochronic parabiosis: historical perspective and methodological considerations for studies of aging and longevity.</a> Aging Cell. 12 (3), 525-530 (2013).</li><li>Eggel, A., Wyss-Coray, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+revival+of+parabiosis+in+biomedical+research.">A revival of parabiosis in biomedical research.</a> Swiss Medical Weekly. 144, w13914 (2014).</li><li>Brack, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ageing+of+the+heart+reversed+by+youthful+systemic+factors!.">Ageing of the heart reversed by youthful systemic factors!.</a> EMBO Journal. 32 (16), 2189-2190 (2013).</li><li>Wu, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+cells+contribute+to+cardiomyocyte+regeneration+after+injury.">Circulating cells contribute to cardiomyocyte regeneration after injury.</a> Circulation Research. 116 (4), 633-641 (2015).</li><li>Kaiser, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term='Rejuvenation+factor'+in+blood+turns+back+the+clock+in+old+mice.">'Rejuvenation factor' in blood turns back the clock in old mice.</a> Science. 344 (6184), 570-571 (2014).</li><li>Rando, T. A., Finkel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+aging+and+rejuvenation--a+sense+of+humors?.">Cardiac aging and rejuvenation--a sense of humors?.</a> New England Journal of Medicine. 369 (6), 575-576 (2013).</li><li>Heidt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+contribution+of+monocytes+to+heart+macrophages+in+steady-state+and+after+myocardial+infarction.">Differential contribution of monocytes to heart macrophages in steady-state and after myocardial infarction.</a> Circulation Research. 115 (2), 284-295 (2014).</li><li>McPherron, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Through+thick+and+thin:+a+circulating+growth+factor+inhibits+age-related+cardiac+hypertrophy.">Through thick and thin: a circulating growth factor inhibits age-related cardiac hypertrophy.</a> Circulation Research. 113 (5), 487-491 (2013).</li><li>Villeda, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Young+blood+reverses+age-related+impairments+in+cognitive+function+and+synaptic+plasticity+in+mice.">Young blood reverses age-related impairments in cognitive function and synaptic plasticity in mice.</a> Nature Medicine. 20 (6), 659-663 (2014).</li><li>Katsimpardi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+and+neurogenic+rejuvenation+of+the+aging+mouse+brain+by+young+systemic+factors.">Vascular and neurogenic rejuvenation of the aging mouse brain by young systemic factors.</a> Science. 344 (6184), 630-634 (2014).</li><li>Starzl, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lost+chord:+microchimerism+and+allograft+survival.">The lost chord: microchimerism and allograft survival.</a> Immunology Today. 17 (12), 577-584 (1996).</li><li>Coleman, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+historical+perspective+on+leptin.">A historical perspective on leptin.</a> Nature Medicine. 16 (10), 1097-1099 (2010).</li><li>Salpeter, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+regulation+of+the+age-related+decline+of+pancreatic+beta-cell+replication.">Systemic regulation of the age-related decline of pancreatic beta-cell replication.</a> Diabetes. 62 (8), 2843-2848 (2013).</li><li>Sheldon, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gestational+exercise+protects+adult+male+offspring+from+high-fat+diet-induced+hepatic+steatosis.">Gestational exercise protects adult male offspring from high-fat diet-induced hepatic steatosis.</a> Journal of Hepatology. 64 (1), 171-178 (2016).</li><li>Martineau, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+metabolic+profile+of+intrahepatic+cholestasis+of+pregnancy+is+associated+with+impaired+glucose+tolerance,+dyslipidemia,+and+increased+fetal+growth.">The metabolic profile of intrahepatic cholestasis of pregnancy is associated with impaired glucose tolerance, dyslipidemia, and increased fetal growth.</a> Diabetes Care. 38 (2), 243-248 (2015).</li><li>Wang, F., Liu, Y., Yuan, J., Yang, W., Mo, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compound+C+Protects+Mice+from+HFD-Induced+Obesity+and+Nonalcoholic+Fatty+Liver+Disease.">Compound C Protects Mice from HFD-Induced Obesity and Nonalcoholic Fatty Liver Disease.</a> International Journal of Endocrinology. 2019, 3206587 (2019).</li></ol>

