Name: expression, purification, and liposome binding of budding yeast snx-bar heterodimers
Uploaded: 2019-12-06T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Expression, Purification, and Liposome Binding of Budding Yeast SNX-BAR Heterodimers at JoVE.com

המחקר שדווח בפרסום זה נתמך על ידי המכון הלאומי למדעי הרפואה הכללית של המכון הלאומי לבריאות תחת מספר הפרס GM060221 ובחלקו על ידי המוסד הלאומי למדעי הרפואה הכללית של המוסדות הלאומיים של בריאות תחת מספר הפרס T32GM007223. מ. פ. הייתה נתמכת בחלקו על ידי תוכנית המענקים למחקר של הפקולטה UNC-שארלוט.

1. שמרים הזנים הבנייה
<ol><li>התחל עם TVY614 (pep4Δ:: LEU2 Prb1Δ:: Hisg prc1Δ:: HIS3)11 כמתח האב. זן זה הוא לקוי של הפרוטאוסיס החלבונים, אשר תורמים הרוב של השפלה חלבון לאחר הליזה התאים, ולכן מאפשר טיהור נקי ויעיל יותר.</li>
	<li>עיצוב התחל12 ולשלב טיהור האהדה הדו (ברז) תג ב-C הטרמי?...

<ol>
	<li>Teasdale, R. D., Collins, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+the+PX+(phox-homology)+domain+and+SNX+(sorting+nexin)+protein+families:+structures,+functions+and+roles+in+disease.">Insights into the PX (phox-homology) domain and SNX (sorting nexin) protein families: structures, functions and roles in disease.</a> The Biochemical Journal. 441 (1), 39-59 (2012).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Retromer+Complex+and+Sorting+Nexins+in+Neurodegenerative+Diseases.">The Retromer Complex and Sorting Nexins in Neurodegenerative Diseases.</a> Frontiers in Aging Neuroscience. 10, 79 (2018).</li><li>Burd, C., Cullen, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retromer:+a+master+conductor+of+endosome+sorting.">Retromer: a master conductor of endosome sorting.</a> Cold Spring Harbor perspectives in Biology. 6 (2), (2014).</li><li>Chi, R. J., Harrison, M. S., Burd, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogenesis+of+endosome-derived+transport+carriers.">Biogenesis of endosome-derived transport carriers.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 72 (18), 3441-3455 (2015).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endosomal+receptor+trafficking:+Retromer+and+beyond.">Endosomal receptor trafficking: Retromer and beyond.</a> Traffic (Copenhagen, Denmark). 19 (8), 578-590 (2018).</li><li>Ma, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+trafficking+by+yeast+Snx4+family+SNX-BAR+proteins+promotes+autophagy+and+vacuole+membrane+fusion.">Lipid trafficking by yeast Snx4 family SNX-BAR proteins promotes autophagy and vacuole membrane fusion.</a> Molecular Biology of the Cell. , (2018).</li><li>van Weering, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+for+SNX-BAR-mediated+assembly+of+distinct+endosomal+sorting+tubules.">Molecular basis for SNX-BAR-mediated assembly of distinct endosomal sorting tubules.</a> The EMBO Journal. 31 (23), 4466-4480 (2012).</li><li>Chi, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fission+of+SNX-BAR-coated+endosomal+retrograde+transport+carriers+is+promoted+by+the+dynamin-related+protein+Vps1.">Fission of SNX-BAR-coated endosomal retrograde transport carriers is promoted by the dynamin-related protein Vps1.</a> The Journal of Cell Biology. 204 (5), 793-806 (2014).</li><li>Purushothaman, L. K., Arlt, H., Kuhlee, A., Raunser, S., Ungermann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retromer-driven+membrane+tubulation+separates+endosomal+recycling+from+Rab7/Ypt7-dependent+fusion.">Retromer-driven membrane tubulation separates endosomal recycling from Rab7/Ypt7-dependent fusion.</a> Molecular Biology of the Cell. 28 (6), 783-791 (2017).</li><li>Purushothaman, L. K., Ungermann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cargo+induces+retromer-mediated+membrane+remodeling+on+membranes.">Cargo induces retromer-mediated membrane remodeling on membranes.</a> Molecular Biology of the Cell. 29 (22), 2709-2719 (2018).</li><li>Wurmser, A. E., Emr, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphoinositide+signaling+and+turnover:+PtdIns(3)P,+a+regulator+of+membrane+traffic,+is+transported+to+the+vacuole+and+degraded+by+a+process+that+requires+lumenal+vacuolar+hydrolase+activities.">Phosphoinositide signaling and turnover: PtdIns(3)P, a regulator of membrane traffic, is transported to the vacuole and degraded by a process that requires lumenal vacuolar hydrolase activities.</a> The EMBO journal. 17 (17), 4930-4942 (1998).</li><li>Puig, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tandem+affinity+purification+(TAP)+method:+a+general+procedure+of+protein+complex+purification.">The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification.</a> Methods. 24 (3), 218-229 (2001).</li><li>Kushnirov, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+reliable+protein+extraction+from+yeast.">Rapid and reliable protein extraction from yeast.</a> Yeast. 16 (9), 857-860 (2000).</li><li>Longtine, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Additional+modules+for+versatile+and+economical+PCR-based+gene+deletion+and+modification+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Additional modules for versatile and economical PCR-based gene deletion and modification in Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 14 (10), 953-961 (1998).</li><li>Tropea, J. E., Cherry, S., Waugh, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+purification+of+soluble+His(6)-tagged+TEV+protease.">Expression and purification of soluble His(6)-tagged TEV protease.</a> Methods in Molecular Biology. 498, 297-307 (2009).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphology+and+structure+of+lipoproteins+revealed+by+an+optimized+negative-staining+protocol+of+electron+microscopy.">Morphology and structure of lipoproteins revealed by an optimized negative-staining protocol of electron microscopy.</a> Journal of Lipid Research. 52 (1), 175-184 (2011).</li><li>Yong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+purification+of+the+SNX1/SNX6+complex.">Expression and purification of the SNX1/SNX6 complex.</a> Protein Expression and Purification. 151, 93-98 (2018).</li></ol>

