Name: expression, purification, and liposome binding of budding yeast snx-bar heterodimers
Uploaded: 2019-12-06T12:00:00
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本書で報告された研究は、国立衛生研究所総合医科学研究所が受賞番号GM060221の下で、また国立研究所総合医科学研究所によって一部支援された。賞番号T32GM007223の下で健康の。R.C.はUNC-シャーロット教員研究助成プログラムの一部で支援されました。

1. 酵母ひずみ構造
<ol><li>TVY614(pep4Δ::LEU2 prb1Δ::hisG prc1Δ::HIS3)11から始めます。この株は、細胞分解後のタンパク質分解の大部分に寄与する空胞プロテアーゼに欠乏し、したがって、よりクリーンで効率的な精製を可能にする。</li>
	<li>設計プライマー12と相同組換えを用いてAtg20(SNX-BAR ORF1)のC末端でタンデム親和性精製(TAP)タグを統合する...

<ol>
	<li>Teasdale, R. D., Collins, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+the+PX+(phox-homology)+domain+and+SNX+(sorting+nexin)+protein+families:+structures,+functions+and+roles+in+disease.">Insights into the PX (phox-homology) domain and SNX (sorting nexin) protein families: structures, functions and roles in disease.</a> The Biochemical Journal. 441 (1), 39-59 (2012).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Retromer+Complex+and+Sorting+Nexins+in+Neurodegenerative+Diseases.">The Retromer Complex and Sorting Nexins in Neurodegenerative Diseases.</a> Frontiers in Aging Neuroscience. 10, 79 (2018).</li><li>Burd, C., Cullen, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retromer:+a+master+conductor+of+endosome+sorting.">Retromer: a master conductor of endosome sorting.</a> Cold Spring Harbor perspectives in Biology. 6 (2), (2014).</li><li>Chi, R. J., Harrison, M. S., Burd, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogenesis+of+endosome-derived+transport+carriers.">Biogenesis of endosome-derived transport carriers.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 72 (18), 3441-3455 (2015).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endosomal+receptor+trafficking:+Retromer+and+beyond.">Endosomal receptor trafficking: Retromer and beyond.</a> Traffic (Copenhagen, Denmark). 19 (8), 578-590 (2018).</li><li>Ma, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+trafficking+by+yeast+Snx4+family+SNX-BAR+proteins+promotes+autophagy+and+vacuole+membrane+fusion.">Lipid trafficking by yeast Snx4 family SNX-BAR proteins promotes autophagy and vacuole membrane fusion.</a> Molecular Biology of the Cell. , (2018).</li><li>van Weering, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+for+SNX-BAR-mediated+assembly+of+distinct+endosomal+sorting+tubules.">Molecular basis for SNX-BAR-mediated assembly of distinct endosomal sorting tubules.</a> The EMBO Journal. 31 (23), 4466-4480 (2012).</li><li>Chi, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fission+of+SNX-BAR-coated+endosomal+retrograde+transport+carriers+is+promoted+by+the+dynamin-related+protein+Vps1.">Fission of SNX-BAR-coated endosomal retrograde transport carriers is promoted by the dynamin-related protein Vps1.</a> The Journal of Cell Biology. 204 (5), 793-806 (2014).</li><li>Purushothaman, L. K., Arlt, H., Kuhlee, A., Raunser, S., Ungermann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retromer-driven+membrane+tubulation+separates+endosomal+recycling+from+Rab7/Ypt7-dependent+fusion.">Retromer-driven membrane tubulation separates endosomal recycling from Rab7/Ypt7-dependent fusion.</a> Molecular Biology of the Cell. 28 (6), 783-791 (2017).</li><li>Purushothaman, L. K., Ungermann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cargo+induces+retromer-mediated+membrane+remodeling+on+membranes.">Cargo induces retromer-mediated membrane remodeling on membranes.</a> Molecular Biology of the Cell. 29 (22), 2709-2719 (2018).</li><li>Wurmser, A. E., Emr, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphoinositide+signaling+and+turnover:+PtdIns(3)P,+a+regulator+of+membrane+traffic,+is+transported+to+the+vacuole+and+degraded+by+a+process+that+requires+lumenal+vacuolar+hydrolase+activities.">Phosphoinositide signaling and turnover: PtdIns(3)P, a regulator of membrane traffic, is transported to the vacuole and degraded by a process that requires lumenal vacuolar hydrolase activities.</a> The EMBO journal. 17 (17), 4930-4942 (1998).</li><li>Puig, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tandem+affinity+purification+(TAP)+method:+a+general+procedure+of+protein+complex+purification.">The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification.</a> Methods. 24 (3), 218-229 (2001).</li><li>Kushnirov, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+reliable+protein+extraction+from+yeast.">Rapid and reliable protein extraction from yeast.</a> Yeast. 16 (9), 857-860 (2000).</li><li>Longtine, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Additional+modules+for+versatile+and+economical+PCR-based+gene+deletion+and+modification+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Additional modules for versatile and economical PCR-based gene deletion and modification in Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 14 (10), 953-961 (1998).</li><li>Tropea, J. E., Cherry, S., Waugh, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+purification+of+soluble+His(6)-tagged+TEV+protease.">Expression and purification of soluble His(6)-tagged TEV protease.</a> Methods in Molecular Biology. 498, 297-307 (2009).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphology+and+structure+of+lipoproteins+revealed+by+an+optimized+negative-staining+protocol+of+electron+microscopy.">Morphology and structure of lipoproteins revealed by an optimized negative-staining protocol of electron microscopy.</a> Journal of Lipid Research. 52 (1), 175-184 (2011).</li><li>Yong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+purification+of+the+SNX1/SNX6+complex.">Expression and purification of the SNX1/SNX6 complex.</a> Protein Expression and Purification. 151, 93-98 (2018).</li></ol>

