Name: expression, purification, and liposome binding of budding yeast snx-bar heterodimers
Uploaded: 2019-12-06T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Expression, Purification, and Liposome Binding of Budding Yeast SNX-BAR Heterodimers at JoVE.com

Forskning rapporteret i denne publikation blev støttet af National Institute of General Medical Sciences af National Institutes of Health under tildeling nummer GM060221 og til dels af National Institute of General Medical Sciences af de nationale institutter Sundhedstilstand under tildelings nummer T32GM007223. R.C. blev delvist støttet af UNC-Charlotte Fakultets Forskningstilskuds program.

1. gær stamme konstruktion
<ol><li>Begynd med TVY614 (pep4Δ:: LEU2 Prb1Δ:: hisg prc1Δ:: HIS3)11 som den overordnede stamme. Denne stamme er mangelfuld for vakuolære proteaser, som bidrager til størstedelen af protein nedbrydning efter cellelyse, og derfor giver mulighed for en renere og mere effektiv rensning.</li>
	<li>Design primere12 og Integrer tandem affinitet rensning (TAP) tag ved C-endestation af Atg20 (snx-bar ORF 1) ved hjælp af...

<ol>
	<li>Teasdale, R. D., Collins, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+the+PX+(phox-homology)+domain+and+SNX+(sorting+nexin)+protein+families:+structures,+functions+and+roles+in+disease.">Insights into the PX (phox-homology) domain and SNX (sorting nexin) protein families: structures, functions and roles in disease.</a> The Biochemical Journal. 441 (1), 39-59 (2012).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Retromer+Complex+and+Sorting+Nexins+in+Neurodegenerative+Diseases.">The Retromer Complex and Sorting Nexins in Neurodegenerative Diseases.</a> Frontiers in Aging Neuroscience. 10, 79 (2018).</li><li>Burd, C., Cullen, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retromer:+a+master+conductor+of+endosome+sorting.">Retromer: a master conductor of endosome sorting.</a> Cold Spring Harbor perspectives in Biology. 6 (2), (2014).</li><li>Chi, R. J., Harrison, M. S., Burd, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogenesis+of+endosome-derived+transport+carriers.">Biogenesis of endosome-derived transport carriers.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 72 (18), 3441-3455 (2015).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endosomal+receptor+trafficking:+Retromer+and+beyond.">Endosomal receptor trafficking: Retromer and beyond.</a> Traffic (Copenhagen, Denmark). 19 (8), 578-590 (2018).</li><li>Ma, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+trafficking+by+yeast+Snx4+family+SNX-BAR+proteins+promotes+autophagy+and+vacuole+membrane+fusion.">Lipid trafficking by yeast Snx4 family SNX-BAR proteins promotes autophagy and vacuole membrane fusion.</a> Molecular Biology of the Cell. , (2018).</li><li>van Weering, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+for+SNX-BAR-mediated+assembly+of+distinct+endosomal+sorting+tubules.">Molecular basis for SNX-BAR-mediated assembly of distinct endosomal sorting tubules.</a> The EMBO Journal. 31 (23), 4466-4480 (2012).</li><li>Chi, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fission+of+SNX-BAR-coated+endosomal+retrograde+transport+carriers+is+promoted+by+the+dynamin-related+protein+Vps1.">Fission of SNX-BAR-coated endosomal retrograde transport carriers is promoted by the dynamin-related protein Vps1.</a> The Journal of Cell Biology. 204 (5), 793-806 (2014).</li><li>Purushothaman, L. K., Arlt, H., Kuhlee, A., Raunser, S., Ungermann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retromer-driven+membrane+tubulation+separates+endosomal+recycling+from+Rab7/Ypt7-dependent+fusion.">Retromer-driven membrane tubulation separates endosomal recycling from Rab7/Ypt7-dependent fusion.</a> Molecular Biology of the Cell. 28 (6), 783-791 (2017).</li><li>Purushothaman, L. K., Ungermann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cargo+induces+retromer-mediated+membrane+remodeling+on+membranes.">Cargo induces retromer-mediated membrane remodeling on membranes.</a> Molecular Biology of the Cell. 29 (22), 2709-2719 (2018).</li><li>Wurmser, A. E., Emr, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphoinositide+signaling+and+turnover:+PtdIns(3)P,+a+regulator+of+membrane+traffic,+is+transported+to+the+vacuole+and+degraded+by+a+process+that+requires+lumenal+vacuolar+hydrolase+activities.">Phosphoinositide signaling and turnover: PtdIns(3)P, a regulator of membrane traffic, is transported to the vacuole and degraded by a process that requires lumenal vacuolar hydrolase activities.</a> The EMBO journal. 17 (17), 4930-4942 (1998).</li><li>Puig, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tandem+affinity+purification+(TAP)+method:+a+general+procedure+of+protein+complex+purification.">The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification.</a> Methods. 24 (3), 218-229 (2001).</li><li>Kushnirov, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+reliable+protein+extraction+from+yeast.">Rapid and reliable protein extraction from yeast.</a> Yeast. 16 (9), 857-860 (2000).</li><li>Longtine, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Additional+modules+for+versatile+and+economical+PCR-based+gene+deletion+and+modification+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Additional modules for versatile and economical PCR-based gene deletion and modification in Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 14 (10), 953-961 (1998).</li><li>Tropea, J. E., Cherry, S., Waugh, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+purification+of+soluble+His(6)-tagged+TEV+protease.">Expression and purification of soluble His(6)-tagged TEV protease.</a> Methods in Molecular Biology. 498, 297-307 (2009).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphology+and+structure+of+lipoproteins+revealed+by+an+optimized+negative-staining+protocol+of+electron+microscopy.">Morphology and structure of lipoproteins revealed by an optimized negative-staining protocol of electron microscopy.</a> Journal of Lipid Research. 52 (1), 175-184 (2011).</li><li>Yong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+purification+of+the+SNX1/SNX6+complex.">Expression and purification of the SNX1/SNX6 complex.</a> Protein Expression and Purification. 151, 93-98 (2018).</li></ol>