כאן, אנו מדגימים זרימת עבודה ממוטבת כדי לטהר את SNX-בר דימרס ב שמרים ושני שאומר להעריך את המאפיינים הביופיסיים שלהם על ליפוזומים סינתטיים. היתרון העיקרי על הביטוי האופייני חלבון רקומביננטי ב es, coli או מערכות אחרות היא היכולת לבטא באופן שווה את החלבונים SNX-BAR במארח יליד, ובכך הימנעות רעילו...

ממברנה מאוגד אורגלים כגון קרום הפלזמה, הרשתית האנדופלזמית, מנגנון golgi, ליזוזום (שמרים בלואים), ו אנדוטיפ מהווים את מערכת endomembrane של התא איקריוטית. לרוב המארגנים יש את היכולת לתקשר ולהחליף חומר עם מנשאים אחרים באמצעות נושאות הובלה של שלפוחית לפוחית. כיצד התא מתאם את האריזה והיווצרות של נושאות הובלה שלפוחית לפוחית בתוך מערכת endomembrane אינו מובן היטב. עם זאת, החלבונים והשומנים המהווים חלק ניכר מהמערכת הendomembrane, ידועים כנובעים מהפנמה ושלפוחיות מקרום הפלזמה (PM). האנדוכמה היא הקבלה העיקרית לשלפוחיות אלה והיא מורכבת ממספר סטים של מערכות מחוברות. הפונקציה העיקרית של אנדוכמה היא להקל על רכישת מזינים, לווסת חלבון ומחזור השומנים, להגן מפני זיהום הפתוגן, ולשמש מקור החידוש העיקרי של שומנים עבור קרום הפלזמה. כמו אנדוכמה מקבל את רוב המטען של חלבונים ושומנים מקרום הפלזמה, הוא משמש תא מיון על ידי בידוד מטענים לתוך נושאות הובלה אנדוזומלית צינורי (etcs). חלבונים שאינם מחולק ל-ETCs נותרו להיות מושפל באמצעות מערכת האנדו-ליסוזומל. דיסרגולציה של מיון מטענים לתוך etcs יכול להוביל לאובדן ספיגת מזינים, מחזור החלבון או הומאוסטזיס ליפיד, וכתוצאה מכך רבים מטבולית, התפתחותית, הפרעות נוירולוגיות1,2. עם זאת, למרות התפקיד המרכזי etcs ב אנדוכמה, המנגנון הבסיסי של איך אנדוכמה יכול באופן סלקטיבי לתאם את האריזה של המון מטענים הטרוגנית לתוך נושאות צינורי אינו ידוע.
המשפחה nexin מיון (snx) הוא מחלקה שימור אבולוציונית של חלבונים שנמצאו להיות קריטי עבור תגובות הובלה שלפוחית רבים בתא3,4,5. מיון nexins מגויסים הממברנה אנדוזום וסיוע בלכידת מטענים באמצעות מאפיין phox הומולוגיה האופיינית (PX), אשר מאגד זרחן-monophosphate (2), השומנים מועשר בקרום אנדוזום. יונקים לקודד 33 SNX חלבונים, אשר ניתן לחלק עוד לתוך משפחות משנה מרובות, על פי נוכחותם של תחומים אחרים1. בעיקר, SNX-BAR משפחה היא המשפחה המשנה הגדולה ביותר המורכבת של שתים עשרה בבני אדם, בעוד שמרים להאביק, סכביסים cerevisiae ס, משפחת התת מופחת רק שבעה snx-בארים. החלבונים SNX-BAR יש גם תחום PX וגם Bin-אמפיפילוסין-מ א (בר) התחום המפעיל מאגרים שומנים לאגד ממברנות עקמומיות חיובית. אפוא, משפחת SNX-BAR יש זיקה טבעית עבור אנדוזום והוא יכול לתווך ועוד היווצרות דרך שיפוץ הממברנה שלהם יכולות. ב מבחנה, תכונות שיפוץ של SNX-ברים יכול להיגרם על ידי תוספת של מטוהרים SNX-בארים ליפוזומים סינתטיים והיווצרות בעקבות צרה, tubules מצופה יכול להיות מדמיין על ידי אלקטרון מיקרוסקופ. באמצעות שיטות אלה, החוקרים קבעו כי גם ריכוז oligomerization וכוח מכווץ להיראות להשתנות בין משפחת SNX-BAR רומז שהם יכולים לסייע הן היווצרות המספריים של ETCs.
ה-SNX-פסי יכול להיות מסווג עוד יותר על ידי מאפייני dimerization בלעדית שלהם. בעלי מבחנה מתורבת ומחקרים מבניים הוכיחו כי החלבונים SNX-BAR יכול רק ליצור הומודימרים ספציפיים או הטרודיומרס. לכן, בעיקרון, כל פוטנציאל SNX-בר dimer-oligomer יכול לספק מעיל כדורית עבור מסלול מטען ספציפי הסחר ובדומה, oligomeriטיזציה מוגבלת של אחרים SNX-BAR protomers, יכול גם להגדיר שבילים ייצוא ברורים. עם זאת, בשל המספר הגדול של SNX-ברים וגיוון בתוך משפחת SNX, מיון אחד nexin-השערת מטען אחד הוא מאוד סביר. במקום זאת מאמץ מתואם באמצעות ריבוי של גורמים כגון SNX-ברים, מטענים, ספציפיות לשומנים ויחסי תלות אחרים סביר יותר. כמו כן, מחקרים שנעשו לאחרונה של משפחת שמרים SNX4 חשף ראיות לפרטים נוספים ליפיד, מעבר ל-Dins (3) P, כדי להיות הפוטנציאל של ספקיות התחבורה6. במחקר זה, snx-BAR הומודימר Mvp1-Mvp1 היה מטוהר מן החיידקים הטרודימרים הילידים Snx4-Atg20 ו Vps5-Vps17 ביטאו ומטוהרים בתשואה גבוהה של שמרים, בעוד Snx4-Atg20 נמצא להיות מרוצה באופן מיותר מחייב פוספוליייסרין (PS) וטופסמבנים כמו צינור צר ליפוכמה מ בעוד אחרים בשדה חשפו תכונות חשובות של snx-ברים באמצעות recombinantly מטוהרים snx-בר הומודימרס מן החיידקים, רעילות הקשורים בהבעת snx-bar הטרודימרס במערכות דומות הפריע האפיון המקורי שלהם7,8,9,10. לכן, ללא מערכת אמינה כדי להשיג recombinantly טהורה ביטא הטרודימרים הילידים, החוקרים חייבים לוותר על שורות אלה של חקירה. באיור 1, אנו מציגים זרימת עבודה ארבעה חלקים ל 1) לבנות זן שמרים להביע את הביטוי snx-BAR הטרודימרים עבור טיהור האהדה הדו, 2) מהיר ומטהר מקורי snx-BAR הטרודימרס, 3) להכין ליפוזומים unilamellar סינתטיים, ו 4) להגדיר ליפוכמה בעיות או מדידים, מתן כלי חיוני עבור חוקרים לחקור את הקטלוג הגדל של מיון nexins נמצא בטבע.