La parabiosi si riferisce alla tecnica chirurgica di collegamento di due animali viventi per stabilire un sistema vascolare comune con mezzisperimentali 6,7,8. Il vantaggio di questo modello è che le sostanze prodotte da un singolo individuo possono agire su entrambi gli animali contemporaneamente. Così, il modello di parabiosi può essere utilizzato per esplorare il ruolo di una sostanza o fattore in una malattia correlata, p...

La parabiosi è un metodo di modellazione in cui due organismi viventi vengono uniti chirurgicamente e si sviluppano come un unico sistema fisiologico con un sistema circolatorio condiviso1. Tali modelli sono stati ampiamente utilizzati per studiare la fisiologia a causa del vantaggio che le sostanze prodotte da un singolo individuo possono agire su entrambi gli animali contemporaneamente attraverso il sistema circolatorio condiviso. Dalla metà del 1800, quando gli esperimenti parabiotici sono stati introdotti da Paul Bert2,i metodi per la costruzione di modelli parabiotici sono diventati standardizzati. Tuttavia, manca un metodo semplice e conveniente per verificare il successo dell'instaurazione del chimerismo del sangue. È stato riferito che la circolazione incrociata può essere valutata con successo iniettando intraperitonealmente 0,5% di colorante blu Eevans in uno dei parabioni seguito dalla misurazione dell'assorbimento di Evans blu nel sangue di entrambi i parabiont con un lettore di micropilla3. Un altro metodo richiede una razza ditopo specifica che contiene CD45.1 - e CD45.2-monociti etichettati in ogni parabiont. La citometria cellulare viene quindi utilizzata per determinare il chimerismo del sangue misurando la frequenza dei due marcatori nei monociti dalla milza o dal sangue4. Tuttavia, questi metodi sono spesso letali o ingombranti per gli animali, e un metodo semplice e sicuro per una verifica rapida e affidabile dei modelli parabiotici è altamente auspicabile. In questo studio, abbiamo stabilito un nuovo metodo per questo scopo, che è stato convalidato in un modello murino di parabiosi. La concentrazione di glucosio in campioni di sangue prelevati da una vena della coda viene misurata utilizzando un glucometer, e il modello dei cambiamenti del livello di glucosio nei topi donatori e riceventi è considerato un'indicazione del chimerismo della circolazione. Abbiamo chiamato questo metodo il "metodo di fluttuazione del glucosio". L'applicazione di questo metodo di convalida non è limitata ai topi, ma potrebbe essere estesa a diversi modelli patologici ad eccezione di quelli con grave disregolazione del metabolismo del glucosio. La procedura è semplice, salvaile il tempo e sicura.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>curved forceps</td>
			<td>JZ surgical Instruments, China</td>
			<td>J31340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fine scissors</td>
			<td>JZ surgical Instruments, China</td>
			<td>WA1030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>needle forcep</td>
			<td>JZ surgical Instruments, China</td>
			<td>60017961</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5 mL syringes</td>
			<td>Agilent, USA</td>
			<td>5182-9642</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tribromoethano</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>T48402-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin</td>
			<td>Solarbio, China</td>
			<td>IP0150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tramadol</td>
			<td>Yijishiye, China</td>
			<td>YJT712520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glucometer</td>
			<td>Roche Diabetes Care, Indiana</td>
			<td>Accu-Chek Active test strips</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Evan&#39;s blue Counterstain</td>
			<td>Solarbio, China</td>
			<td>G1810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>depilatory cream</td>
			<td>Nair, USA</td>
			<td>LL9161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Warming Blanket (Heating pad)</td>
			<td>Kent Scientific Corp, USA</td>
			<td>TP-22G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrical shaver</td>
			<td>Codos, China</td>
			<td>CP-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-0,5-0 
			surgical suture</td>
			<td>Shanghai Medical Suture Needle Factory, China</td>
			<td>SYZ 3-0#, SYZ 5-0#</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detecting establishment of shared blood supply in parabiotic mice by caudal vein glucose injection