Her demonstrerer vi en optimeret arbejdsgang for at rense SNX-BAR-dimere i gær og to assays for at evaluere deres biofysiske egenskaber på syntetiske Liposomer. Den største fordel i forhold til typisk rekombinant protein udtryk i Escherichia coli eller andre systemer er evnen til jævnt at udtrykke snx-bar proteiner i en indfødt vært, således at undgå toksicitet og inopløselighed spørgsmål fundet i RENSENDE Snx-barer i andre systemer. Det er også bemærkelsesværdigt, at vores system ikke kræver Mole...

Membranbundne organeller såsom plasma membranen, endoplasmatiske reticulum, Golgi-apparatet, lysosom (gær vakuole) og endosome udgør endomembrane-systemet i eukaryote-cellen. De fleste organeller har evnen til at kommunikere og udveksle materiale med andre organeller gennem vesikle transport bærere. Hvordan cellen koordinerer emballering og dannelse af vesikle transport bærere inden for endomembrane systemet er ikke godt forstået. Men de proteiner og lipider, som udgør meget af endomembrane systemet er kendt for at stamme fra internalisere endokytiske vesikler fra plasma membranen (PM). Endosome er den primære acceptor organelle for disse vesikler og består af flere sammenkoblede sæt af rørformede organeller. Den vigtigste funktion af endosome er at lette næringsstof erhvervelse, regulere protein og lipid omsætning, beskytte mod patogen infektion, og til at fungere som den primære genopfylde kilde til lipider til plasma membranen. Da endosome modtager hovedparten af last proteiner og lipider fra plasma membranen, fungerer det som sorterings kammer ved at isolere Cargos i rørformede endosomale transport bærere (ETCs). Eventuelle proteiner, der ikke er opdelt i ETCs, er overladt til at blive forringet via endo-lysosomal-systemet. Dysreguleringen af sortering af lasten i ETCs kan føre til tab af næringsstofoptagelse, protein omsætning eller lipid homøostase, hvilket resulterer i talrige metaboliske, udviklingsmæssige og neurologiske lidelser1,2. Men til trods for den centrale ETCs-rolle i endosome er den underliggende mekanisme for, hvordan endosome selektivt kan koordinere emballeringen af en lang række heterogene laster i rørformede bærere, ikke kendt.
Den sortering nexin (snx) familie er en evolutionært bevaret klasse af proteiner, der har fundet at være kritisk for mange vesikelprotein transport reaktioner i cellen3,4,5. Sortering nexins er rekrutteret til endosome membran og støtte i Cargo Capture via deres karakteristiske phox Homologi (px) domæne, som binder phosphatidylinositol-3-monophosphat (ptdins (3) P), en lipid beriget på endosome membran. Pattedyr indkode 33 SNX proteiner, som kan yderligere opdeles i flere underfamilier, i henhold til tilstedeværelsen af andre domæner1. Især snx-bar familien er den største under familie bestående af tolv mennesker, mens der i spirende gær, Saccharomyces cerevisiae, under familien er reduceret til bare syv snx-barer. SNX-BAR proteiner har både en PX domæne og en bin-Amphiphysin-RVS (BAR) domæne, der udløser lipid reservoirer til at binde positive krumning membraner. Derfor SNX-BAR familie har en naturlig affinitet for endosome og kan mægle osv dannelse via deres membran remodeling evner. In vitro, remodeling egenskaber af SNX-BARs kan induceres ved tilsætning af renset SNX-BARs til syntetiske Liposomer og den efterfølgende dannelse af smalle, coatede tubuler kan visualiseres ved elektronmikroskopi. Ved hjælp af disse metoder, forskerne har fastslået, at både oligomerisering koncentration og konstriktion styrke synes at variere blandt snx-bar familie tyder på, at de kunne støtte i både dannelse og bedriftssammenlægning af ETCs.
Snx-BARs kan yderligere klassificeres ved deres eksklusive denne egenskaber. In vitro-bindende analyser og strukturelle undersøgelser har vist, at SNX-BAR proteiner kun kan danne specifikke homodimers eller Heterodimere. Derfor kan hver potentiel SNX-BAR dimer-oligomer i princippet give en tubulær frakke til en fragt specifik smugler vej, og ligeledes, den begrænsede oligomerisering af de andre SNX-BAR protomers, også definere særskilte eksportveje. Men på grund af det store antal SNX-barer og mangfoldighed inden for SNX-familien er en enkelt sortering nexin-One Cargo-hypotese højst usandsynlig. I stedet en koordineret indsats ved hjælp af en lang række faktorer, såsom SNX-barer, last, lipid specificitet og andre afhængigheder er mere sandsynligt. Ligeledes, nylige undersøgelser af gær SNX4 familie afslørede beviser for yderligere lipid specificitet, ud over PtdIns (3) P, at forstærke endosome transport luftfartsselskaber6. I denne undersøgelse, snx-bar homodimer Mvp1-Mvp1 blev renset