ここでは、酵母のSNX-BARダイマーを精製するための最適化されたワークフローと、合成リポソーム上の生物物理特性を評価する2つのアッセイを示します。大腸菌または他のシステムにおける典型的な組換えタンパク質発現に対する主な利点は、天然の宿主でSNX-BARタンパク質を均等に発現する能力であり、したがって、他のシステムにおけるSNX-BARの精製に見られる毒性および不溶性の問...

形質膜などの膜結合オルガネラは、小胞体、ゴルジ装置、リソソーム(酵母空胞)、およびエンドソームが真核細胞の内膜系を含む。ほとんどのオルガネラは、小胞輸送キャリアを介して他のオルガネラと通信し、物質を交換する能力を有する。細胞が内膜系内の小胞輸送キャリアの包装および形成をどのように調整するかをよく理解されていない。しかし、内膜系の多くを構成するタンパク質および脂質は、形質膜(PM)からの内視鏡小胞の内在化に由来することが知られている。内因性は、これらの小胞の一次アクセプターオルガネラであり、管状オルガネラの複数の相互接続されたセットで構成されています。内因性者の主な機能は、栄養獲得を促進し、タンパク質および脂質のターンオーバーを調節し、病原体感染から保護し、形質膜の脂質の主要な補充源として機能することである。内因性は、血漿膜から大量の貨物タンパク質および脂質を受け取るにつれて、貨物を管状内染色輸送キャリア(ETC)に分離することによって仕分けコンパートメントとして機能する。ETCに隔離されていないタンパク質は、エンドリソソーム系を介して分解されます。EDCに選別する貨物の調節不良は、栄養素の取り込み、タンパク質のターンオーバーまたは脂質恒常性の喪失につながり、多数の代謝、発達、および神経学的障害をもたらす1、2。しかしながら、内因性におけるEPCの中心的な役割にもかかわらず、内因性者が多数の異種貨物の包装を管状キャリアに選択的に調整する方法の根本的なメカニズムは知られていない。
選別ネキシン(SNX)ファミリーは、細胞3、4、5における多くの小胞輸送反応に重要であることが判明した進化的に保存されたタンパク質クラスである。選別ネキシンはエンドソーム膜にリクルートされ、その特徴的なフォックス相同性(PX)ドメインを介して貨物捕獲を助け、エンドソーム膜に富んだ脂質であるホスファチジルイノシトール-3-一リン酸(PtdIns(3)P)と結合する。哺乳動物は33個のSNXタンパク質をコードし、他のドメイン1の存在に応じて、さらに複数のサブファミリーに分けることができる。最も顕著なのは、SNX-BARサブファミリーはヒトで12個からなる最大のサブファミリーであり、出芽酵母ではサッカロミセス・セレビシエで、サブファミリーはわずか7 SNX-BARRに減少する。SNX-BARタンパク質は、PXドメインと、脂質貯留層を引き起して陽性曲率膜を結合するビンアンフィフィシン-RvS(BAR)ドメインの両方を有する。その結果、SNX-BARファミリーはエンドソームに対して自然な親和性を有し、膜改造能力を介してETC形成を仲介することができる。インビトロでは、SNX-BARのリモデリング特性は、合成リポソームに精製されたSNX-BARを添加し、その後の狭い、被覆管を電子顕微鏡で可視化することによって誘導することができる。これらの方法を用いて、研究者は、オリゴマー化濃度と収縮強度の両方がSNX-BARファミリーの間で異なっているように見えることを決定し、ETCの形成とサイションの両方に役立つ可能性を示唆している。
SNX-BARは、その排他的二量体化特性によってさらに分類することができる。インビトロ結合アッセイと構造研究は、SNX-BARタンパク質が特異的ホモジマーまたはヘテロダイマーのみを形成できることを実証しています。したがって、原理的には、各潜在的なSNX-BARダイマーオリゴマーは、貨物特異的な入稿経路に対してチューブルコートを提供することができ、同様に、他のSNX-BARプロトマーの制限されたオリゴマー化は、異なる輸出経路を定義することもできる。しかし、SNX-BARの数が多く、SNXファミリー内の多様性が多いため、ネキシンワン貨物仮説を選別する可能性は非常に低いです。代わりに、SNX-BAR、貨物、脂質特異性、その他の依存関係など、さまざまな要因を使用して協調的な作業を行う可能性が高くなります。同様に、酵母SNX4ファミリーの最近の研究は、PtdIns(3)Pを超えて、追加の脂質特異性の証拠を明らかにし、内染色体輸送キャリア6を増強する。本研究では、SNX-BARホモダイマーMvp1-Mvp1を細菌および天然ヘテロダイマーSnx4-Atg20およびVps5-Vps17から精製し、酵母からの高収率で発現および精製したが、Snx4-Atg20のみがホスファチジルセリン(PS)と結合する構造を優先的に結合し、唇の結合研究で狭いチューブ様構造を形成することが分かった。この分野の他の分野では、細菌由来の組換え精製SNX-BARホモダイマーを用いたSNX-BARの重要な特性を明らかにしているが、類似系でSNX-BARヘテロダイマーを発現させることに伴う毒性は、本来の特徴付けを妨げている7、8、9、10である。したがって、純粋な組換え発現天然ヘテロダイマーを得るための信頼性の高いシステムがなければ、研究者はこれらの調査ラインを見送らなければなりません。図1では、1)タンデム親和性精製のためのSNX-BARヘテロダイマーを過剰発現する酵母株を構築する4部構成のワークフローを提示し、 2)発現および精製天然SNX-BARヘテロダイマー、3)ユニラメラ合成リポソームを調製し、4)リポソームチューブまたは沈沈沈下アッセイを設定し、研究者が自然界で見つかったソートネキシンの成長カタログを調査するための重要なツールを提供する。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 micrometer PC Membranes</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>610006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Poly-Prep Chromatography column (Bio-Rad)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>731-1550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27 Gauge needle</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>301629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra Centrifugal Filter with 10K cutoff</td>