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 micrometer PC Membranes</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>610006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Poly-Prep Chromatography column (Bio-Rad)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>731-1550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27 Gauge needle</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>301629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra Centrifugal Filter with 10K cutoff</td>
			<td>Amicon</td>
			<td>UFC501024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avestin EmulsiFlex-C3 Homogenizer</td>
			<td>Avestin</td>
			<td>EF-C3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA assay</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman Optima MAX-XP Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>393315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4693116001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOPC</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>850375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOPS</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>840035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ergosterol (Sigma)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>47130-U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extruder Set with Block 0.2 microlter/1mL</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>610000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">FEI Tecnai F20 transmission electron microscope (200 kV)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass culture tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>47729-570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG sepharose beads (GE Healthcare)</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0969-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microlter glass syringes</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>7637-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New Brunswick Excella E25</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>M1353-0000</td>
			<td>or equivalent shaking 30 C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA Magnetic Agarose Beads</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>78605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima XE-90 Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A94516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M</td>
			<td>VWR</td>
			<td>52858-076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PI3P</td>
			<td>Echelon</td>
			<td>P-3016</td>
			<td>or Echelon equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate bottle assembly</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>355622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLA-100 Fixed-Angle Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>343840</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type 45 Ti Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Desiccator, Bottom and Lid with Socket Valve</td>
			<td>VWR</td>
			<td>75871-436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Pump Alcatel (Pascal 2005 C1)</td>
			<td>A&#38;J Vacuum</td>
			<td>PN07050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex with foam holder</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10153-838</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR KIT MICROTUBE</td>
			<td>VWR</td>
			<td>12620-880</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