fra bakterier og indfødte heterodimers Snx4-Atg20 og Vps5-Vps17 blev udtrykt og renset i højt udbytte fra gær, mens kun Snx4-Atg20 blev fundet at fortrinsvis binde Phosphatidylserin (PS) og danne smalle rør-lignende strukturer i Liposom bindende undersøgelser6. Mens andre i marken har afsløret vigtige egenskaber af snx-barer ved hjælp af rekombinant renset snx-bar homodimers fra bakterier, toksicitet forbundet med at udtrykke snx-bar Heterodimere i lignende systemer har hindret deres indfødte karakterisering7,8,9,10. Derfor, uden et pålideligt system til at opnå ren rekombinant udtrykte indfødte Heterodimere, skal forskerne give afkald på disse linjer for undersøgelse. I figur 1præsenterer vi en fire-del arbejdsproces til 1) konstruere en gærstamme overudtrykker snx-bar Heterodimere for tandem affinitet rensning, 2) udtrykke og rense indfødte snx-bar Heterodimere, 3) forberede af syntetiske Liposomer, og 4) oprette en liposomtubulation eller sedimentations assay, der giver et vigtigt redskab for forskere til at undersøge det voksende katalog af sortering nexiner findes i naturen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 micrometer PC Membranes</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>610006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Poly-Prep Chromatography column (Bio-Rad)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>731-1550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27 Gauge needle</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>301629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra Centrifugal Filter with 10K cutoff</td>
			<td>Amicon</td>
			<td>UFC501024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avestin EmulsiFlex-C3 Homogenizer</td>
			<td>Avestin</td>
			<td>EF-C3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA assay</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman Optima MAX-XP Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>393315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4693116001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOPC</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>850375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOPS</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>840035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ergosterol (Sigma)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>47130-U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extruder Set with Block 0.2 microlter/1mL</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>610000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">FEI Tecnai F20 transmission electron microscope (200 kV)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass culture tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>47729-570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG sepharose beads (GE Healthcare)</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0969-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microlter glass syringes</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>7637-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New Brunswick Excella E25</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>M1353-0000</td>
			<td>or equivalent shaking 30 C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA Magnetic Agarose Beads</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>78605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima XE-90 Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A94516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M</td>
			<td>VWR</td>
			<td>52858-076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PI3P</td>
			<td>Echelon</td>
			<td>P-3016</td>
			<td>or Echelon equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate bottle assembly</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>355622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLA-100 Fixed-Angle Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>343840</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type 45 Ti Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Desiccator, Bottom and Lid with Socket Valve</td>
			<td>VWR</td>
			<td>75871-436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Pump Alcatel (Pascal 2005 C1)</td>
			<td>A&#38;J Vacuum</td>
			<td>PN07050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex with foam holder</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10153-838</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR KIT MICROTUBE</td>
			<td>VWR</td>
			<td>12620-880</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

