Name: expression, purification, and liposome binding of budding yeast snx-bar heterodimers
Uploaded: 2019-12-06T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Expression, Purification, and Liposome Binding of Budding Yeast SNX-BAR Heterodimers at JoVE.com

Het onderzoek dat in deze uitgave werd gerapporteerd, werd gesteund door het National Institute of General Medical Sciences van de National Institutes of Health onder het awardnummer GM060221 en deels door het Nationaal Instituut voor algemene medische wetenschappen van de nationale instituten van de gezondheid onder het gunnings nummer T32GM007223. R.C. werd deels gesteund door het UNC-Charlotte Faculty Research Grants-programma.

1. constructie van gist stam
<ol><li>Begin met TVY614 (pep4Δ:: LEU2 Prb1Δ:: Hisg prc1Δ:: HIS3)11 als de bovenliggende stam. Deze stam is een tekort aan vacuollaire proteasen, die bijdragen aan de meerderheid van de eiwitafbraak na cel lysis, en daarom zorgt voor een schonere en efficiëntere zuivering.</li>
	<li>Ontwerp primers12 en integreer tandem Affinity zuivering (TAP) tag op het C-eindpunt van ATG20 (SNX-Bar ORF 1) met behulp van homolo...

<ol>
	<li>Teasdale, R. D., Collins, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+the+PX+(phox-homology)+domain+and+SNX+(sorting+nexin)+protein+families:+structures,+functions+and+roles+in+disease.">Insights into the PX (phox-homology) domain and SNX (sorting nexin) protein families: structures, functions and roles in disease.</a> The Biochemical Journal. 441 (1), 39-59 (2012).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Retromer+Complex+and+Sorting+Nexins+in+Neurodegenerative+Diseases.">The Retromer Complex and Sorting Nexins in Neurodegenerative Diseases.</a> Frontiers in Aging Neuroscience. 10, 79 (2018).</li><li>Burd, C., Cullen, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retromer:+a+master+conductor+of+endosome+sorting.">Retromer: a master conductor of endosome sorting.</a> Cold Spring Harbor perspectives in Biology. 6 (2), (2014).</li><li>Chi, R. J., Harrison, M. S., Burd, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogenesis+of+endosome-derived+transport+carriers.">Biogenesis of endosome-derived transport carriers.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 72 (18), 3441-3455 (2015).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endosomal+receptor+trafficking:+Retromer+and+beyond.">Endosomal receptor trafficking: Retromer and beyond.</a> Traffic (Copenhagen, Denmark). 19 (8), 578-590 (2018).</li><li>Ma, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+trafficking+by+yeast+Snx4+family+SNX-BAR+proteins+promotes+autophagy+and+vacuole+membrane+fusion.">Lipid trafficking by yeast Snx4 family SNX-BAR proteins promotes autophagy and vacuole membrane fusion.</a> Molecular Biology of the Cell. , (2018).</li><li>van Weering, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+for+SNX-BAR-mediated+assembly+of+distinct+endosomal+sorting+tubules.">Molecular basis for SNX-BAR-mediated assembly of distinct endosomal sorting tubules.</a> The EMBO Journal. 31 (23), 4466-4480 (2012).</li><li>Chi, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fission+of+SNX-BAR-coated+endosomal+retrograde+transport+carriers+is+promoted+by+the+dynamin-related+protein+Vps1.">Fission of SNX-BAR-coated endosomal retrograde transport carriers is promoted by the dynamin-related protein Vps1.</a> The Journal of Cell Biology. 204 (5), 793-806 (2014).</li><li>Purushothaman, L. K., Arlt, H., Kuhlee, A., Raunser, S., Ungermann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retromer-driven+membrane+tubulation+separates+endosomal+recycling+from+Rab7/Ypt7-dependent+fusion.">Retromer-driven membrane tubulation separates endosomal recycling from Rab7/Ypt7-dependent fusion.</a> Molecular Biology of the Cell. 28 (6), 783-791 (2017).</li><li>Purushothaman, L. K., Ungermann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cargo+induces+retromer-mediated+membrane+remodeling+on+membranes.">Cargo induces retromer-mediated membrane remodeling on membranes.</a> Molecular Biology of the Cell. 29 (22), 2709-2719 (2018).</li><li>Wurmser, A. E., Emr, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphoinositide+signaling+and+turnover:+PtdIns(3)P,+a+regulator+of+membrane+traffic,+is+transported+to+the+vacuole+and+degraded+by+a+process+that+requires+lumenal+vacuolar+hydrolase+activities.">Phosphoinositide signaling and turnover: PtdIns(3)P, a regulator of membrane traffic, is transported to the vacuole and degraded by a process that requires lumenal vacuolar hydrolase activities.</a> The EMBO journal. 17 (17), 4930-4942 (1998).</li><li>Puig, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tandem+affinity+purification+(TAP)+method:+a+general+procedure+of+protein+complex+purification.">The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification.</a> Methods. 24 (3), 218-229 (2001).</li><li>Kushnirov, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+reliable+protein+extraction+from+yeast.">Rapid and reliable protein extraction from yeast.</a> Yeast. 16 (9), 857-860 (2000).</li><li>Longtine, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Additional+modules+for+versatile+and+economical+PCR-based+gene+deletion+and+modification+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Additional modules for versatile and economical PCR-based gene deletion and modification in Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 14 (10), 953-961 (1998).</li><li>Tropea, J. E., Cherry, S., Waugh, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+purification+of+soluble+His(6)-tagged+TEV+protease.">Expression and purification of soluble His(6)-tagged TEV protease.</a> Methods in Molecular Biology. 498, 297-307 (2009).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphology+and+structure+of+lipoproteins+revealed+by+an+optimized+negative-staining+protocol+of+electron+microscopy.">Morphology and structure of lipoproteins revealed by an optimized negative-staining protocol of electron microscopy.</a> Journal of Lipid Research. 52 (1), 175-184 (2011).</li><li>Yong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+purification+of+the+SNX1/SNX6+complex.">Expression and purification of the SNX1/SNX6 complex.</a> Protein Expression and Purification. 151, 93-98 (2018).</li></ol>

