Name: expression, purification, and liposome binding of budding yeast snx-bar heterodimers
Uploaded: 2019-12-06T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Expression, Purification, and Liposome Binding of Budding Yeast SNX-BAR Heterodimers at JoVE.com

وكان المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة التابع للمعاهد الوطنية للصحة تحت الجائزة رقم GM060221 وجزءا من المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة التابع للمعاهد الوطنية يدعم البحوث الواردة في هذا المنشور. الصحة تحت رقم الجائزة T32GM007223. وقد تم دعم المخيم جزئيا من قبل برنامج المنح البحثية لكليه قياده الجامعة شارلوت.

1. الخميرة سلاله البناء
<ol><li>تبدا مع TVY614 (pep4Δ:: LEU2 Prb1Δ:: Hisg prc1Δ:: HIS3)11 كسلاله الام. هذه السلالة غير كافيه فاكولار بروتياسيس, التي تسهم في غالبيه تدهور البروتين بعد تحلل الخلية, التالي يسمح لتنقيه أنظف وأكثر كفاءه.</li>
	<li>تصميم الإشعال12 ودمج ترادفية التقا?...

<ol>
	<li>Teasdale, R. D., Collins, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+the+PX+(phox-homology)+domain+and+SNX+(sorting+nexin)+protein+families:+structures,+functions+and+roles+in+disease.">Insights into the PX (phox-homology) domain and SNX (sorting nexin) protein families: structures, functions and roles in disease.</a> The Biochemical Journal. 441 (1), 39-59 (2012).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Retromer+Complex+and+Sorting+Nexins+in+Neurodegenerative+Diseases.">The Retromer Complex and Sorting Nexins in Neurodegenerative Diseases.</a> Frontiers in Aging Neuroscience. 10, 79 (2018).</li><li>Burd, C., Cullen, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retromer:+a+master+conductor+of+endosome+sorting.">Retromer: a master conductor of endosome sorting.</a> Cold Spring Harbor perspectives in Biology. 6 (2), (2014).</li><li>Chi, R. J., Harrison, M. S., Burd, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogenesis+of+endosome-derived+transport+carriers.">Biogenesis of endosome-derived transport carriers.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 72 (18), 3441-3455 (2015).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endosomal+receptor+trafficking:+Retromer+and+beyond.">Endosomal receptor trafficking: Retromer and beyond.</a> Traffic (Copenhagen, Denmark). 19 (8), 578-590 (2018).</li><li>Ma, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+trafficking+by+yeast+Snx4+family+SNX-BAR+proteins+promotes+autophagy+and+vacuole+membrane+fusion.">Lipid trafficking by yeast Snx4 family SNX-BAR proteins promotes autophagy and vacuole membrane fusion.</a> Molecular Biology of the Cell. , (2018).</li><li>van Weering, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+for+SNX-BAR-mediated+assembly+of+distinct+endosomal+sorting+tubules.">Molecular basis for SNX-BAR-mediated assembly of distinct endosomal sorting tubules.</a> The EMBO Journal. 31 (23), 4466-4480 (2012).</li><li>Chi, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fission+of+SNX-BAR-coated+endosomal+retrograde+transport+carriers+is+promoted+by+the+dynamin-related+protein+Vps1.">Fission of SNX-BAR-coated endosomal retrograde transport carriers is promoted by the dynamin-related protein Vps1.</a> The Journal of Cell Biology. 204 (5), 793-806 (2014).</li><li>Purushothaman, L. K., Arlt, H., Kuhlee, A., Raunser, S., Ungermann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retromer-driven+membrane+tubulation+separates+endosomal+recycling+from+Rab7/Ypt7-dependent+fusion.">Retromer-driven membrane tubulation separates endosomal recycling from Rab7/Ypt7-dependent fusion.</a> Molecular Biology of the Cell. 28 (6), 783-791 (2017).</li><li>Purushothaman, L. K., Ungermann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cargo+induces+retromer-mediated+membrane+remodeling+on+membranes.">Cargo induces retromer-mediated membrane remodeling on membranes.</a> Molecular Biology of the Cell. 29 (22), 2709-2719 (2018).</li><li>Wurmser, A. E., Emr, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphoinositide+signaling+and+turnover:+PtdIns(3)P,+a+regulator+of+membrane+traffic,+is+transported+to+the+vacuole+and+degraded+by+a+process+that+requires+lumenal+vacuolar+hydrolase+activities.">Phosphoinositide signaling and turnover: PtdIns(3)P, a regulator of membrane traffic, is transported to the vacuole and degraded by a process that requires lumenal vacuolar hydrolase activities.</a> The EMBO journal. 17 (17), 4930-4942 (1998).</li><li>Puig, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tandem+affinity+purification+(TAP)+method:+a+general+procedure+of+protein+complex+purification.">The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification.</a> Methods. 24 (3), 218-229 (2001).</li><li>Kushnirov, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+reliable+protein+extraction+from+yeast.">Rapid and reliable protein extraction from yeast.</a> Yeast. 16 (9), 857-860 (2000).</li><li>Longtine, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Additional+modules+for+versatile+and+economical+PCR-based+gene+deletion+and+modification+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Additional modules for versatile and economical PCR-based gene deletion and modification in Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 14 (10), 953-961 (1998).</li><li>Tropea, J. E., Cherry, S., Waugh, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+purification+of+soluble+His(6)-tagged+TEV+protease.">Expression and purification of soluble His(6)-tagged TEV protease.</a> Methods in Molecular Biology. 498, 297-307 (2009).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphology+and+structure+of+lipoproteins+revealed+by+an+optimized+negative-staining+protocol+of+electron+microscopy.">Morphology and structure of lipoproteins revealed by an optimized negative-staining protocol of electron microscopy.</a> Journal of Lipid Research. 52 (1), 175-184 (2011).</li><li>Yong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+purification+of+the+SNX1/SNX6+complex.">Expression and purification of the SNX1/SNX6 complex.</a> Protein Expression and Purification. 151, 93-98 (2018).</li></ol>