expression, purification, and liposome binding of budding yeast snx-bar heterodimers

החלבונים SNX-BAR הם מחלקה שימור אבולוציונית של שיפוץ הממברנה חלבונים המשחקים תפקידי מפתח במיון ובסחר של חלבונים ושומנים במהלך אנדוקציטוזה, מיון בתוך מערכת אנדוזוממית, ו האוטומטית. מרכזי לפונקציה SNX-BAR חלבון היא היכולת ליצור הומודימרס או הטרודימרים הקושרים ממברנות באמצעות שימור מאוד phox-הומולוגיה (PX) ו בר (Bin/אמפיפילפסין/מ א) תחומים. בנוסף, oligomerization של SNX-בר דימרס על ממברנות יכול לעורר את היווצרות tubules קרום ושלפוחיות ופעילות זו היא חשבה לשקף את התפקודים שלהם כמו חלבונים מעיל עבור הובלה אנדובית נגזר. החוקרים מנוצלים זמן רב במחקרים מחייב מבחנה באמצעות רקומביננטי SNX-BAR חלבונים על ליפוזומים סינתטיים או unilamellar שלפוחיות ענק (GUVs) כדי לחשוף את האיפור המדויק של שומנים הדרושים כדי לנהוג שיפוץ הממברנה, ובכך לחשוף את המנגנון שלהם של פעולה. עם זאת, בשל אתגרים טכניים עם מערכות ביטוי כפול, רעילות של ביטוי חלבון SNX-BAR בחיידקים, ואת מסיסות העניים של הפרט SNX-BAR חלבונים, רוב המחקרים עד כה נבדקו SNX-בר הומודימרס, כולל di, שאינם פיסיולוגיים הטופס במהלך הביטוי בחיידקים. לאחרונה, יש לנו אופטימיזציה פרוטוקול כדי להתגבר על החסרונות העיקריים של מערכת ביטויים טיפוסית בקטריאלי. באמצעות זרימת עבודה זו, אנו מדגימים כיצד לבטא ולטהר בהצלחה כמויות גדולות של הטרודימרים SNX-BAR וכיצד ליצור מחדש אותם על ליפוזומים סינתטיים עבור כריכה ובטלציה assays אמר.

פרוטוקול זה מתאר שיטה להפקת הייצור החזק של שמרים אנדוגניים מתחמי מערכות snx-BAR שניתן להשתמש בהם עבור שיפוץ קרום המטה ממברנה בחני (איור 1). הבנייה של זן שמרים המשמש לטיהור מנצל את היעילות של שילוב מחדש של הומוולוגי ב שמרים הנצה, המאפשר שינויים בבית גנומית של ה?...

Watch this Scientific Journal Video about Expression, Purification, and Liposome Binding of Budding Yeast SNX-BAR Heterodimers at JoVE.com

Expression, Purification, and Liposome Binding of Budding Yeast SNX-BAR Heterodimers

כאן, אנו מציגים זרימת עבודה עבור הביטוי, טיהור וליפופי מחייב של SNX-BAR הטרודימרים ב שמרים.

ביטוי, טיהור, וליפוזום קשירה של שמרים מסוג SNX-BAR הטרודיורס

SNX-BAR proteins are an evolutionarily conserved class of membrane remodeling proteins that play key roles in sorting and trafficking of protein and ...