Hier demonstreren we een geoptimaliseerde workflow om SNX-Bar Dimeren in gist te zuiveren en twee testen om hun biofysische eigenschappen op synthetische liposomen te evalueren. Het belangrijkste voordeel ten opzichte van typische recombinant eiwit expressie in Escherichia coli of andere systemen is het vermogen om SNX-Bar eiwitten gelijkmatig te uiten in een inheemse gastheer, waardoor de toxiciteit en onoplosbaarheid problemen in zuiverende SNX-staven in andere systemen worden vermeden. Het is ook opmerkelijk ...

Aan het membraan gebonden organellen zoals het plasma membraan, het endoplasmatische reticulum, het Golgi-apparaat, lysosoom (gist vacuole) en endosome omvatten het endomembraansysteem-systeem van de eukaryote cel. De meeste organellen hebben de mogelijkheid om via blaasje transporteurs materiaal met andere organellen te communiceren en uit te wisselen. Hoe de cel de verpakking en de vorming van blaasje transport dragers binnen het endomembraansysteem-systeem coördineert, is niet goed begrepen. Echter, de eiwitten en lipiden die een groot deel van het endomembraansysteem-systeem vormen, zijn bekend dat ze afkomstig zijn van het internaliseren van endocytische blaasjes uit het plasma membraan (PM). De endosome is de primaire acceptor organel voor deze blaasjes en bestaat uit meerdere onderling verbonden sets van buisvormige organellen. De belangrijkste functie van de endosome is het vergemakkelijken van nutriënten verwerving, reguleren van de omzet van eiwitten en lipiden, beschermen tegen pathogenen infectie, en dienen als de primaire bijvullen bron van lipiden voor het plasma membraan. Omdat de endosome het grootste deel van de lading eiwitten en lipiden uit het plasma membraan ontvangt, fungeert het als een sorteer compartiment door cargo's te isoleren in tubulaire endosomale transport dragers (ETCs). Alle eiwitten die niet in ETCs worden opgenomen, worden afgebroken via het Endo-lysosomale systeem. De disregulatie van de lading sortering in ETCS kan leiden tot het verlies van nutriëntenopname, eiwit omzet of lipide homeostase, resulterend in talrijke metabole, ontwikkelings-en neurologische aandoeningen1,2. Ondanks de centrale rol van ETCs bij de endosome, is het onderliggende mechanisme van de manier waarop de endosome de verpakking van een veelheid van heterogene cargo's selectief kunnen coördineren in buisvormige dragers, echter niet bekend.
Het sorteren van nexin (SNX) familie is een evolutionair gekonveerde klasse van eiwitten die zijn gebleken kritisch te zijn voor vele blaasje transport reacties in de cel3,4,5. Het sorteren van nexins wordt gerekruteerd naar het endogeen membraan en hulp bij het opvangen van de lading via hun karakteristieke phox homologie (PX) domein, dat phosphatidylinositol-3-monofosfaat bindt (PtdIns (3) P), een lipide verrijkt op het endoeen membraan. Zoogdieren coderen 33 SNX-eiwitten, die verder kunnen worden onderverdeeld in meerdere subfamilies, afhankelijk van de aanwezigheid van andere domeinen1. Met name de SNX-BAR subfamilie is de grootste onderfamilie bestaande uit twaalf mensen, terwijl in ontluikende gist, Saccharomyces cerevisiae, de onderfamilie wordt gereduceerd tot slechts zeven SNX-BARs. SNX-BAR eiwitten hebben zowel een PX domein als een bin-Amphiphysin-RVS (BAR) domein dat lipide reservoirs activeert om positieve kromming membranen te binden. Bijgevolg heeft de SNX-BAR familie een natuurlijke affiniteit voor de endosome en kan ze de vorming van ETC bemedieren via hun membraan remodellering capaciteiten. In vitro kunnen de verbouwingen van SNX-BARs worden geïnduceerd door de toevoeging van gezuiverde SNX-staven aan synthetische liposomen en de daaropvolgende vorming van smalle, gecoate tubuli kan worden gevisualiseerd door elektronenmicroscopie. Met behulp van deze methoden, onderzoekers hebben vastgesteld dat beide oligomerisatie concentratie en vernauwing sterkte lijken te variëren tussen de SNX-Bar familie suggereren dat ze konden helpen in zowel de vorming en de scissie van ETCS.
De SNX-BARs kunnen verder worden geclassificeerd door hun exclusieve door dimerisatie-eigenschappen. In vitro binding testen en structurele studies hebben aangetoond dat SNX-BAR eiwitten alleen specifieke homodimers of heterodimers kunnen vormen. Daarom, in principe, elke potentiële SNX-BAR dimer-oligomeren zou kunnen bieden een tubulus Coat voor een Cargo-specifieke handel traject en ook, de beperkte oligomerisatie van de andere SNX-BAR protomers, kunnen definiëren verschillende export trajecten. Echter, vanwege het grote aantal SNX-BARs en diversiteit binnen de SNX-familie, is een één Sorteer nexin-One Cargo hypothese hoogst onwaarschijnlijk. In plaats daarvan een gecoördineerde inspanning met behulp van een veelheid van factoren, zoals SNX-BARs, lading, lipide specificiteit en andere afhankelijkheden is waarschijnlijker. Evenzo, recente studies van de gist SNX4 familie geopenbaard