هنا ، ونحن نظهر سير العمل الأمثل لتنقيه الدمامل SNX-بار في الخميرة واثنين من المقايسات لتقييم خصائصها الفيزيائية الحيوية علي الدهنيات الاصطناعية. الميزة الرئيسية علي التعبير البروتين المؤتلف نموذجيه في القولونية أو غيرها من النظم هو القدرة علي التعبير بالتساوي SNX-بار البروتينات في ا?...

تتكون الاغشيه العضوية المرتبطة بالغشاء مثل غشاء البلازما ، والشبكية الاندوبلازميه ، وجهاز غولجي ، وليسوسوم (خميرة فجوه) ، والتنظير الباطني من نظام اندومومبرن للخلية النواة. معظم العضيات لديها القدرة علي التواصل وتبادل المواد مع العضيات أخرى من خلال ناقلات النقل حويصلة. كيف تنسق الخلية التعبئة والتغليف وتشكيل ناقلات النقل فيسيل داخل نظام اندوممبراني ليست مفهومه جيدا. ومع ذلك ، فان البروتينات والدهون التي تشكل جزءا كبيرا من نظام اندومبراني معروفه بأنها تنشا من الحويصلات الباطنية الداخلية من غشاء البلازما (PM). التنظير الباطني هو العضو الأول العضوي لهذه الحويصلات ويتكون من مجموعات مترابطة متعددة من الأرغن الأنبوبي. وتتمثل الوظيفة الرئيسية للتنظير الباطني في تسهيل اكتساب المغذيات ، وتنظيم دوران البروتين والدهون ، والحماية من العدوى المسببة للمرض ، والعمل كمصدر أساسي لتغذيه الدهون في غشاء البلازما. وبما ان التنظير الباطني يتلقى الجزء الأكبر من بروتينات البضائع والدهون من غشاء البلازما ، فانه يعمل كحجره فرز عن طريق عزل الشحنات في ناقلات النقل الانبوبيه الباطنية (ETCs). اي البروتينات التي لا يتم عزلها في ETCs متروكة لتكون المتدهورة عن طريق نظام اندو-lysosomal مال. يمكن ان يؤدي خلل الفرز البضائع إلى etcs إلى فقدان امتصاص المواد الغذائية ، ودوران البروتين أو التوازن الدهون ، مما ادي إلى العديد من الأيض ، والنمو ، والاضطرابات العصبية1،2. ومع ذلك ، علي الرغم من الدور المركزي لشركه ETCs في التنظير الباطني ، فان اليه الاساسيه لكيفيه تنسيق التنظير الباطني بشكل انتقائي لتعبئة العديد من الشحنات غير المتجانسة في ناقلات أنبوبيه غير معروفه.
الفرز nexin (snx) الاسره هي فئة المحافظة التطورية من البروتينات التي تم العثور علي ان تكون حاسمه بالنسبة للعديد من ردود الفعل النقل حويصلة في الخلية3,4,5. يتم تعيين nexins الفرز إلى غشاء التنظير الباطني والمعونة في التقاط البضائع عن طريق النطاق المميز phox الخاصة بهم (PX) ، والذي يربط فوسفتيدلينوستول-3-مونوفوسفات (PtdIns (3) P) ، وهو الدهون المخصب علي غشاء التنظير الباطني. الثدييات ترميز 33 SNX البروتينات ، والتي يمكن تقسيمها إلى عائلات فرعيه متعددة ، وفقا لوجود مجالات أخرى1. وعلي وجه الخصوص ، فان العائلة الفرعية snx-BAR هي أكبر عائله فرعيه تتكون من اثني عشر في الإنسان ، بينما في الخميرة الناشئة ، ساكاروميسز سيريفيسياي، يتم تقليل العائلة الفرعية إلى سبعه أشرطه snx فقط. البروتينات SNX-بار لديها كل من مجال PX والمجال بن البرمائيات-Rvs (شريط) الذي يحفز الخزانات الدهون لربط الاغشيه انحناء ايجابيه. التالي ، فان SNX-بار الاسره لديها تقارب الطبيعية لل التنظير الباطني ويمكن التوسط تشكيل ETC عبر الغشاء قدراتهم أعاده عرض. في المختبر ، وأعاده عرض خصائص SNX-الحانات يمكن ان يكون مستحثا باضافه SNX المنقي القضبان إلى الدهنيات الاصطناعية وتشكيل اللاحقة من الأنابيب المغلفة الضيقة ، يمكن تصورها بواسطة المجهر الكتروني. باستخدام هذه الأساليب ، وقد قرر الباحثون ان كلا من تركيز القلة وقوه انقباض يبدو ان تختلف بين الاسره SNX-بار مما يوحي بأنها يمكن ان تساعد في تشكيل والانشقاق من ETCs.
يمكن تصنيف الاشرطه SNX بحسب خصائصها الحصرية. وقد أثبتت الاختبارات الملزمة في المختبر والدراسات الهيكلية ان البروتينات SNX-BAR يمكن ان تشكل فقط المنازل الخاصة أو المتغايرة. لذلك ، من حيث المبدا ، يمكن لكل المحتملة SNX-بار dimer-اوليغمير توفير معطف توبولي لمسار الاتجار بالبضائع محدده المثل ، وتقييد القلة من الآخرين SNX-بار بروتومرات ، يمكن أيضا تحديد مسارات التصدير متميزة. ومع ذلك ، نظرا للعدد الكبير من القضبان SNX والتنوع داخل الاسره SNX ، واحده الفرز nexin-واحد فرضيه البضائع من غير المحتمل جدا. بدلا من ذلك الجهد المنسق باستخدام العديد من العوامل مثل القضبان SNX ، والبضائع ، وخصوصية الدهون وغيرها من التبعيات أكثر احتمالا. المثل ، كشفت الدراسات الاخيره من الخميرة SNX4 الاسره الادله علي خصوصية اضافيه الدهون ، وخارج PtdIns (3) ف ، لتحفيز ناقلات النقل الباطني6. في هذه الدراسة ، تم تنقيه SNX-بار homodimer Mvp1-Mvp1 من البكتيريا والاصليه غير المتجانسة Snx4-Atg20 وتم التعبير عن Vps5 وتنقيتها في الغلة العالية من الخميرة ، في حين تم العثور فقط Vps17-Snx4 لربط بشكل تفضيلي فسفاتيديل (PS) وتشكيل ضيق أنبوب مثل الهياكل في الدراسات ملزمه ليبوسوم6. في حين ان البعض الآخر في الميدان قد كشفت عن خصائص هامه من القضبان snx-باستخدام ريكومبينانتلي تنقيه snx-شريط الhomodimers من البكتيريا ، والسمية المرتبطة بالتعبير عن snx-شريط التباينات في نظم مماثله أعاقت توصيف الأصلي7،8،9،10. ولذلك ، من دون نظام موثوق به للحصول علي ريكومبينانتلي نقيه الاصليه التي أعرب عنها ، يجب علي الباحثين التخلي عن هذه الخطوط من التحقيق. في الشكل 1، نقدم سير عمل من أربعه أجزاء إلى 1) بناء سلاله الخميرة overodimers snx-بار لتنقيه تقارب ترادفي ، 2) التعبير عن وتنقيه الأصلي snx-شريط مغاير ، 3) اعداد الدهنيات الاصطناعية اونياميلار ، و 4) اعداد الأنابيب الشحمية أو مقايسة الترسبات ، وتوفير أداه حيوية للباحثين للتحقيق في الكتالوج المتزايد من الفرز nexins وجدت في الطبيعة.