Name: expression, purification, and liposome binding of budding yeast snx-bar heterodimers
Uploaded: 2019-12-06T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Expression, Purification, and Liposome Binding of Budding Yeast SNX-BAR Heterodimers at JoVE.com

Les recherches rapportées dans cette publication ont été soutenues par l'Institut national des sciences médicales générales des National Institutes of Health sous le numéro de prix GM060221 et en partie par l'Institut national des sciences médicales générales des Instituts nationaux de la santé sous le numéro de récompense T32GM007223. R.C. a reçu l'appui en partie du Programme de subventions de recherche de la Faculté de l'UNC-Charlotte.

1. Construction de souche de levure
<ol><li>Commencez par TVY614 (pep4MD::LEU2 prb1MD::hisG prc1MD::HIS3)11 comme la souche parente. Cette souche est déficiente pour les protéases vacuolar, qui contribuent à la majorité de la dégradation des protéines après la lyse cellulaire, et permet donc une purification plus propre et plus efficace.</li>
	<li>Concevoir les amorces12 et intégrer la balise de purification d'affinité tandem (TAP) au t...

<ol>
	<li>Teasdale, R. D., Collins, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+the+PX+(phox-homology)+domain+and+SNX+(sorting+nexin)+protein+families:+structures,+functions+and+roles+in+disease.">Insights into the PX (phox-homology) domain and SNX (sorting nexin) protein families: structures, functions and roles in disease.</a> The Biochemical Journal. 441 (1), 39-59 (2012).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Retromer+Complex+and+Sorting+Nexins+in+Neurodegenerative+Diseases.">The Retromer Complex and Sorting Nexins in Neurodegenerative Diseases.</a> Frontiers in Aging Neuroscience. 10, 79 (2018).</li><li>Burd, C., Cullen, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retromer:+a+master+conductor+of+endosome+sorting.">Retromer: a master conductor of endosome sorting.</a> Cold Spring Harbor perspectives in Biology. 6 (2), (2014).</li><li>Chi, R. J., Harrison, M. S., Burd, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogenesis+of+endosome-derived+transport+carriers.">Biogenesis of endosome-derived transport carriers.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 72 (18), 3441-3455 (2015).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endosomal+receptor+trafficking:+Retromer+and+beyond.">Endosomal receptor trafficking: Retromer and beyond.</a> Traffic (Copenhagen, Denmark). 19 (8), 578-590 (2018).</li><li>Ma, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+trafficking+by+yeast+Snx4+family+SNX-BAR+proteins+promotes+autophagy+and+vacuole+membrane+fusion.">Lipid trafficking by yeast Snx4 family SNX-BAR proteins promotes autophagy and vacuole membrane fusion.</a> Molecular Biology of the Cell. , (2018).</li><li>van Weering, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+for+SNX-BAR-mediated+assembly+of+distinct+endosomal+sorting+tubules.">Molecular basis for SNX-BAR-mediated assembly of distinct endosomal sorting tubules.</a> The EMBO Journal. 31 (23), 4466-4480 (2012).</li><li>Chi, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fission+of+SNX-BAR-coated+endosomal+retrograde+transport+carriers+is+promoted+by+the+dynamin-related+protein+Vps1.">Fission of SNX-BAR-coated endosomal retrograde transport carriers is promoted by the dynamin-related protein Vps1.</a> The Journal of Cell Biology. 204 (5), 793-806 (2014).</li><li>Purushothaman, L. K., Arlt, H., Kuhlee, A., Raunser, S., Ungermann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retromer-driven+membrane+tubulation+separates+endosomal+recycling+from+Rab7/Ypt7-dependent+fusion.">Retromer-driven membrane tubulation separates endosomal recycling from Rab7/Ypt7-dependent fusion.</a> Molecular Biology of the Cell. 28 (6), 783-791 (2017).</li><li>Purushothaman, L. K., Ungermann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cargo+induces+retromer-mediated+membrane+remodeling+on+membranes.">Cargo induces retromer-mediated membrane remodeling on membranes.</a> Molecular Biology of the Cell. 29 (22), 2709-2719 (2018).</li><li>Wurmser, A. E., Emr, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphoinositide+signaling+and+turnover:+PtdIns(3)P,+a+regulator+of+membrane+traffic,+is+transported+to+the+vacuole+and+degraded+by+a+process+that+requires+lumenal+vacuolar+hydrolase+activities.">Phosphoinositide signaling and turnover: PtdIns(3)P, a regulator of membrane traffic, is transported to the vacuole and degraded by a process that requires lumenal vacuolar hydrolase activities.</a> The EMBO journal. 17 (17), 4930-4942 (1998).</li><li>Puig, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tandem+affinity+purification+(TAP)+method:+a+general+procedure+of+protein+complex+purification.">The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification.</a> Methods. 24 (3), 218-229 (2001).</li><li>Kushnirov, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+reliable+protein+extraction+from+yeast.">Rapid and reliable protein extraction from yeast.</a> Yeast. 16 (9), 857-860 (2000).</li><li>Longtine, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Additional+modules+for+versatile+and+economical+PCR-based+gene+deletion+and+modification+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Additional modules for versatile and economical PCR-based gene deletion and modification in Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 14 (10), 953-961 (1998).</li><li>Tropea, J. E., Cherry, S., Waugh, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+purification+of+soluble+His(6)-tagged+TEV+protease.">Expression and purification of soluble His(6)-tagged TEV protease.</a> Methods in Molecular Biology. 498, 297-307 (2009).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphology+and+structure+of+lipoproteins+revealed+by+an+optimized+negative-staining+protocol+of+electron+microscopy.">Morphology and structure of lipoproteins revealed by an optimized negative-staining protocol of electron microscopy.</a> Journal of Lipid Research. 52 (1), 175-184 (2011).</li><li>Yong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+purification+of+the+SNX1/SNX6+complex.">Expression and purification of the SNX1/SNX6 complex.</a> Protein Expression and Purification. 151, 93-98 (2018).</li></ol>