expression, purification, and liposome binding of budding yeast snx-bar heterodimers

SNX-BAR proteiner er en evolutionært bevaret klasse af membran remodeling proteiner, der spiller nøgleroller i sortering og handel med protein og lipiderne under endokytose, sortering inden for endosomale system, og autophagy. Central til SNX-BAR protein funktion er evnen til at danne homodimers eller Heterodimere, der binder membraner ved hjælp af stærkt bevaret phox-Homology (PX) og BAR (bin/Amphiphysin/RVS) domæner. Desuden kan oligomerisering af snx-bar dimerer på membraner fremkalde dannelsen af membran tubuler og vesikler, og denne aktivitet menes at afspejle deres funktioner som pels proteiner til endosome-afledte transportvirksomheder. Forskere har længe udnyttet in vitro bindende undersøgelser ved hjælp af rekombinant snx-bar proteiner på syntetiske Liposomer eller gigantiske af vesikler (guvs) at afsløre den præcise makeup af lipider er nødvendige for at drive membran Remodeling, og dermed afsløre deres virkningsmekanisme. Men på grund af tekniske udfordringer med Dual Expression systemer, toksicitet af snx-bar protein ekspression i bakterier, og dårlig Opløselighed af individuelle snx-bar proteiner, de fleste undersøgelser til dato har undersøgt snx-bar homodimers, herunder ikke-fysiologiske dimerer, der dannes under ekspression i bakterier. For nylig har vi optimeret en protokol for at overvinde de store mangler ved et typisk bakterielt udtryks system. Ved hjælp af denne arbejdsgang viser vi, hvordan man med held udtrykker og renser store mængder af SNX-BAR Heterodimere, og hvordan man rekonstruere dem på syntetiske Liposomer til bindende og tubulations assays.

Denne protokol beskriver en metode til reproducerbar og robust produktion af endogene gær SNX-søjle komplekser, der kan anvendes til downstream membran remodeling assays (figur 1). Opførelsen af gærstammen anvendes til rensning udnytter effektiviteten af homologe rekombination i spirende gær, giver mulighed for modifikationer på genomisk loci af de målrettede SNX-BARs (figur 2). Dette design har to fordele, (i) som udvælg...