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 micrometer PC Membranes</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>610006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Poly-Prep Chromatography column (Bio-Rad)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>731-1550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27 Gauge needle</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>301629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra Centrifugal Filter with 10K cutoff</td>
			<td>Amicon</td>
			<td>UFC501024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avestin EmulsiFlex-C3 Homogenizer</td>
			<td>Avestin</td>
			<td>EF-C3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA assay</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman Optima MAX-XP Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>393315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4693116001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOPC</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>850375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOPS</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>840035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ergosterol (Sigma)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>47130-U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extruder Set with Block 0.2 microlter/1mL</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>610000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">FEI Tecnai F20 transmission electron microscope (200 kV)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass culture tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>47729-570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG sepharose beads (GE Healthcare)</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0969-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microlter glass syringes</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>7637-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New Brunswick Excella E25</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>M1353-0000</td>
			<td>or equivalent shaking 30 C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA Magnetic Agarose Beads</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>78605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima XE-90 Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A94516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M</td>
			<td>VWR</td>
			<td>52858-076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PI3P</td>
			<td>Echelon</td>
			<td>P-3016</td>
			<td>or Echelon equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate bottle assembly</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>355622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLA-100 Fixed-Angle Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>343840</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type 45 Ti Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Desiccator, Bottom and Lid with Socket Valve</td>
			<td>VWR</td>
			<td>75871-436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Pump Alcatel (Pascal 2005 C1)</td>
			<td>A&#38;J Vacuum</td>
			<td>PN07050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex with foam holder</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10153-838</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR KIT MICROTUBE</td>
			<td>VWR</td>
			<td>12620-880</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