La parabiosi è un metodo sperimentale per combinare chirurgicamente due animali paralleli lungo l'asse longitudinale del corpo. Vi presentiamo un protocollo per rilevare il successo del chimerismo del sangue nei parabionts da un'iniezione caudale di glucosio. Sono stati costruiti topi parabiotici. Il glucosio è stato iniettato nel topo donatore attraverso la vena della coda, e la fluttuazione del livello di glucosio nel sangue è stata misurata in entrambi i topi utilizzando un glucometer del sangue in diversi punti di tempo. I nostri risultati hanno mostrato che dopo l'iniezione di glucosio, il livello di glucosio nel sangue nei topi donatori è aumentato bruscamente dopo 1 min e è diminuito lentamente in seguito. Nel frattempo, il livello di glucosio nel sangue dei topi ricittori ha raggiunto il picco di 15 min dopo l'iniezione. Risultati simili sono stati ottenuti con Evans blu, utilizzato come un controllo positivo per il glucosio. La fluttuazione sincrona dei livelli di glucosio nel sangue indica che il flusso sanguigno tra i due topi è stato stabilito con successo.

In sei topi donatori, i livelli di glucosio nel sangue sono nettamente aumentati a 26,5 mall/L (aumento del 173%) ad una media di 1 min dopo l'iniezione di 100 l di glucosio (1,2 g/kg) attraverso la vena della coda e poi sono gradualmente diminuiti a 13,3 smol a 60 min. Nei topi ricintori, la glicemia è aumentata lentamente dopo l'iniezione e ha raggiunto il primo livello di picco a 15 min (aumento del 47%, 12,2 zol/L). Sulla base dei risultati di cui sopra, lo standard per il chimerismo...

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Detecting Establishment of Shared Blood Supply in Parabiotic Mice by Caudal Vein Glucose Injection

Qui descriviamo un nuovo metodo per rilevare la creazione di successo della circolazione condivisa del sangue di due parabionts attraverso un'iniezione di vena caudale di glucosio, che provoca danni minimi e non è fatale per i parabionts.

Rilevare l'istituzione dell'afflusso di sangue condiviso nei topi parabiotici da Caudal Vein Glucose Injection

Parabiosis is an experimental method for surgically combining two parallel animals along the longitudinal axis of the body. We present a protocol for ...