Ici, nous démontrons un flux de travail optimisé pour purifier les dissipateurs SNX-BAR dans la levure et deux essais pour évaluer leurs propriétés biophysiques sur des liposomes synthétiques. Le principal avantage par rapport à l'expression typique des protéines recombinantes dans Escherichia coli ou d'autres systèmes est la capacité d'exprimer uniformément les protéines SNX-BAR dans un hôte indigène, évitant ainsi les problèmes de toxicité et d'insolubilité présents dans la purification des ...

Les organites membranaires tels que la membrane plasmatique, le réticulum endoplasmique, l'appareil Golgi, le lysosome (vacuole de levure) et l'endosome composent le système endomembrane de la cellule eucaryotique. La plupart des organites ont la capacité de communiquer et d'échanger du matériel avec d'autres organites par l'intermédiaire de transporteurs de vésicules. La façon dont la cellule coordonne l'emballage et la formation des transporteurs de vésicules dans le système endomembrane n'est pas bien comprise. Cependant, les protéines et les lipides qui constituent une grande partie du système endomembrane sont connus pour provenir de l'intériorisation des vésicules endocytiques de la membrane plasmatique (PM). L'endosome est l'organelle d'acceptation primaire pour ces vésicules et est composé de multiples ensembles interconnectés d'organites tubulaires. La fonction principale de l'endosome est de faciliter l'acquisition de nutriments, de réguler le renouvellement des protéines et des lipides, de protéger contre les infections pathogènes et de servir de principale source de réapprovisionnement en lipides pour la membrane plasmatique. Comme l'endosome reçoit la majeure partie des protéines de cargaison et des lipides de la membrane plasmatique, il agit comme un compartiment de tri en isolant les cargaisons dans les transporteurs tubulaires de transport endosomal (ETC). Toutes les protéines non séquestrées dans les ETC sont laissées à être dégradées par le système endo-lysosomal. La dysrégulation du tri des cargaisons dans les ETC peut entraîner une perte d'absorption des nutriments, d'un renouvellement des protéines ou d'une homéostasie lipidique, ce qui entraîne de nombreux troubles métaboliques, développementaux et neurologiques1,2. Cependant, en dépit du rôle central des ETC à l'endosome, le mécanisme sous-jacent de la façon dont l'endosome peut coordonner sélectivement l'emballage d'une multitude de cargaisons hétérogènes dans les transporteurs tubulaires n'est pas connu.
La famille de la nexinde de tri (SNX) est une classe évolutivement conservée de protéines qui se sont avérées critiques pour de nombreuses réactions de transport de vésicules dans la cellule3,4,5. Les nexins de tri sont recrutés à la membrane endosome et aident à capturer la cargaison par leur domaine caractéristique d'homologie de phox (PX), qui lie le phosphatidylinositol-3-monophosphate (PtdIns(3)P), un lipide enrichi sur la membrane endosome. Les mammifères codent trente-trois protéines SNX, qui peuvent être encore divisées en plusieurs sous-familles, selon la présence d'autres domaines1. Plus particulièrement, la sous-famille SNX-BAR est la plus grande sous-famille composée de douze chez l'homme, tandis que dans la levure en herbe, Saccharomyces cerevisiae, la sous-famille est réduite à seulement sept SNX-BARs. Les protéines SNX-BAR ont à la fois un domaine PX et un domaine Bin-Amphiphysin-Rvs (BAR) qui déclenche des réservoirs lipidiques pour lier les membranes de courbure positives. Par conséquent, la famille SNX-BAR a une affinité naturelle pour l'endosome et peut médiatisation formation ETC via leurs capacités de remodelage de la membrane. In vitro, les propriétés de remodelage de SNX-BARs peuvent être induites par l'ajout de SNX-BARs purifiés aux liposomes synthétiques et la formation ultérieure de tubules étroits et enduits peut être visualisée par microscopie électronique. En utilisant ces méthodes, les chercheurs ont déterminé que la concentration d'oligomerisation et la force de constriction semblent varier parmi la famille SNX-BAR suggérant qu'ils pourraient aider à la fois dans la formation et la scission des ETC.
Les SNX-BARs peuvent être classés par leurs propriétés de dimerisation exclusives. Des essais de liaison in vitro et des études structurelles ont démontré que les protéines SNX-BAR ne peuvent former que des homodimères ou des hétérodistes spécifiques. Par conséquent, en principe, chaque dimère-oligomère SNX-BAR potentiel pourrait fournir un manteau de tubule pour une voie de trafic spécifique à la cargaison et, de même, l'oligomerisation restreinte des autres protomères SNX-BAR, peut également définir des voies d'exportation distinctes. Cependant, en raison du grand nombre de SNX-BARs et de la diversité au sein de la famille SNX, une hypothèse de chargement nexin-one est très peu probable. Au lieu de cela, un effort coordonné utilisant une multitude de facteurs tels que SNX-BARs, la cargaison, la spécificité lipidique et d'autres dépendances est plus probable. De même, des études