			<td>Amicon</td>
			<td>UFC501024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avestin EmulsiFlex-C3 Homogenizer</td>
			<td>Avestin</td>
			<td>EF-C3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA assay</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman Optima MAX-XP Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>393315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4693116001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOPC</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>850375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOPS</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>840035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ergosterol (Sigma)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>47130-U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extruder Set with Block 0.2 microlter/1mL</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>610000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">FEI Tecnai F20 transmission electron microscope (200 kV)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass culture tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>47729-570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG sepharose beads (GE Healthcare)</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0969-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microlter glass syringes</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>7637-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New Brunswick Excella E25</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>M1353-0000</td>
			<td>or equivalent shaking 30 C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA Magnetic Agarose Beads</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>78605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima XE-90 Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A94516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M</td>
			<td>VWR</td>
			<td>52858-076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PI3P</td>
			<td>Echelon</td>
			<td>P-3016</td>
			<td>or Echelon equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate bottle assembly</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>355622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLA-100 Fixed-Angle Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>343840</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type 45 Ti Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Desiccator, Bottom and Lid with Socket Valve</td>
			<td>VWR</td>
			<td>75871-436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Pump Alcatel (Pascal 2005 C1)</td>
			<td>A&#38;J Vacuum</td>
			<td>PN07050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex with foam holder</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10153-838</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR KIT MICROTUBE</td>
			<td>VWR</td>
			<td>12620-880</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