bewijs voor extra lipide specificiteit, buiten PtdIns (3) P, te versterken endosome transport dragers6. In deze studie, SNX-Bar homodimer Mvp1-Mvp1 werd gezuiverd van bacteriën en inheemse heterodimers Snx4-Atg20 en Vps5-Vps17 werden uitgedrukt en gezuiverd in hoge opbrengst van gist, terwijl alleen Snx4-Atg20 werd gevonden om bij voorkeur binden fosfatidylserine (PS) en vormen smalle buis-achtige structuren in liposoom bindende studies6. Terwijl anderen in het veld hebben onthuld belangrijke eigenschappen van de SNX-BARs met behulp van recombinantly gezuiverde SNX-Bar homodimers van bacteriën, toxiciteit in verband met uitdrukken SNX-Bar heterodimers in vergelijkbare systemen hebben hun inheemse karakterisering7,8,9,10belemmerd. Daarom, zonder een betrouwbaar systeem te verkrijgen zuivere recombinantly uitgedrukt inheemse heterodimers, onderzoekers moeten afzien van deze onderzoekslijnen. In Figuur 1presenteren we een vierdelige workflow aan 1) om een gist-stam te maken die de SNX-Bar heterodimers overdrukt voor het zuiveren van tandem-affiniteit, 2) Express en zuiveren inheemse SNX-Bar heterodimers, 3) bereid unilamellaire synthetische liposomen, en 4) opzetten van een liposoom tubulatie of sedimentaties Assay, het verstrekken van een essentieel instrument voor onderzoekers om de groeiende catalogus van het sorteren nexins gevonden in de natuur te onderzoeken.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 micrometer PC Membranes</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>610006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Poly-Prep Chromatography column (Bio-Rad)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>731-1550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27 Gauge needle</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>301629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra Centrifugal Filter with 10K cutoff</td>
			<td>Amicon</td>
			<td>UFC501024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avestin EmulsiFlex-C3 Homogenizer</td>
			<td>Avestin</td>
			<td>EF-C3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA assay</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman Optima MAX-XP Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>393315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4693116001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOPC</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>850375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOPS</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>840035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ergosterol (Sigma)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>47130-U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extruder Set with Block 0.2 microlter/1mL</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>610000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">FEI Tecnai F20 transmission electron microscope (200 kV)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass culture tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>47729-570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG sepharose beads (GE Healthcare)</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0969-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microlter glass syringes</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>7637-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New Brunswick Excella E25</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>M1353-0000</td>
			<td>or equivalent shaking 30 C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA Magnetic Agarose Beads</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>78605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima XE-90 Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A94516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M</td>
			<td>VWR</td>
			<td>52858-076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PI3P</td>
			<td>Echelon</td>
			<td>P-3016</td>
			<td>or Echelon equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate bottle assembly</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>355622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLA-100 Fixed-Angle Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>343840</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type 45 Ti Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Desiccator, Bottom and Lid with Socket Valve</td>
			<td>VWR</td>
			<td>75871-436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Pump Alcatel (Pascal 2005 C1)</td>
			<td>A&#38;J Vacuum</td>
			<td>PN07050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex with foam holder</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10153-838</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR KIT MICROTUBE</td>
			<td>VWR</td>
			<td>12620-880</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