expression, purification, and liposome binding of budding yeast snx-bar heterodimers

البروتينات SNX-بار هي فئة المحافظة التطورية من غشاء أعاده عرض البروتينات التي تلعب أدوارا رئيسيه في الفرز والاتجار في البروتين والدهون اثناء كثرة المحببات ، والفرز داخل النظام الداخلي ، والاوتوهاغي. المركزية ل SNX-شريط وظيفة البروتين هو القدرة علي تشكيل المنازل المتماثلة أو المغايرة التي تربط الاغشيه باستخدام المحفوظة للغاية phox-homology (PX) وبار (بن/البرمائيات/Rvs) المجالات. الاضافه إلى ذلك ، يمكن ان القلة من الدمامل SNX-بار علي الاغشيه انتزاع تشكيل الأنابيب الغشائية والحويصلات ويعتقد هذا النشاط لتعكس وظائفها كما البروتينات معطف لشركات النقل المستمدة من التنظير الباطني. وقد استخدم الباحثون لفتره طويلة في دراسات ملزمه المختبر باستخدام المؤتلف SNX-بار البروتينات علي الدهنيات الاصطناعية أو الحويصلات العملاقة يونيلاميلار (GUVs) للكشف عن ماكياج دقيق من الدهون اللازمة لدفع أعاده عرض الغشاء ، التالي الكشف عن أليتها للعمل. ومع ذلك ، نظرا للتحديات التقنية مع أنظمه التعبير المزدوج ، وسميه التعبير البروتين SNX-بار في البكتيريا ، وضعف الذوبان من البروتينات SNX-بار الفردية ، وقد درست معظم الدراسات حتى الآن المتماثلات SNX-بار ، بما في ذلك الدمامل غير الفسيولوجية التي تشكل اثناء التعبير في الاونه الاخيره ، قمنا بتحسين بروتوكول للتغلب علي أوجه القصور الرئيسية لنظام التعبير البكتيري النموذجي. باستخدام سير العمل هذا ، ونحن شرح كيفيه التعبير بنجاح وتنقيه كميات كبيره من التباينات SNX-بار وكيفيه أعاده تشكيلها علي الدهنيات الاصطناعية لاختبارات ملزمه والأنابيب.

يصف هذا البروتوكول طريقه للإنتاج وإنتاج قوي من الخميرة الذاتية SNX-بار المجمعات التي يمكن استخدامها لأعاده عرض الغشاء المصب الاختبارات (الشكل 1). بناء سلاله الخميرة المستخدمة لتنقيه يستفيد من كفاءه أعاده الدمج المتماثل في الخميرة الناشئة ، مما يسمح للتعدي...

Watch this Scientific Journal Video about Expression, Purification, and Liposome Binding of Budding Yeast SNX-BAR Heterodimers at JoVE.com

Expression, Purification, and Liposome Binding of Budding Yeast SNX-BAR Heterodimers

هنا ، ونحن نقدم سير العمل للتعبير ، وتنقيه وربط الشحمية من SNX-شريط المغايرة في الخميرة.

التعبير ، وتنقيه ، وملزمه ليبوسوم من الخميرة الناشئة SNX-شريط مغاير

SNX-BAR proteins are an evolutionarily conserved class of membrane remodeling proteins that play key roles in sorting and trafficking of protein and ...