expression, purification, and liposome binding of budding yeast snx-bar heterodimers

SNX-BARタンパク質は、エンドサイトーシス中のタンパク質と脂質の選別と密売、エンドソーム系内での選別、オートファジーの選別に重要な役割を果たす、進化的に保存された膜改造タンパク質クラスです。SNX-BARタンパク質機能の中心は、高度に保存されたフォックス相同性(PX)およびBAR(ビン/アンフィフィシン/Rvs)ドメインを使用して膜を結合するホモダイマーまたはヘテロダイマーを形成する能力です。さらに、膜上のSNX-BARダイマーのオリゴマー化は膜管および小胞の形成を引き起こすことができ、この活性はエンドソーム由来輸送キャリアのコートタンパク質としての機能を反映すると考えられている。研究者は長い間、合成リポソームまたは巨大ユニラメラ小胞(GUV)上の組換えSNX-BARタンパク質を用いたインビトロ結合研究を利用して、膜リモデリングを駆動するために必要な脂質の正確な構成を明らかにし、その作用機序を明らかにしてきました。しかし、二重発現系の技術的な課題、細菌におけるSNX-BARタンパク質発現の毒性、および個々のSNX-BARタンパク質の溶解性の低下により、これまでのほとんどの研究では、細菌の発現中に形成される非生理学的二量体を含むSNX-BARホモダイマーを調べてきた。最近では、典型的な細菌発現系の大きな欠点を克服するためのプロトコルを最適化しました。このワークフローを用いて、大量のSNX-BARヘテロダイマーを正常に発現および精製する方法と、結合および管結アッセイのための合成リポソーム上でそれらを再構成する方法を示します。

このプロトコルは、下流膜改造アッセイに使用できる内因性酵母SNX-BAR複合体の再現性と堅牢な製造方法を記述する(図1)。精製に用いた酵母株の構築は、出芽酵母における相同組換えの効率を利用し、標的SNX-BARのゲノムロチでの改変を可能にする(図2)。この設計には2つの利点があり、(i)選択が修飾を維持する必要がないよ?...

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Expression, Purification, and Liposome Binding of Budding Yeast SNX-BAR Heterodimers

ここでは、酵母におけるSNX-BARヘテロダイマーの発現、精製及びリポソーム結合のワークフローを提示する。

出芽酵母SNX-BARヘテロダイマーの発現、精製、リポソーム結合

SNX-BAR proteins are an evolutionarily conserved class of membrane remodeling proteins that play key roles in sorting and trafficking of protein and ...