SNX-BARs הם חלבונים שיפוץ קרום לשחק תפקידי מפתח במחלות אנושיות. באמצעות השיטות שלנו, אנו יכולים לקבוע את המאפיינים הביופיזיים המדויקים שלהם כדי להקל על קשירה שומנים ושיפוץ קרום. טיהור חלבוני SNB-BAR מתאים שמרים מאפשר רכישה של דימרים מקוריים של הומואים והטרו SNX-BAR תוך מזעור הרעילות וחדלות הפירעון שנתקלים בהם לעתים קרובות עם מערכות ביטוי שאינן מקוריות.השיטות שלנו ניתן להשתמש כדי להבין את הספציפיות השומנים של כל שמרים SNX-BARs או לייצר חלבונים SNX-BAR רקומביננטי מכל אורגניזם אחר. הרכבה נכונה של שולט חיונית למניעת אובדן ליפוזום במהלך תהליך ההבלטה. עבור סטודנטים מתחילים או חדשים בתחום, התבוננות ויזואלית בצעדים הקריטיים ביותר תשפר מאוד את סיכויי ההצלחה שלך.התחל על ידי חיסון ספוגית גדולה של תאי שמרים לתוך בקבוקון לפחות ארבע פעמים את נפח התרבות המכילה 50 מיליליטר של מדיום YP סטנדרטי בתוספת 2%raffinose ו 0.1% גלוקוז כמקור פחמן ולהגדיל את התרבות לילה שייקר 30 מעלות צלזיוס. למחרת בבוקר, לחסן את 50 מיליליטר טרום תרבות בליטר אחד של מדיום YP סטנדרטי עם 2%raffinose ו 0.1% גלוקוז בנפח 2.8 ליטר בלבל בקבוק פרנבאך לתרבות של ארבע עד חמש שעות באינקובטור רועד. כאשר הצפיפות האופטית ב 600 ננומטר מגיע 0.2, להוסיף גלקטוז לריכוז סופי של 2% לתאים לתרבות לילה באינקובטור רועד.למחרת בבוקר, לקצור תאים על ידי צנטריפוגה ולהעביר את גלולת שמרים לתוך צינור חרוט 50 מיליליטר. תן את גלולה ב 15 מיליליטר של חיץ טיהור כדי להשיג נפח סופי של כ 30 מיליליטר ולהעמיס את ההשעיה התא על homogenizer מקורר לארבע מעלות צלזיוס. Lyse הדגימות ב 20 כדי 25, 000 פאונד לאינץ 'מרובע במשך שניים עד שלושה סיבובים ולהעביר את lysate לתוך צינור חרוט חדש 50 מיליליטר על קרח.מיד לנקות את התא lysate על ידי צנטריפוגה בזהירות להעביר את supernatant לתוך צינור חדש. לאחר מכן, לצייד 300 microliters של חרוזי IgG Sepharose עם שלושה מתלים מחדש במאגר טיהור לפני הוספת חרוזים לתא פינה lysate עבור דגירה של שעתיים עם סיבוב בארבע מעלות צלזיוס. בסוף הדגירה, מוסיפים את חרוזים לעמוד כרומטוגרפיה של 10 מיליליטר ומאפשרים לליסנט הלא מאוגד לזרום דרכו.לשטוף את חרוזים 10 פעמים עם מיליליטר אחד של חיץ לשטוף לכל לשטוף המאפשר לכל לשטוף לזרום דרך לחלוטין לפני הוספת הנפח הבא. לאחר הכביסה האחרונה, השתמש פיפטה חיץ טרי כדי להעביר את חרוזים לתוך צינור microcentrifuge. להביא את הנפח הכולל של חרוזים ל 500 microliters עם חיץ לשטוף טרי ולהסיר את חרוזים מן lysate עם שני microliters של 10 מיליגרם למיליליטר TEV פרוטאז עבור דגירה לילה עם סיבוב בארבע מעלות צלזיוס.