SNX-BARs هي بروتينات إعادة عرض الأغشية التي تلعب أدوارًا رئيسية في أمراض الإنسان. باستخدام أساليبنا، يمكننا تحديد خصائصها الفيزيائية الحيوية الدقيقة لتسهيل ربط الدهون وإعادة عرض الأغشية. تنقية البروتينات SNB-BAR من خلايا الخميرة يسمح الحصول على الأم homo و هيترو SNX-BAR الدايمات مع التقليل من السمية والذوبان كثيرا ما تواجه مع نظم التعبير غير الأصلية.يمكن استخدام أساليبنا لفهم خصوصيات الدهون في جميع الخميرة SNX-BARs أو لإنتاج بروتينات SNX-BAR المؤتلفة من أي كائن حي آخر. تجميع الطارد الصحيح ضروري لمنع فقدان الدهون خلال عملية البثق. بالنسبة للطلاب المبتدئين أو الجدد في هذا المجال، فإن مراقبة الخطوات الأكثر أهمية بشكل كبير، سوف تحسن فرص نجاحك.تبدأ من قبل تلقيح مسحة كبيرة من خلايا الخميرة في قارورة لا يقل عن أربعة أضعاف حجم الثقافة التي تحتوي على 50 ملليلتر من المتوسط YP القياسية تكملها 2٪ رافينوز و 0.1٪ الجلوكوز كمصدر للكربون وتنمو الثقافة بين عشية وضحاها في شاكر 30 درجة مئوية. في صباح اليوم التالي، تلقيح 50 ملليلتر قبل الثقافة في لتر واحد من المتوسط YP القياسية مع 2٪ رافينوز و 0.1٪ الجلوكوز في حجم 2.8 لتر حيرت قارورة فرنباخ لثقافة أربع إلى خمس ساعات في حاضنة تهتز. عندما تصل الكثافة البصرية في 600 نانومتر 0.2، إضافة جالاكتوز إلى تركيز نهائي من 2٪ إلى الخلايا لثقافة بين عشية وضحاها في حاضنة اهتزاز.في صباح اليوم التالي، حصاد الخلايا عن طريق الطرد المركزي ونقل بيليه الخميرة إلى أنبوب مخروطي 50 ملليلتر. Resuspend بيليه في 15 ملليلتر من العازلة تنقية لتحقيق حجم النهائي من حوالي 30 ملليلتر وتحميل تعليق الخلية على التجانس مبردة إلى أربع درجات مئوية. Lyse العينات في 20 إلى 25، 000 جنيه لكل بوصة مربعة لمدة جولتين إلى ثلاث جولات ونقل lysate إلى أنبوب مخروطي جديد 50 ملليلتر على الجليد.مسح الخلية فورا عن طريق الطرد المركزي ونقل بعناية عظمى في أنبوب جديد. المقبل، موازين 300 ميكرولترات من الخرز IgG Sepharose مع ثلاثة إعادة تعليق في العازلة تنقية قبل إضافة الخرز إلى الخلية مسح lysate لاحتضان لمدة ساعتين مع الدورية في أربع درجات مئوية. في نهاية الحضانة، إضافة الخرز إلى عمود كروماتوغرافيا 10 ملليلتر والسماح للlysate غير منضمة للتدفق من خلال.غسل الخرز 10 مرات مع ملليلتر واحد من مخزن الغسيل في غسل السماح لكل غسل لتدفق من خلال تماما قبل إضافة وحدة التخزين المقبل. بعد الغسيل الأخير، استخدم ماصة ومخزنًا مؤقتًا جديدًا لنقل الخرز إلى أنبوب ميكرووستريفوغ. جلب الحجم الإجمالي للخرز إلى 500 ميكرولترات مع العازلة غسل الطازجة وإزالة الخرز من lysate مع اثنين من microliters من 10 ملليغرام لكل ملليلتر TEV protease لاحتضان بين عشية وضحاها مع التناوب في أربع درجات مئوية.