Watch this Scientific Journal Video about Expression, Purification, and Liposome Binding of Budding Yeast SNX-BAR Heterodimers at JoVE.com

Expression, Purification, and Liposome Binding of Budding Yeast SNX-BAR Heterodimers

Her præsenterer vi en arbejdsgang for udtryk, rensning og Liposom binding af SNX-BAR Heterodimere i gær.

Udtryk, oprensning, og Liposom binding af spirende gær SNX-BAR heterodimers

SNX-BAR proteins are an evolutionarily conserved class of membrane remodeling proteins that play key roles in sorting and trafficking of protein and ...

SNX-BARs er membran remodeling proteiner, der spiller en central rolle i menneskers sygdom. Ved hjælp af vores metoder kan vi bestemme deres præcise biofysiske egenskaber for at lette lipidbinding og membranremodellering. Rensning af SNB-BAR proteiner fra gær celler giver mulighed for erhvervelse af indfødte homo og hetero SNX-BAR dæmninger og samtidig minimere toksicitet og uopløselighed ofte stødt med ikke-hjemmehørende udtryk systemer.Vores metoder kan bruges til at forstå lipid specificiteter af alle gær SNX-BARs eller til at producere rekombinant SNX-BAR proteiner fra enhver anden organisme. En korrekt ekstruder forsamling er afgørende for at forhindre liposom tab under ekstrudering proces. For begyndere studerende eller de nye til området, visuelt observere de mest kritiske trin vil i høj grad forbedre dine chancer for succes.Begynd med at pode en stor podepind af gærceller i en kolbe mindst fire gange den mængde af kulturen, der indeholder 50 milliliter standard YP medium suppleret med 2% raffinose og 0,1% glukose som en kulstofkilde og vokse kulturen natten over i en 30 grader Celsius shaker. Den næste morgen, inokulere 50 milliliter pre-kultur i en liter standard YP medium med 2% raffinose og 0,1% glukose i en 2,8 liters volumen forbløffet Fernbach kolbe for en fire til fem timers kultur i rystende inkubator. Når den optiske massetæthed ved 600 nanometer når 0,2, tilsættes galactose til en endelig koncentration på 2% til cellerne for en natlig kultur i rystende inkubator.Den næste morgen, høste celler ved centrifugering og overføre gær pellet i en 50 milliliter konisk rør. Opsplit pellet i 15 milliliter rensning buffer for at opnå et endeligt volumen på omkring 30 milliliter og indlæse celle suspension på en homogenisator kølet til fire grader Celsius. Lyse prøverne på 20 til 25, 000 pounds per kvadrattomme i to til tre runder og overføre lysatet i en ny 50 milliliter konisk rør på is.Fjern straks cellen lysate ved centrifugering og overfør forsigtigt supernatanten til et nyt rør. Dernæst jævnvægt 300 mikroliter af IgG Sepharose perler med tre re-suspensioner i rensning buffer, før du tilføjer perlerne til den ryddede celle lysat til en to-timers inkubation med roterende ved fire grader Celsius. I slutningen af inkubationen tilsættes perlerne til en 10 milliliter kromatografisøjle, og den ubundne lysat til at strømme igennem.Vask perlerne 10 gange med en milliliter vaskebuffer pr. vask, så hver vask kan flyde helt igennem, før du tilføjer det næste volumen. Efter den sidste vask, bruge en pipette og frisk buffer til at overføre perlerne i en mikrocentrifuge rør. Bring det samlede volumen af perlerne til 500 mikroliter med frisk vask buffer og fjerne perlerne fra lysatet med to mikroliter på 10 milligram pr. milliliter TEV protease for en natten inkubation med rotation ved fire grader Celsius.Den næste morgen, bruge en 27 gauge nål til at fjerne supernatant helt og vurdere protein renhed med 10% polyacryamid SDS side. Derefter kvantificere de koncentrerede proteiner ved hjælp af Bradford protein assay i henhold til standard protokoller og gemme proteinet i op til en uge ved fire grader Celsius. For at forberede liposomer, bruge glas sprøjter til at overføre lager lipider i et rent glas kultur rør for at opnå en endelig lipid blanding af 1% phosphatidylinositol-3-fosfat, 20% ergosterol, 30% phosphatidyserin, phosphatidylcholin som skitseret i tabellen.Afhængigt af opløsningsmidlerne hver lipid er resuspenderet i, blandingen kan blive uklar ved tilsætning af hver lipid. Tør forsigtigt lipidblandingerne ned ved at lede nitrogengas med lavt flow i blandingerne i en cirkulær bevægelse for at behandle lipiderne ensartet i bunden af glasrøret. Pak derefter glaskulturrøret med folie, der forlader åbningen utildækket, og dehydrer lipiderne