expression, purification, and liposome binding of budding yeast snx-bar heterodimers

SNX-BAR eiwitten zijn een evolutionair gekonveerde klasse van membraan remodellering eiwitten die belangrijke rollen spelen bij het sorteren en handel in eiwitten en lipiden tijdens endocytose, sorteren binnen het endosomale systeem en autophagie. Centraal in de SNX-BAR proteïne-functie is de mogelijkheid om homodimers of heterodimers te vormen die de membranen binden met sterk geconcongeerde phox-homologie (PX) en BAR (bin/Amphiphysin/RVS) domeinen. Bovendien kan oligomerisatie van SNX-Bar Dimeren op membranen de vorming van membraan tubuli en blaasjes opwekken en deze activiteit wordt verondersteld hun functies als vacht eiwitten voor endosome-afgeleide transport dragers weer te geven. Onderzoekers hebben lang gebruikt in vitro bindende studies met behulp van recombinant SNX-BAR eiwitten op synthetische liposomen of gigantische unilamellaire blaasjes (Guv's) om de precieze make-up van lipiden die nodig zijn om membraan remodellering te stimuleren onthullen, dus onthullen hun werkingsmechanisme. Echter, als gevolg van technische uitdagingen met dubbele expressie systemen, toxiciteit van SNX-Bar eiwit expressie in bacteriën, en slechte oplosbaarheid van individuele SNX-Bar eiwitten, de meeste studies tot nu toe hebben onderzocht SNX-Bar homodimers, met inbegrip van niet-fysiologische Dimeren die vormen tijdens de expressie in bacteriën. Onlangs hebben we een protocol geoptimaliseerd om de grote tekortkomingen van een typisch bacteriële expressie systeem te overwinnen. Met behulp van deze workflow laten we zien hoe we grote hoeveelheden SNX-BAR heterodimers kunnen uitdrukken en zuiveren en hoe ze deze kunnen reconstitueren op synthetische liposomen voor bindende en tubulatie testen.

Dit protocol beschrijft een methode voor reproduceerbare en robuuste productie van endogene gist SNX-BAR complexen die kunnen worden gebruikt voor downstream membraan remodellering testen (Figuur 1). De bouw van de gist stam gebruikt voor zuivering maakt gebruik van de efficiëntie van homologe recombinatie in ontluikende gist, waardoor wijzigingen kunnen worden aangebracht aan de genomische loci van de beoogde SNX-staven (Figuur 2</stron...