في صباح اليوم التالي، استخدم إبرة قياس 27 لإزالة ناظر تماما وتقييم نقاء البروتين بنسبة 10٪ بولياكريلاميد SDS الصفحة. ثم كمي البروتينات المركزة باستخدام تحليل البروتين برادفورد وفقا للبروتوكولات القياسية وتخزين البروتين لمدة تصل إلى أسبوع واحد في أربع درجات مئوية. لإعداد الدهون، واستخدام الحقن الزجاجية لنقل الدهون الأسهم في أنبوب ثقافة الزجاج نظيفة لتحقيق خليط الدهون النهائي من 1٪ فوسفاتيديلينوزيتول-3-الفوسفات، 20٪ ergosterol، 30٪ فوسفاتيديلسيرين، فوسفاتيديلكولين كما هو مبين في الجدول.اعتمادا على المذيبات يتم إعادة تعليق كل الدهون في, قد يتحول الخليط غائما عند إضافة كل الدهون. جفف بعناية في خليط الدهون عن طريق توجيه منخفض التدفق غاز النيتروجين في الخلائط في حركة دائرية لعلاج الدهون بشكل موحد في الجزء السفلي من الأنبوب الزجاجي. ثم التفاف أنبوب الثقافة الزجاجية مع احباط ترك فتح كشف وتجفيف مزيد من الدهون في فراغ لمدة ساعة واحدة.في نهاية الحضانة، إضافة 400 ميكرولتردات من العازلة ملزمة لكل قارورة لإعادة ترطيب الدهون تماما في تركيز ليبوسومات النهائي من 2.5 ملليمولار قبل إعادة تعليق الدهون بسرعة متوسطة على دوامة في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. وينبغي أن تصبح عازلة غائمة كما يتم إعادة تعليق الدهون. نقل liposomded resuspended إلى أنبوب microcentrifuge وتجميد الأنابيب في النيتروجين السائل تليها ذوبان في حمام الماء 37 درجة مئوية سبع إلى ثماني مرات.في غطاء الدخان الكيميائي، تنظيف اثنين من المحاقن الزجاج ملليلتر مع حجم كامل من الكلوروفورم ثلاث مرات لكل حقنة لإزالة أي الدهون المتبقية وتكسيد كل حقنة مع اثنين من وحدات التخزين من الماء فائقة السخاء واثنين من كميات من العازلة ملزمة. تجميع مصغرة الطارد وفقا لتوصيات الشركة المصنعة. ثم غمر قطعتين من دعم التصفية في غشاء نانومتر واحد 200 في العازلة ملزمة.من المهم تجميع الطارد المصغر بحيث يكون محكم الإغلاق تمامًا. وطريقة جيدة للتحقق من وجود تسرب هو تمرير المخزن المؤقت من خلال الجهاز. شطيرة الغشاء بين مرشح يدعم ووضع الغشاء في مصغرة الطارد.باستخدام واحدة من المحاقن ملليلتر واحد مُعدّل، تمرير حجم من العازلة ملزمة مماثلة لحجم خليط liposome من خلال طارد صغير واستخدام حقنة أخرى لإسقاط خليط liposome عكس أنبوب microcenters لجمع آخر من liposomes في غطاء أنبوب لجمعها. ثم قذف الدهون من خلال 200 نانومتر غشاء 19 إلى 21 مرة وجمع ليبوسومات مقذوف في أنبوب جديد microcentrifuge. قبل تنفيذ SNX-BAR liposome ملزمة ومقايسات الأنابيب، قبل مسح البروتين النقي عن طريق الطرد الفائق ونقل المناطر إلى أنبوب جديد microcentrifuge دون إزعاج بيليه.