récentes de la famille de levure SNX4 ont révélé des preuves pour la spécificité lipidique supplémentaire, au-delà de PtdIns(3)P, pour potentialiser les transporteurs de transport endosome6. Dans cette étude, SNX-BAR homodimer Mvp1-Mvp1 a été purifié à partir de bactéries et les hétérodistes indigènes Snx4-Atg20 et Vps5-Vps17 ont été exprimés et purifiés à haut rendement de levure, tandis que seulement Snx4-Atg20 a été trouvé pour lier de préférence phosphatidylserine (PS) et la forme étroite tube-comme les structures dans les études de liposome liaison6. Alors que d'autres dans le domaine ont révélé des propriétés importantes de la SNX-BARs en utilisant recombinantly purifié SNX-BAR homodimers de bactéries, la toxicité associée à l'expression SNX-BAR hétérodistes dans des systèmes similaires ont entravé leur caractérisation indigène7,8,9,10. Par conséquent, sans un système fiable pour obtenir des hétérodimères natifs exprimés de façon recombinante pure, les chercheurs doivent renoncer à ces lignes d'investigation. Dans la figure 1, nous présentons un flux de travail en quatre parties à 1) construire une souche de levure surexprimant SNX-BAR hétérodistes pour la purification d'affinité tandem, 2) exprimer et purifier les hétérodistes natifs de SNX-BAR, 3) préparer des liposomes synthétiques unilamellar, et 4) mettre en place une tubulation liposome ou des sédimentations d'analyse, fournissant un outil essentiel pour les chercheurs d'étudier le catalogue croissant de nexins de tri trouvés dans la nature.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 micrometer PC Membranes</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>610006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Poly-Prep Chromatography column (Bio-Rad)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>731-1550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27 Gauge needle</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>301629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra Centrifugal Filter with 10K cutoff</td>
			<td>Amicon</td>
			<td>UFC501024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avestin EmulsiFlex-C3 Homogenizer</td>
			<td>Avestin</td>
			<td>EF-C3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA assay</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman Optima MAX-XP Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>393315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4693116001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOPC</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>850375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOPS</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>840035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ergosterol (Sigma)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>47130-U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extruder Set with Block 0.2 microlter/1mL</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>610000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">FEI Tecnai F20 transmission electron microscope (200 kV)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass culture tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>47729-570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG sepharose beads (GE Healthcare)</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0969-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microlter glass syringes</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>7637-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New Brunswick Excella E25</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>M1353-0000</td>
			<td>or equivalent shaking 30 C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA Magnetic Agarose Beads</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>78605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima XE-90 Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A94516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M</td>
			<td>VWR</td>
			<td>52858-076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PI3P</td>
			<td>Echelon</td>
			<td>P-3016</td>
			<td>or Echelon equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate bottle assembly</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>355622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLA-100 Fixed-Angle Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>343840</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type 45 Ti Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Desiccator, Bottom and Lid with Socket Valve</td>
			<td>VWR</td>
			<td>75871-436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Pump Alcatel (Pascal 2005 C1)</td>
			<td>A&#38;J Vacuum</td>
			<td>PN07050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex with foam holder</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10153-838</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR KIT MICROTUBE</td>
			<td>VWR</td>
			<td>12620-880</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