yderligere i et vakuum i en time.Ved slutningen af inkubationen tilsættes 400 mikroliter bindingsbuffer til hvert hætteglas for helt at rehydrere lipiderne ved en endelig liposomkoncentration på 2,5 millimolar, før lipiderne med middel hastighed på en vortex ved stuetemperatur i 30 minutter resuspendere lipiderne ved medium hastighed. Bufferen bør blive uklar, da lipiderne resuspenderede. Overfør de resuspenderede liposomer til et mikrocentrifugerør og frys rørene i flydende nitrogen efterfulgt af optøning i et 37 grader Celsius-vandbad syv til otte gange.Rengør i en kemisk røghætte to milliliterglassprøjter med et fuldt chloroformvolumen tre gange pr. sprøjte for at fjerne eventuelle resterende lipider og ækvivalilitere hver sprøjte med to mængder ultrarent vand og to volumener bindende buffer. Saml en mini-ekstruder i henhold til producentens anbefalinger. Derefter nedsænkes to stykker filterstøtte i en 200 nanometermembran i bindende buffer.Det er vigtigt at samle mini-ekstruder, så det er helt lufttæt. Og en god måde at kontrollere for lækager er at passere buffer gennem enheden. Sandwich membranen mellem filteret støtter og placere membranen i mini-ekstruder.Ved hjælp af en af de kvædede en milliliter sprøjter, passere et volumen af bindende buffer svarende til mængden af liposom blandingen gennem mini-ekstruder og bruge den anden sprøjte til at droppe liposom blandingen invertere mikrocentrifuge rør til at indsamle den sidste af liposomer i røret hætten for deres indsamling. Derefter ekstrudere liposomer gennem 200 nanometermembranen 19 til 21 gange og indsamle ekstruderet liposomer i en ny mikrocentrifuge rør. Før du udfører SNX-BAR liposom binding og tubulation assays, fordærve det rensede protein ved ultracentrifugering og overføre supernatant til en ny mikrocentrifuge rør uden at forstyrre pellet.Dernæst inkuberes fire mikromolar renset SNX4-ATG20 og 2,5 millimolar liposomer i et samlet reaktionsvolumen på 20 mikroliter til en 30-minutters inkubation ved 30 grader Celsius. For at visualisere og kvantificere liposomrøring, ved udgangen af inkubationen, straks få øje på prøverne på en kulstof-belagt kobber mesh gitter og negativ plet med 1% uranyl acetat. Derefter analysere prøverne på en transmission elektron mikroskop på 200 kilovolts.Ved liposombinding og sedimentering overføres 20 mikroliter af reaktionen til et polycarbonatcentrifugerør, og prøven drejes med en kompatibel router i en ultracentrifuge. Ved centrifugeringsafslutningen overføres supernatanten forsigtigt til et nyt mikrocentrifugerør, og pelleten skal opsbruges igen i 40 mikroliter af SDS-sideprøvebufferen. Pelletsuspension overføres til et nyt mikrocentrifugerør, og der tilsættes 20 mikroliter prøvebuffer til supernatanten.Derefter indlæse tilsvarende prøve mængder af pellet og supernatant på en 10% polyarylamid SDS side gel og udføre Coomassie farvning at visualisere SNX-BARs bundet til liposomer. For at kontrollere, om SNX-BAR-udtrykket er korrekt induktion, kan der anvendes en vestlig skamplet mod tandem-affinitetsrensningsmærkatet, da proteinindholdet i SNX-BAR'erne muligvis ikke kan påvises via Coomassie-pletten. Efter rensning af SNX-BAR heterodimeren skal båndene i de to SNX-BAR'er forekomme i et en-til-en støkiometrisk forhold, og der bør være lidt eller ingen forurenende bånd.I denne repræsentative analyse blev SNX-BAR heterodimerer udtrykt, renset og bundet til syntetiske liposomer som påvist. Bemærk, at MVP1 dannede homodimerer og blev udtrykt i bakterier som forventet. SNX-BAR binding til varierende liposom sammensætninger kunne kvantificeres ved densitometri til at vurdere virkningerne af phosphatidyserin for eksempel på liposom binding.Elektronmikroskopi billeddannelse tillader måling af SNX4-ATG20 liposom tubuli med de fleste tubuli typisk besidder diametre mellem 14 til 26 nanometer. Bemærk, at rensede SNX-BARs kan rekonstitueres med lastopsamlingskomplekser på liposomer for at forstå, hvordan fulde samlinger kan påvirke membranremodellering. Ved sammenligning af bindingen af forskellige kombinationer af rensede SNX-BAR dimers til syntetiske liposomer, der består af forskellige lipider, viste sNX-BAR proteiner sig at have forskellige lipidbindingspræferencer.Arbejd altid i en hætte, når du håndterer chloroform, og sørg for at bære den korrekte PV, når du håndterer skarpe eller glasmateriale.