المقبل، احتضان أربعة micromolar من تنقية SNX4-ATG20 و 2.5 ملليمتر من liposomes في حجم التفاعل الكلي من 20 ميكرولترتر لاحتضان لمدة 30 دقيقة في 30 درجة مئوية. لتصور كمي ونبياض الدهون، في نهاية الحضانة، الفور بقعة العينات على شبكة شبكة النحاس المغلفة بالكربون وصمة عار سلبية مع 1٪ أورانيل خلات. ثم تحليل العينات على المجهر الإلكتروني انتقال في 200 كيلوفولت.بالنسبة لربط الليبوسومات والترسب، قم بنقل 20 ميكرولترات من التفاعل مع أنبوب طرد مركزي بولي كربونات وتدور العينة مع جهاز توجيه متوافق في الطرد الفائق. في نهاية الطرد المركزي ، ونقل بعناية سوبربير إلى أنبوب جديد microcentrifuge وإعادة ربط بيليه في 40 ميكرولترات من المخزن المؤقت عينة الصفحة SDS. نقل تعليق بيليه إلى أنبوب جديد microcentrifuge وإضافة 20 ميكرولترات من العازلة عينة إلى supernatant.ثم تحميل ما يعادل كميات العينة من بيليه وsupernatant على 10٪ polyacrylamide SDS هلام الصفحة وتنفيذ Coomassie تلطيخ لتصور SNX-BARs ملزمة liposomes. للتحقق من الحث السليم للتعبير SNX-BAR، يمكن استخدام لطخة غربية ضد علامة تنقية تقارب جنبا إلى جنب كما قد لا يتم الكشف عن مستويات البروتين من SNX-BARs عن طريق وصمة عار Coomassie. بعد تنقية heterodimer SNX-BAR، يجب أن تظهر نطاقات SNX-BARs في نسبة واحد إلى واحد stoichiometric وينبغي أن يكون هناك القليل من أي نطاقات ملوثة.في هذا التحليل التمثيلي، تم التعبير عن الهتيروديمر SNX-BAR، وتنقيته، ومقيدة بالليبوسومات الاصطناعية كما هو مبين. لاحظ أن MVP1 شكلت متجانسات وتم التعبير عنها في البكتيريا كما هو متوقع. يمكن قياس SNX-BAR ملزم للتراكيب الدهنية المختلفة كمياً قياس الكثافة لتقييم آثار فوسفاتيديلسرين على سبيل المثال على ربط الليبوسومات.التصوير المجهري للإلكترون يسمح بقياس أنابيب SNX4-ATG20 للزى مع معظم الأنابيب التي تمتلك عادة أقطار ما بين 14 إلى 26 نانومتر. لاحظ أنه يمكن إعادة تشكيل SNX-BARs المنقاة مع مجمعات التقاط البضائع على الليبوزومات لفهم كيف يمكن أن تؤثر التجميعات الكاملة على إعادة عرض الأغشية. عند مقارنة ربط تركيبات مختلفة من التميمات SNX-BAR المنقية إلى الدهون الاصطناعية التي تتألف من الدهون المختلفة، تم العثور على بروتينات SNX-BAR لامتلاك تفضيلات متميزة ربط الدهون.اعمل دائماً في غطاء محرك السيارة عند التعامل مع الكلوروفورم وتأكد من ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة عند التعامل مع المواد الحادة أو الزجاجية.