expression, purification, and liposome binding of budding yeast snx-bar heterodimers

Les protéines SNX-BAR sont une classe évolutivement conservée de protéines de remodelage membranaire qui jouent un rôle clé dans le tri et le trafic de protéines et de lipides pendant l'endocytose, le tri dans le système endosomal, et l'autophagie. La fonction protéique SNX-BAR est au cœur de la fonction protéique SNX-BAR, soit la capacité de former des homodimères ou des hétérodistes qui lient les membranes en utilisant des domaines phox-homologie (PX) et BAR (Bin/Amphiphysin/Rvs) très conservés. En outre, l'oligomerisation des diététistes SNX-BAR sur les membranes peut provoquer la formation de tubules et de vésicules membranaires et cette activité est censée refléter leurs fonctions de protéines de couche pour les transporteurs de transport dérivés de l'endosome. Les chercheurs ont longtemps utilisé des études de liaison in vitro utilisant des protéines Recombinantes SNX-BAR sur des liposomes synthétiques ou des vésicules unilamellaires géantes (VGU) pour révéler la composition précise des lipides nécessaires pour conduire le remodelage de la membrane, révélant ainsi leur mécanisme d'action. Cependant, en raison de défis techniques avec les systèmes à double expression, la toxicité de l'expression des protéines SNX-BAR chez les bactéries, et la faible solubilité des protéines SNX-BAR individuelles, la plupart des études à ce jour ont examiné les homodimères SNX-BAR, y compris les dieux non physiologiques qui se forment lors de l'expression chez les bactéries. Récemment, nous avons optimisé un protocole pour surmonter les lacunes majeures d'un système d'expression bactérienne typique. À l'aide de ce flux de travail, nous démontrons comment exprimer et purifier avec succès de grandes quantités d'hétérodistes SNX-BAR et comment les reconstituer sur des liposomes synthétiques pour les essais de liaison et de tubulation.

Ce protocole décrit une méthode de production reproductible et robuste de complexes endogènes de levure SNX-BAR qui peuvent être utilisés pour les essais de remodelage de la membrane en aval (Figure 1). La construction de la souche de levure utilisée pour la purification tire parti de l'efficacité de la recombinaison homologue dans la levure en herbe, permettant des modifications au loci génomique des SNX-BARs ciblés (Figure 2</s...

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Expression, Purification, and Liposome Binding of Budding Yeast SNX-BAR Heterodimers

Ici, nous présentons un flux de travail pour l'expression, la purification et la liaison liposome des hétérodimères DeNX-BAR dans la levure.

Expression, purification et liposome Binding of Budding Yeast SNX-BAR Heterodimers

SNX-BAR proteins are an evolutionarily conserved class of membrane remodeling proteins that play key roles in sorting and trafficking of protein and ...