למחרת בבוקר, להשתמש במחט מד 27 כדי להסיר את העל טבעי לחלוטין ולהעריך את טוהר החלבון על ידי 10% polyacrylamide SDS דף. לאחר מכן לכמת את החלבונים המרוכזים באמצעות מיסי חלבון ברדפורד על פי פרוטוקולים סטנדרטיים ולאחסן את החלבון עד שבוע בארבע מעלות צלזיוס. כדי להכין את ליפוזומים, להשתמש במזרקי זכוכית כדי להעביר שומנים במלאי לתוך צינור תרבות זכוכית נקייה כדי להשיג תערובת שומנים סופית של 1%פוספטידילינוזיטול-3-פוספט, 20%ergosterol, 30%פוספטידילסרין, פוספטידילכולין כמתואר בטבלה.בהתאם ממסים כל שומנים הוא resuspended ב, התערובת עשויה להפוך מעונן על תוספת של כל השומנים. בזהירות לייבש את תערובות השומנים על ידי הפניית גז חנקן בזרימה נמוכה על תערובות בתנועה מעגלית לטיפול שומנים באופן אחיד בתחתית צינור הזכוכית. ואז לעטוף את צינור תרבות הזכוכית עם נייר כסף עוזב את הפתח חשוף עוד יותר לייבש את השומנים בוואקום במשך שעה אחת.בסוף הדגירה, מוסיפים 400 מיקרוליטרים של חיץ מחייב לכל בקבוקון כדי לייבש לחלוטין את השומנים בריכוז ליפוזום סופי של 2.5 מילימולרים לפני שימוש חוזר בשומנים במהירות בינונית על מערבולת בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות. החיץ צריך להיות מעונן כמו שומנים הם resuspended. מעבירים את ליפוזומים המתווסכלים לצינור מיקרוצנטריפוגה ומקפיאים את הצינורות בחנקן נוזלי ואחריו הפשרה באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס שבע עד שמונה פעמים.במכסה המנוע של אדים כימיים, נקה שני מזרקי זכוכית מיליליטר אחד עם נפח מלא של כלורופורם שלוש פעמים לכל מזרק כדי להסיר את כל השומנים שיורית לצייד כל מזרק עם שני כרכים של מים ultrapure ושני כרכים של חיץ מחייב. להרכיב מיני extruder על פי המלצות היצרן. לאחר מכן תטביע שתי חתיכות של תמיכה במסנן בממברנה אחת של 200 ננומטר במאגר כריכה.חשוב להרכיב את ה- mini-extruder כך שהוא אטום לחלוטין. ודרך טובה לבדוק אם יש דליפות היא להעביר חיץ דרך המכשיר. כריך את הממברנה בין תומך המסנן והנח את הממברנה במיני-אקסטרודר.באמצעות אחד המזרקים מיליליטר אחד, להעביר נפח של חיץ מחייב דומה לנפח של תערובת ליפוזום דרך mini-extruder ולהשתמש במזרק השני כדי להפיל את תערובת ליפוזום היפוך צינור microcentrifuge כדי לאסוף את האחרון של ליפוזומים לתוך כובע הצינור עבור האוסף שלהם. ואז להחדיר את ליפוזומים דרך קרום 200 ננומטר 19 עד 21 פעמים ולאסוף את ליפוזומים מובלטים לתוך צינור microcentrifuge חדש. לפני ביצוע בדיקות קשירה וחוסם ליפוזום SNX-BAR, לנקות מראש את החלבון המטוהר על ידי אולטרהצנטריפוגה ולהעביר את supernatant לצינור microcentrifuge חדש מבלי להפריע גלולה.