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetic Engineering of an Unconventional Yeast for Renewable Biofuel and Biochemical Production

الهندسة الوراثية من الخميرة غير تقليدية للالمتجددة الوقود الحيوي وإنتاج البيوكيميائية

Yarrowia lipolytica is a non-pathogenic, dimorphic and strictly aerobic yeast species. Owing to its distinctive physiological features and metabolic ...

Analysis of Cap-binding Proteins in Human Cells Exposed to Physiological Oxygen Conditions

تحليل البروتينات ملزم كاب في خلايا الإنسان تتعرض لظروف الأوكسجين فسيولوجية

Translational control is a focal point of gene regulation, especially during periods of cellular stress. Cap-dependent translation via the eIF4F complex ...

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

المستهدفة<em&gt; في الموقع</em&gt; الطفرات من هيستون الجينات في مهدها الخميرة

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting ...

Production and Purification of Baculovirus for Gene Therapy Application

إنتاج وتنقية باكولوفيروس لتطبيق العلاج الجيني

Baculovirus has traditionally been used for the production of recombinant protein and vaccine. However, more recently, baculovirus is emerging as a ...

Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere

استكشاف ميكروبيومي الجذر: استخراج البيانات المجتمع البكتيرية من التربة، ورهيزوسفيري، واندوسفيري الجذر

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to ...

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization (smFISH) Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

التهجين في الموقع Fluorescence جزيء واحد (سمفيش) التحليل في مهدها الخميرة النمو الخضري والانقسام الاختزالي

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect ...

Informatic Analysis of Sequence Data from Batch Yeast 2-Hybrid Screens

تحليل بيانات تسلسل من دفعة الخميرة 2-الهجين شاشات المعلوماتي

We have adapted the yeast 2-hybrid assay to simultaneously uncover dozens of transient and static protein interactions within a single screen utilizing ...

Mating-based Overexpression Library Screening in Yeast

فحص مكتبة Overexpression المستندة إلى التزاوج في الخميرة

Budding yeast has been widely used as a model in studying proteins associated with human diseases. Genome-wide genetic screening is a powerful tool ...

A Deep-sequencing-assisted, Spontaneous Suppressor Screen in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe

A Deep-sequencing-assisted, Spontaneous Suppressor Screen in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe

شاشة القامع عميق--التسلسل-ساعد، عفوية في "انشطار الخميرة" شيزوساكتشاروميسيس بومبي

A genetic screen for mutant alleles that suppress phenotypic defects caused by a mutation is a powerful approach to identify genes that belong to closely ...

Enhanced Yeast One-hybrid Screens To Identify Transcription Factor Binding To Human DNA Sequences

شاشات الهجين واحد الخميرة المحسنة لتحديد عامل النسخ ملزمة لتسلسل الحمض النووي البشري

Identifying the sets of transcription factors (TFs) that regulate each human gene is a daunting task that requires integrating numerous experimental and ...