Watch this Scientific Journal Video about Expression, Purification, and Liposome Binding of Budding Yeast SNX-BAR Heterodimers at JoVE.com

Expression, Purification, and Liposome Binding of Budding Yeast SNX-BAR Heterodimers

Hier presenteren we een workflow voor de expressie, zuivering en liposoom binding van SNX-BAR heterodimers in gist.

Expressie, zuivering en liposoom binding van ontluikende gist SNX-BAR Heterodimers

SNX-BAR proteins are an evolutionarily conserved class of membrane remodeling proteins that play key roles in sorting and trafficking of protein and ...

SNX-BARs zijn membraan remodelleren eiwitten die een belangrijke rol spelen in de menselijke ziekte. Met behulp van onze methoden kunnen we hun precieze biofysische eigenschappen bepalen om lipidebinding en membraanremodellering te vergemakkelijken. Het zuiveren van de SNB-BAR eiwitten uit gistcellen maakt de verwerving van inheemse homo en hetero SNX-BAR dimers mogelijk terwijl de toxiciteit en onoplosbaarheid die vaak worden aangetroffen met niet-inheemse expressiesystemen worden geminimaliseerd.Onze methoden kunnen worden gebruikt om de lipide specificiteiten van alle gist SNX-BARs te begrijpen of om recombinant SNX-BAR eiwitten te produceren uit een ander organisme. Een correcte extruderassemblage is essentieel om liposoom verlies tijdens het extrusieproces te voorkomen. Voor beginnende studenten of mensen die nieuw zijn in het veld, visueel observeren van de meest kritische stappen zal sterk verbeteren van uw kansen op succes.Begin met het inenten van een groot uitstrijkje van gistcellen in een kolf ten minste vier keer het volume van de cultuur met 50 milliliter standaard YP medium aangevuld met 2%raffinose en 0,1%glucose als koolstofbron en groeien de cultuur 's nachts in een 30 graden Celsius shaker. De volgende ochtend, inenting van de 50 milliliter pre-cultuur in een liter standaard YP medium met 2%raffinose en 0,1%glucose in een 2,8 liter volume verbijsterd Fernbach fles voor een vier tot vijf uur durende cultuur in de schudden incubator. Wanneer de optische dichtheid op 600 nanometer 0,2 bereikt, voeg galactose toe aan een uiteindelijke concentratie van 2%, aan de cellen voor een nachtelijke cultuur in de schuddende incubator.De volgende ochtend, oogst cellen door centrifugatie en breng de gist pellet in een 50 milliliter conische buis. Resuspend de pellet in 15 milliliter zuivering buffer om een uiteindelijk volume van ongeveer 30 milliliter te bereiken en de cel suspensie te laden op een homogenisator gekoeld tot vier graden Celsius. Lyse de monsters op 20 tot 25, 000 pond per vierkante inch voor twee tot drie rondes en breng het lysate in een nieuwe 50 milliliter conische buis op ijs.Onmiddellijk duidelijk de cel lysate door centrifugatie en zorgvuldig overbrengen van de supernatant in een nieuwe buis. Vervolgens, equilibrate 300 microliter van IgG Sepharose kralen met drie re-suspensies in zuivering buffer alvorens de kralen toe te voegen aan de gewiste cel lysate voor een twee uur durende incubatie met draaien op vier graden Celsius. Voeg aan het einde van de incubatie de kralen toe aan een chromatografiekolom van 10 milliliter en laat het ongebonden lysaat doorstromen.Was de kralen 10 keer met een milliliter wasbuffer per wasbuffer waardoor elke was volledig doorstroomt voordat het volgende volume wordt toegevoegd. Gebruik na de laatste wasbeurt een pipet en een verse buffer om de kralen in een microcentrifugebuis over te brengen. Breng het totale volume van de kralen op 500 microliter met verse wasbuffer en verwijder de kralen uit het lysaat met twee microliters van 10 milligram per milliliter TEV protease voor een nachtelijke incubatie met rotatie bij vier graden Celsius.De volgende ochtend, gebruik maken van een 27 meter naald om de supernatant volledig te verwijderen en de eiwitzuiverheid te beoordelen door 10% polyacrylamide SDS pagina. Kwantificeer vervolgens de geconcentreerde eiwitten met behulp van de Bradford eiwittest volgens standaardprotocollen en bewaar het eiwit voor maximaal een week bij vier graden Celsius. Om de liposomen voor te bereiden, gebruik glasspuiten om voorraadlipiden over te brengen in een schone glazen kweekbuis om een uiteindelijk lipidemengsel van 1%fosfatidylinositol-3-fosfaat, 20%ergosterol, 30%fosphatidylserine, fosfoidylcholine zoals beschreven in de tabel te bereiken.Afhankelijk van de oplosmiddelen wordt elke lipide opnieuw opgetrokken, het mengsel kan troebel worden bij de toevoeging van elke lipide. Droog de lipidemengsels voorzichtig af door laagstroomstikstofgas in een cirkelvormige beweging naar de mengsels te leiden om de lipiden gelijkmatig aan de onderkant van de glazen buis te behandelen. Wikkel vervolgens de glazen kweekbuis met folie en laat de opening onbedekt en de lipiden een