Les SNX-BARs sont des protéines remodelant la membrane qui jouent un rôle clé dans les maladies humaines. En utilisant nos méthodes, nous pouvons déterminer leurs propriétés biophysiques précises pour faciliter la liaison lipidique et le remodelage de la membrane. La purification des protéines SNB-BAR à partir de cellules de levure permet l’acquisition de dimers homo et hétéro SNX-BAR indigènes tout en minimisant la toxicité et l’insolubilité fréquemment rencontrées avec les systèmes d’expression non indigènes.Nos méthodes peuvent être utilisées pour comprendre les spécificités lipidiques de toutes les levures SNX-BARs ou pour produire des protéines SNX-BAR recombinantes de tout autre organisme. Un assemblage d’extrextruge correct est essentiel pour prévenir la perte de liposome pendant le processus d’extrusion. Pour les étudiants débutants ou ceux qui sont nouveaux sur le terrain, l’observation visuelle des étapes les plus critiques améliorera considérablement vos chances de succès.Commencez par inoculer un grand écouvillon de cellules de levure dans un flacon au moins quatre fois le volume de la culture contenant 50 millilitres de milieu YP standard complété par 2%raffinose et 0,1% glucose comme source de carbone et de cultiver la culture pendant la nuit dans un shaker de 30 degrés Celsius. Le lendemain matin, inoculer la pré-culture de 50 millilitres dans un litre de médium YP standard avec 2% raffinose et 0,1% glucose dans un volume de 2,8 litres déconcerté flacon Fernbach pour une culture de quatre à cinq heures dans l’incubateur secouant. Lorsque la densité optique à 600 nanomètres atteint 0,2, ajouter la galactose à une concentration finale de 2% aux cellules pour une culture nocturne dans l’incubateur secouant.Le lendemain matin, récoltez les cellules par centrifugation et transférez la pastille de levure dans un tube conique de 50 millilitres. Resuspendez la pastille en 15 millilitres de tampon de purification pour atteindre un volume final d’environ 30 millilitres et charger la suspension cellulaire sur un homogénéisateur refroidi à quatre degrés Celsius. Lyse les échantillons à 20 à 25.000 livres par pouce carré pendant deux à trois tours et transférer le lysate dans un nouveau tube conique de 50 millilitres sur la glace.Dégagez immédiatement la cellule lysate par centrifugation et transférez soigneusement le supernatant dans un nouveau tube. Ensuite, équilibrer 300 microlitres de perles IgG Sepharose avec trois re-suspensions dans le tampon de purification avant d’ajouter les perles à la cellule défrichée lysate pour une incubation de deux heures avec rotation à quatre degrés Celsius. À la fin de l’incubation, ajouter les perles à une colonne de chromatographie de 10 millilitres et laisser passer le lysate non lié.Lavez les perles 10 fois avec un millilitre de tampon de lavage par lavage permettant à chaque lavage de circuler complètement avant d’ajouter le volume suivant. Après le dernier lavage, utiliser une pipette et tampon frais pour transférer les perles dans un tube de microcentrifugeuse. Porter le volume total des perles à 500 microlitres avec tampon de lavage frais et enlever les perles du lysate avec deux microlitres de 10 milligrammes par millilitre de protéase TEV pour une incubation d’une nuit avec rotation à quatre degrés Celsius.Le lendemain matin, utilisez une aiguille de calibre 27 pour enlever complètement le surnatant et évaluer la pureté des protéines de 10 % de la page SDS en polyacrylamide. Ensuite, quantifier les protéines concentrées à l’aide de l’analyse des protéines Bradford selon les protocoles standard et stocker la protéine jusqu’à une semaine à quatre degrés Celsius. Pour préparer les liposomes, utilisez des seringues en verre pour transférer les lipides de stock dans un tube propre de culture de verre pour réaliser un mélange final de lipide de 1%phosphatidylinositol-3-phosphate, 20%ergosterol, 30%phosphatidylserine, phosphatidylcholine comme décrit dans le tableau.Selon les solvants dans lequel chaque lipide est réutilisé, le mélange peut devenir trouble à l’ajout de chaque lipide. Séchez soigneusement les mélanges lipidiques en dirigeant le gaz azoté à faible débit vers les mélanges dans un mouvement circulaire pour traiter les lipides uniformément au fond du tube de verre. Enveloppez ensuite le tube de culture de verre avec du papier d’aluminium laissant l’ouverture découverte et déshydratez davantage les lipides dans le vide pendant une heure.