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetic Engineering of an Unconventional Yeast for Renewable Biofuel and Biochemical Production

Genetic Engineering af en utraditionel Gær for Vedvarende Biobrændsel og biokemisk Produktion

Yarrowia lipolytica is a non-pathogenic, dimorphic and strictly aerobic yeast species. Owing to its distinctive physiological features and metabolic ...

Analysis of Cap-binding Proteins in Human Cells Exposed to Physiological Oxygen Conditions

Analyse af Cap-bindende proteiner i Human celler udsat for Fysiologiske iltforhold

Translational control is a focal point of gene regulation, especially during periods of cellular stress. Cap-dependent translation via the eIF4F complex ...

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

Målrettet<em&gt; I Situ</em&gt; Mutagenese af histon-gener i knopskydende gær

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting ...

Production and Purification of Baculovirus for Gene Therapy Application

Produktion og oprensning af Baculovirus for genterapi ansøgning

Baculovirus has traditionally been used for the production of recombinant protein and vaccine. However, more recently, baculovirus is emerging as a ...

Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere

At udforske Root Microbiome: udtrække bakteriel Fællesskabets Data fra jord, rhizosfære og rod Endosphere

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to ...

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization (smFISH) Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Enkelt molekyle fluorescens In Situ hybridisering (smFISH) analyser i spirende gær vegetativ vækst og meiose

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect ...

Informatic Analysis of Sequence Data from Batch Yeast 2-Hybrid Screens

IT analyse af sekvens Data fra Batch gær 2-Hybrid skærme

We have adapted the yeast 2-hybrid assay to simultaneously uncover dozens of transient and static protein interactions within a single screen utilizing ...

Mating-based Overexpression Library Screening in Yeast

Parring-baserede overekspression bibliotek Screening i gær

Budding yeast has been widely used as a model in studying proteins associated with human diseases. Genome-wide genetic screening is a powerful tool ...

A Deep-sequencing-assisted, Spontaneous Suppressor Screen in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe

A Deep-sequencing-assisted, Spontaneous Suppressor Screen in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe

En dyb-sekventering-assisteret, spontane Suppressor skærm i Fission gær Schizosaccharomyces pombe

A genetic screen for mutant alleles that suppress phenotypic defects caused by a mutation is a powerful approach to identify genes that belong to closely ...

Enhanced Yeast One-hybrid Screens To Identify Transcription Factor Binding To Human DNA Sequences

Forbedret gær One-hybrid skærme til at identificere transskription faktor Binding til menneskelige DNA-sekvenser

Identifying the sets of transcription factors (TFs) that regulate each human gene is a daunting task that requires integrating numerous experimental and ...