לאחר מכן, הדגירה ארבעה micromolar של SNX4-ATG20 מטוהרים ו 2.5 מילימולר של ליפוזומים בנפח התגובה הכולל של 20 microliters עבור דגירה של 30 דקות ב 30 מעלות צלזיוס. כדי לדמיין ולכרות את צינורית ליפוזום, בסוף הדגירה, מיד לזהות את הדגימות על רשת נחושת מצופה פחמן וכתם שלילי עם 1% אורניל אצטט. ואז לנתח את הדגימות על מיקרוסקופ אלקטרונים שידור ב 200 קילובולטים.עבור קשירה liposome ומעים, להעביר 20 microliters של התגובה צינור צנטריפוגה פוליקרבונט ולסובב את המדגם עם נתב תואם אולטרהצנטריפוגה. בסוף הצנטריפוגה, בזהירות להעביר את supernatant לצינור microcentrifuge חדש resuspend גלולה ב 40 microliters של מאגר מדגם דף SDS. העבר את ההשעיה גלולה לצינור microcentrifuge חדש ולהוסיף 20 microliters של מאגר מדגם על טבעי.לאחר מכן לטעון כמויות מדגם שוות ערך של גלולה ועל טבעי על 10%polyacrylamide SDS ג'ל דף ולבצע כתמים קומאסי כדי לדמיין את SNX-BARs מאוגד ליפוזומים. כדי לבדוק אינדוקציה נכונה של ביטוי SNX-BAR, כתם מערבי נגד תג טיהור זיקה טנדם יכול לשמש כמו רמות החלבון של SNX-BARs לא ניתן לזהות באמצעות כתם קומאסי. לאחר טיהור ההטרודימר SNX-BAR, הרצועות של שני SNX-BARs אמורות להופיע ביחס סטואיכומטרי של אחד לאחד ולא אמורות להיות מעט להקות מזהמות.בניתוח מייצג זה, הטרודימרים SNX-BAR באו לידי ביטוי, מטוהרים, וכבול ליפוזומים סינתטיים כפי שהוכח. שים לב כי MVP1 יצר הומודימרים והתבטא בחיידקים כצפוי. SNX-BAR מחייב קומפוזיציות ליפוזום משתנות יכול להיות מכומת על ידי densitometry כדי להעריך את ההשפעות של phosphatidylserine למשל על איגוד ליפוזום.הדמיה מיקרוסקופית אלקטרונים מאפשרת את המדידה של צינוריות ליפוזום SNX4-ATG20 עם רוב הצינוריות בדרך כלל בעל קטרים בין 14 ל 26 ננומטר. שים לב כי SNX-BARs מטוהרים ניתן reconstituted עם מתחמי לכידת מטען על ליפוזומים כדי להבין כיצד הרכבות מלאות יכול להשפיע על שיפוץ קרום. כאשר משווים את הכריכה של שילובים שונים של עמעומי SNX-BAR מטוהרים לליפוזומים סינתטיים המורכבים משומנים שונים, נמצאו חלבוני SNX-BAR בעלי העדפות מחייבות שומנים ברורות.תמיד לעבוד ברדס בעת טיפול כלורופורם הקפד ללבוש את PPE הנכון בעת טיפול חדים או חומר זכוכית.