uur lang in een vacuüm uitdrogen.Voeg aan het einde van de incubatie 400 microliter bindingsbuffer toe aan elke flacon om de lipiden volledig te hydrateren bij een laatste liposoomconcentratie van 2,5 millimolar voordat de lipiden gedurende 30 minuten bij gemiddelde snelheid op een vortex worden gerehydrateren. De buffer moet troebel worden als de lipiden opnieuw worden opgetrokken. Breng de opgesuspende liposomen over in een microcentrifugebuis en vries de buizen in vloeibare stikstof, gevolgd door zeven tot acht keer ontdooien in een waterbad van 37 graden Celsius.Reinig in een chemische rookkap twee glazen spuiten van één milliliter met een volledig volume chloroform drie maal per spuit om eventuele resterende lipiden te verwijderen en elke spuit te equilibreren met twee volumes ultrazuiver water en twee hoeveelheden bindende buffer. Monteer een mini-extruder volgens de aanbevelingen van de fabrikant. Vervolgens dompelen twee stukken van filter ondersteuning in een 200 nanometer membraan in bindende buffer.Het is belangrijk om de mini-extruder zo te monteren dat deze volledig luchtdicht is. En een goede manier om te controleren op lekken is om buffer door het apparaat. Sandwich het membraan tussen de filtersteunen en plaats het membraan in de mini-extruder.Met behulp van een van de geëquilibreerde een milliliter spuiten, passeren een volume van de bindende buffer vergelijkbaar met het volume van de liposoom mengsel door de mini-extruder en gebruik de andere spuit om de lipososome mengsel omkeren van de microcentrifuge buis om de laatste van de liposomen te verzamelen in de dop voor hun verzameling. Extrudeer vervolgens de liposomen 19 tot 21 keer door het membraan van 200 nanometer en verzamel de geëxtrudeerde liposomen in een nieuwe microcentrifugebuis. Voordat u de SNX-BAR liposoom binding en tubulatietesten uitvoert, moet u het gezuiverde eiwit vooraf verwijderen door ultracentrifugeren en de supernatant overbrengen naar een nieuwe microcentrifugebuis zonder de pellet te verstoren.Vervolgens, incubeer vier micromolar van gezuiverde SNX4-ATG20 en 2,5 millimolar liposomen in een totaal reactievolume van 20 microliter voor een 30-minuten incubatie bij 30 graden Celsius. Om de liposoombuien te visualiseren en te kwantificeren, spot je aan het einde van de incubatie onmiddellijk de monsters op een met koolstof bedekt koperen gaas en negatieve vlek met 1%uranylacetaat. Analyseer vervolgens de monsters op een transmissieelektronmicroscoop op 200 kilovolts.Voor liposoom binding en sedimentatie, breng 20 microliter van de reactie over op een polycarbonaatcentrifugebuis en draai het monster met een compatibele router in een ultracentrifuge. Breng aan het einde van de centrifugatie de supernatant voorzichtig over naar een nieuwe microcentrifugebuis en zet de pellet opnieuw op in 40 microliters van SDS-paginamonsterbuffer. Breng de pelletsuspensie over naar een nieuwe microcentrifugebuis en voeg 20 microliter monsterbuffer toe aan de supernatant.Laad vervolgens gelijkwaardige monstervolumes van pellet en supernatant op een 10%polyacrylamide SDS-paginagel en voer Coomassie-vlekken uit om de SNX-BARs die aan de liposomen zijn gebonden te visualiseren. Om te controleren op een goede inductie van SNX-BAR expressie, een westelijke vlek tegen de tandem affiniteit zuivering tag kan worden gebruikt als de eiwitniveaus van de SNX-BARs kan niet worden gedetecteerd via Coomassie vlek. Na zuivering van de SNX-BAR heterodimer moeten de banden van de twee SNX-BARs in een één-op-één stoichiometrische verhouding verschijnen en zouden er weinig tot geen contaminatingsbanden moeten zijn.In deze representatieve analyse werden SNX-BAR heterodimers uitgedrukt, gezuiverd en gebonden aan synthetische liposomen zoals aangetoond. Merk op dat MVP1 homodimeren gevormd en werd uitgedrukt in bacteriën zoals verwacht. SNX-BAR binding aan verschillende liposoom samenstellingen kunnen worden gekwantificeerd door densitometrie om de effecten van fosphatidylserine bijvoorbeeld op liposoom binding te beoordelen.Electron microscopie imaging maakt het mogelijk de meting van SNX4-ATG20 liposoom tubuli met de meeste tubuli meestal het bezit van diameters tussen 14 tot 26 nanometer. Houd er rekening mee dat gezuiverde SNX-BARs kunnen worden gereconstrueerd met ladingvangcomplexen op liposomen om te begrijpen hoe volledige samenstellingen de herinrichting van het membraan kunnen beïnvloeden. Bij het vergelijken van de binding van verschillende combinaties van gezuiverde SNX-BAR dimers met synthetische liposomen bestaande uit verschillende lipiden, bleken SNX-BAR eiwitten verschillende lipide bindingsvoorkeuren te bezitten.Werk altijd in een kap bij het hanteren van chloroform en zorg ervoor dat u de juiste PBM draagt bij het hanteren van scherpe of glasmateriaal.