À la fin de l’incubation, ajouter 400 microlitres de tampon liant à chaque flacon pour réhydrater complètement les lipides à une concentration finale de liposome de 2,5 millimolaire avant de résusquer les lipides à vitesse moyenne sur un vortex à température ambiante pendant 30 minutes. Le tampon doit devenir trouble à mesure que les lipides sont résuspendus. Transférer les liposomes résuspendus dans un tube de microcentrifugeuse et congeler les tubes dans de l’azote liquide, puis décongeler dans un bain d’eau de 37 degrés Celsius sept à huit fois.Dans une hotte de fumée chimique, nettoyez deux seringues en verre d’un millilitre avec un volume complet de chloroforme trois fois par seringue pour éliminer les lipides résiduels et équilibrer chaque seringue avec deux volumes d’eau ultrapure et deux volumes de tampon liant. Assembler un mini-extruder selon les recommandations du fabricant. Puis submergez deux morceaux de support de filtre dans une membrane de 200 nanomètres dans le tampon de liaison.Il est important d’assembler le mini-extruder de sorte qu’il soit complètement hermétique. Et une bonne façon de vérifier les fuites est de passer tampon à travers l’appareil. Sandwich de la membrane entre les supports de filtre et placez la membrane dans le mini-extrème.À l’aide d’une des seringues d’un millilitre équilibrées, passez un volume de tampon liant semblable au volume du mélange liposome à travers le mini-extrème et utilisez l’autre seringue pour laisser tomber le mélange liposome inversant le tube de microcentrifugeuse pour recueillir le dernier des liposomes dans le bouchon de tube pour leur collection. Puis extruder les liposomes à travers la membrane de 200 nanomètres 19 à 21 fois et de recueillir les liposomes extrudés dans un nouveau tube de microcentrifugeuse. Avant d’effectuer les analyses de fixation et de tubulation liposome SNX-BAR, pré-effacer la protéine purifiée par ultracentrifugation et transférer le supernatant dans un nouveau tube de microcentrifugeuse sans déranger la pastille.Ensuite, incuber quatre micromolaires de SNX4-ATG20 purifié et 2,5 millimolaires de liposomes dans un volume de réaction total de 20 microlitres pour une incubation de 30 minutes à 30 degrés Celsius. Pour visualiser et quantifier la tubulation liposome, à la fin de l’incubation, placez immédiatement les échantillons sur une grille en maille de cuivre recouverte de carbone et une tache négative avec 1 % d’acétate d’uranyle. Ensuite, analyser les échantillons sur un microscope électronique de transmission à 200 kilovolts.Pour la liaison et la sédimentation liposome, transférer 20 microlitres de la réaction à un tube de centrifugeuse en polycarbonate et faire tourner l’échantillon avec un routeur compatible dans une ultracentrifugeuse. À la fin de la centrifugation, transférez soigneusement le supernatant dans un nouveau tube de microcentrifugeuse et réutilisez la pastille dans 40 microlitres de tampon d’échantillon de page SDS. Transférer la suspension à granulés dans un nouveau tube de microcentrifugeuse et ajouter 20 microlitres de tampon d’échantillon au supernatant.Chargez ensuite des volumes équivalents d’échantillons de granulés et de supernatants sur un gel de page SDS à 10 % de polyacrylamide et effectuez la coloration Coomassie pour visualiser les SNX-BARs liés aux liposomes. Pour vérifier l’induction appropriée de l’expression SNX-BAR, une tache occidentale contre l’étiquette de purification d’affinité de tandem peut être employée car les niveaux de protéine des SNX-BARs peuvent ne pas être détectés par l’intermédiaire de la tache de Coomassie. Après la purification de l’heterodimer SNX-BAR, les bandes des deux SNX-BARs devraient apparaître dans un rapport stoichiométrique un-à-un et il devrait y avoir peu ou pas de bandes contaminantes.Dans cette analyse représentative, des heterodimers de SNX-BAR ont été exprimés, purifiés, et liés aux liposomes synthétiques comme démontré. Notez que MVP1 formé homodimers et a été exprimé en bactéries comme prévu. La liaison SNX-BAR à différentes compositions liposome pourrait être quantifiée par densitométrie pour évaluer les effets de la phosphatidylserine par exemple sur la liaison liposome.L’imagerie par microscopie électronique permet de mesurer les tubules liposome SNX4-ATG20, la plupart des tubules ayant généralement un diamètre compris entre 14 et 26 nanomètres. Notez que les SNX-BARs purifiés peuvent être reconstitués avec des complexes de capture de cargaison sur des liposomes pour comprendre comment les assemblages complets peuvent influencer le remodelage de membrane. En comparant la liaison de différentes combinaisons de dimers purifiés de SNX-BAR aux liposomes synthétiques composés de différents lipides, les protéines de SNX-BAR se sont trouvées pour posséder des préférences distinctes de liaison de lipide.Travaillez toujours dans une hotte lors de la manipulation du chloroforme et assurez-vous de porter le PPE approprié lors de la manipulation des objets tranchants ou des matériaux en verre.

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetic Engineering of an Unconventional Yeast for Renewable Biofuel and Biochemical Production

Génie génétique d&#39;une levure Unconventional for Renewable Biofuel and Production Biochemical

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Recherche

Génétique

Analysis of Cap-binding Proteins in Human Cells Exposed to Physiological Oxygen Conditions

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Translational control is a focal point of gene regulation, especially during periods of cellular stress. Cap-dependent translation via the eIF4F complex ...

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