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetic Engineering of an Unconventional Yeast for Renewable Biofuel and Biochemical Production

הנדסה גנטית של שמרים לא קונבנציונליים עבור Biofuel מתחדשת והפקה ביוכימיים

Yarrowia lipolytica is a non-pathogenic, dimorphic and strictly aerobic yeast species. Owing to its distinctive physiological features and metabolic ...

Analysis of Cap-binding Proteins in Human Cells Exposed to Physiological Oxygen Conditions

ניתוח של חלבונים קושרי שווי בתאים אנושיים חשופים לתנאי חמצן פיזיולוגיים

Translational control is a focal point of gene regulation, especially during periods of cellular stress. Cap-dependent translation via the eIF4F complex ...

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

ממוקד<em&gt; באתרו</em&gt; גני mutagenesis של היסטון שמרים הנץ

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting ...

Production and Purification of Baculovirus for Gene Therapy Application

ייצור, טיהור של Baculovirus עבור יישום ריפוי גנטי

Baculovirus has traditionally been used for the production of recombinant protein and vaccine. However, more recently, baculovirus is emerging as a ...

Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere

לחקור את השורש Microbiome: שליפת נתונים הקהילה חיידקי מן האדמה, Rhizosphere, Endosphere שורש

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to ...

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization (smFISH) Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

קרינה פלואורסצנטית מולקולה בודדת ב באתרו הכלאה (smFISH) ניתוח הנצה גידול וגטטיבי שמרים, מיוזה

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect ...

Informatic Analysis of Sequence Data from Batch Yeast 2-Hybrid Screens

Informatic ניתוח של נתוני רצף אצווה שמרים 2-היברידית המסכים

We have adapted the yeast 2-hybrid assay to simultaneously uncover dozens of transient and static protein interactions within a single screen utilizing ...

Mating-based Overexpression Library Screening in Yeast

ביטוי ההזדווגות מבוססי ספריית הקרנה שמרים

Budding yeast has been widely used as a model in studying proteins associated with human diseases. Genome-wide genetic screening is a powerful tool ...

A Deep-sequencing-assisted, Spontaneous Suppressor Screen in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe

A Deep-sequencing-assisted, Spontaneous Suppressor Screen in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe

מסך משתיק קול עמוק רצף-בסיוע, ספונטני ב ביקוע שמרים שמר הביקוע

A genetic screen for mutant alleles that suppress phenotypic defects caused by a mutation is a powerful approach to identify genes that belong to closely ...

Enhanced Yeast One-hybrid Screens To Identify Transcription Factor Binding To Human DNA Sequences

מסכי אחד-היברידית משופרת שמרים לזהות גורם שעתוק מחייב את רצפי דנ א אנושי

Identifying the sets of transcription factors (TFs) that regulate each human gene is a daunting task that requires integrating numerous experimental and ...