Il nostro protocollo fornisce un metodo di verifica migliorato per il chimerismo di circolazione e un metodo per una configurazione del modello di parabiosi di successo per la ricerca biomedica. Rispetto ai metodi esistenti per il rilevamento del chimerismo sanguigno in parabiosi che sono spesso letali o ingombranti, il nostro protocollo è sicuro e semplice, consentendo una verifica rapida e affidabile. Sebbene questo metodo sia specifico per il rilevamento del chimerismo sanguigno nei modelli di parabiosi, può essere applicato a qualsiasi studio biomedico che coinvolga procedure parabiotiche.Il passo più impegnativo è l'iniezione di glucosio. Pertanto, assicurarsi di praticare l'iniezione della vena della coda prima di eseguire una procedura sperimentale o utilizzare un fissatore di coda del mouse visivo venoso. Dopo aver confermato la mancanza di risposta al riflesso del pedale, posizionare due topi maschi C57 neri 6 neri da 20 a 25 grammi nella posizione supina e utilizzare un rasoio elettrico per radere accuratamente il lato sinistro di un mouse e il lato destro del secondo mouse da circa un centimetro sopra il gomito a un centimetro sotto il ginocchio.Rimuovere i capelli rimanenti con crema depilatoria prima di effettuare incisioni longitudinali della pelle nella pelle chiara di ogni animale, a partire da 0,5 centimetri sopra il gomito a 0,5 centimetri sotto l'articolazione del ginocchio e staccare delicatamente la pelle dalla fascia sottocutanea. Collegare l'olecranone e il ginocchio del parabionte con sutura 3-0 e suturare la pelle rasata con una sutura continua 5-0. Quindi iniettare per via sottocutanea 0,5 millilitri di cloruro di sodio allo 0,9% per prevenire la disidratazione e iniettare per via intramuscolare 10 milligrammi di tramadolo per 25 grammi di topo per alleviare il dolore, in ogni topo al giorno per tre giorni.Per verificare la riuscita costruzione della circolazione tra i parabionti per fluttuazione del glucosio, il 10 ° giorno dopo l'intervento di parabiosi, fissare i topi donatori in un fissatore della coda del topo visivo venoso e utilizzare un batuffolo di cotone imbevuto di etanolo dal 70 al 75% per strofinare le vene caudali sul fianco di una coda parabionte. Inserire un ago della siringa da un millilitro nella vena caudale da due a quattro centimetri dalla punta della coda e il più parallelo possibile alla vena e iniettare da uno a due grammi per chilogrammo di glucosio in 100 microlitri di soluzione salina nel donatore per un periodo di 10 secondi. Quindi utilizzare le forbici per rimuovere le dita dei piedi dal donatore e dagli animali riceventi per consentire la raccolta di una goccia di sangue in vari punti di interesse dopo l'iniezione.Quindi aggiungere una goccia di ogni campione di sangue al centro di una striscia di test del glucometro per il rilevamento del livello di glucosio. Per verificare la corretta costruzione della circolazione da parte dell'assorbanza del colorante blu Evans, iniettare 200 microlitri dello 0,5% blu Evans controsostenibili intraperitonealmente nel topo donatore e raccogliere sangue da entrambi i parabionti per puntura cardiaca dopo due ore. Separare il siero per centrifugazione e trasferire il siero in un tubo conico per la diluizione ad un rapporto uno a 50 nel cloruro di sodio allo 0,9%.Quindi misurare l'assorbanza dei campioni di siero diluiti a 620 nanometri su uno spettrofotometro. In questa analisi rappresentativa dei livelli di glucosio nel sangue in sei topi donatori, la glicemia è aumentata bruscamente a 26,5 micromolari per litro a una media di un minuto dopo l'iniezione di 100 microlitri di glucosio attraverso la vena della coda. I livelli di glucosio nel sangue sono quindi gradualmente diminuiti a 13,3 microlitri per litro a 60 minuti.Nei topi ricevente, la glicemia è lentamente aumentata dopo l'iniezione, raggiungendo il primo livello di picco a 15 minuti. La concentrazione di colorante blu Evans nel siero dei parabionti indicò anche una costruzione riuscita del chimerismo di circolazione, e le giunzioni vascolari sottocutanee tra i parabionti potevano essere chiaramente osservate. Nei parabionti che non hanno stabilito il chimerismo del sangue 15 giorni dopo l'intervento di parabiosi, i topi riceventi non hanno mostrato un aumento del livello di glucosio nel sangue entro 60 minuti dopo l'iniezione di glucosio nell'animale donatore.Anche la concentrazione di sangue di Evans blue nei due destinatari non è stata elevata, dimostrando che il metodo di fluttuazione del glucosio è sensibile come il metodo blu Evans. Inoltre, il livello di insulina nel sangue è stato notevolmente diminuito un'ora dopo l'iniezione di glucosio a causa del rapido aumento dei livelli di glucosio e recuperato a livelli normali di tre ore, indicando che gli effetti del glucosio iniettato sul metabolismo dell'insulina sono riparibili. Fare attenzione a assicurarsi che l'ago sia inserito direttamente nella vena della coda.Dopo aver confermato il chimerismo sanguigno dei parabionti con questo metodo, i cambiamenti fisiopatologici possono essere studiati negli animali parabiotici vivi.

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