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetic Engineering of an Unconventional Yeast for Renewable Biofuel and Biochemical Production

Genetische manipulatie van een onconventionele Gist voor duurzame biobrandstoffen en biochemische Production

Yarrowia lipolytica is a non-pathogenic, dimorphic and strictly aerobic yeast species. Owing to its distinctive physiological features and metabolic ...

Analysis of Cap-binding Proteins in Human Cells Exposed to Physiological Oxygen Conditions

Analyse van Cap-bindende eiwitten in menselijke cellen blootgesteld aan Physiological Oxygen Voorwaarden

Translational control is a focal point of gene regulation, especially during periods of cellular stress. Cap-dependent translation via the eIF4F complex ...

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

gerichte<em&gt; In Situ</em&gt; Mutagenese van histon genen in gist

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting ...

Production and Purification of Baculovirus for Gene Therapy Application

Productie en zuivering van Baculovirus voor toepassing van de gentherapie

Baculovirus has traditionally been used for the production of recombinant protein and vaccine. However, more recently, baculovirus is emerging as a ...

Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere

Verkennen van de wortel Microbiome: extraheren van gegevens van de bacteriële Gemeenschap uit de bodem, de rhizosfeer, en de wortel Endosphere

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to ...

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization (smFISH) Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Één molecuul fluorescentie In Situ hybridisatie (smFISH) analyse in Budding vegetatieve groei van gist en meiose

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect ...

Informatic Analysis of Sequence Data from Batch Yeast 2-Hybrid Screens

Informatic analyse van sequencedata van Batch gist 2-Hybrid schermen

We have adapted the yeast 2-hybrid assay to simultaneously uncover dozens of transient and static protein interactions within a single screen utilizing ...

Mating-based Overexpression Library Screening in Yeast

Paring gebaseerde overexpressie bibliotheek Screening in het gist

Budding yeast has been widely used as a model in studying proteins associated with human diseases. Genome-wide genetic screening is a powerful tool ...

A Deep-sequencing-assisted, Spontaneous Suppressor Screen in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe

A Deep-sequencing-assisted, Spontaneous Suppressor Screen in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe

Een Deep-sequencing-bijgewoonde, spontane Suppressor scherm in de kernsplijting gist Schizosaccharomyces pombe

A genetic screen for mutant alleles that suppress phenotypic defects caused by a mutation is a powerful approach to identify genes that belong to closely ...

Enhanced Yeast One-hybrid Screens To Identify Transcription Factor Binding To Human DNA Sequences

Verbeterde gist One-hybride schermen te identificeren van de transcriptiefactor binden aan menselijke DNA-sequenties

Identifying the sets of transcription factors (TFs) that regulate each human gene is a daunting task that requires integrating numerous experimental and ...