SNX-BAは、ヒト疾患において重要な役割を果たす膜改質タンパク質です。我々の方法を用いて、脂質結合および膜リモデリングを促進するために、その正確な生物物理学的性質を決定することができる。酵母細胞からSNB-BARタンパク質を精製することで、ネイティブホモおよびヘテロSNX-BARダイマーを取得し、非ネイティブ発現系で頻繁に遭遇する毒性と不溶性を最小限に抑えることができます。我々の方法は、すべての酵母SNX-BARの脂質特異性を理解したり、他の生物から組み換えSNX-BARタンパク質を産生するために使用することができる。押出プロセス中のリポソーム損失を防ぐためには、正しい押出機アセンブリが不可欠です。初めに学生や現場に初めて参加する学生にとって、最も重要なステップを視覚的に観察することで、成功の可能性が大幅に向上します。まず、炭素源として2%ラフィノースと0.1%グルコースを添加した50ミリリットルの標準的なYP培地を含む培養物の少なくとも4倍の量のフラスコに酵母細胞の大きな綿棒を接種し、30°Cシェーカーで一晩培養を成長させます。翌朝、2%ラフィノースと0.1%グルコースを2.8リットルの容量で2.8リットルバッフルフェルバックフェルンバッハフラスコで1リットルの標準YP培地で50ミリリットルの前培養を発振インキュベーターで4〜5時間培養する。600ナノメートルでの光学濃度が0.2に達すると、揺れインキュベーターで一晩培養するために、細胞に2%の最終濃度にガラクトースを加えます。翌朝、遠心分離によって細胞を収穫し、酵母ペレットを50ミリリットルの円錐形チューブに移す。ペレットを精製バッファーの 15 ミリリットルに再懸濁して約 30 ミリリットルの最終容積を達成し、セル懸濁液を摂氏 4 度に冷却したホモジナイザーにロードします。サンプルを2〜3ラウンドで1平方インチあたり20〜25,000ポンドでライセし、氷の上の新しい50ミリリットル円錐形チューブにライセートを移します。すぐに遠心分離によって細胞のライセートをクリアし、慎重に新しいチューブに上清を移します。次に、精製バッファーに3つの再懸濁液を有するIgGセファロースビーズの300マイクロリットルを平衡化してから、ビーズをクリアした細胞のライセートに加え、摂氏4度で回転して2時間のインキュベートを行います。インキュベーションの最後に、ビーズを10ミリリットルのクロマトグラフィーカラムに加え、非結合溶解物が流れるようにします。ビーズを洗浄ごとに1ミリリットルの洗浄バッファーで10回洗浄し、各洗浄液が完全に流れ込んでから次のボリュームを追加します。最後の洗浄後、ピペットと新鮮なバッファーを使用して、マイクロ遠心チューブにビーズを移します。新鮮な洗浄バッファーでビーズの総量を500マイクロリットルにし、4°Cで回転して一晩インキュベーションのために1ミリリットルTEVプロテアーゼあたり10ミリグラムの2マイクロリットルでリゼートからビーズを取り除きます。翌朝、27ゲージの針を使用して上清を完全に除去し、タンパク質の純度を10%ポリアクリルアミドSDSページで評価します。次に、標準プロトコルに従ってブラッドフォードタンパク質アッセイを使用して濃縮タンパク質を定量化し、摂氏4度で最大1週間タンパク質を保存します。リポソームを調製するために、ガラス注射器を使用して、ストック脂質をクリーンガラス培養チューブに移し、1%ホスファチジルイノシトール-3-リン酸、20%エルゴステロール、30%ホスファチジルセリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルコリンを表に概説した最終脂質混合物を達成する。各脂質が再懸濁される溶媒に応じて、混合物は各脂質の添加時に白濁し得る。低流量の窒素ガスを円運動で導き、ガラス管の底部で脂質を均一に処理することで、脂質混合物を慎重に乾燥させます。次に、開口部を覆い出したホイルでガラス培養チューブを包み、さらに1時間真空中で脂質を脱水します。インキュベーションの終わりに、各バイアルに400マイクロリットルの結合バッファーを加えて、最終的なリポソーム濃度2.5ミリモルで脂質を完全に水分補給してから、室温で渦中速度で脂質を30分間再懸濁します。脂質が再懸濁されると、バッファーが濁るはずです。再懸濁リポソームをマイクロ遠心分離チューブに移し、液体窒素でチューブを凍結し、続いて37°Cの水浴で解凍を7〜8回行います。化学フュームフードでは、1回のクロロホルムを1回3回フルボリュームで2本洗浄し、残留脂質を除去し、2体積の超純水と2体積の結合緩衝液で各シリンジを平衡化します。メーカーの推奨に従ってミニ押出機を組み立てます。次に、結合バッファーに 1 つの 200 ナノメートル膜に 2 つのフィルターサポートを水没します。完全に気密になるようにミニ押出機を組み立てることが重要です。そして、リークをチェックする良い方法は、デバイスを介してバッファを渡すです。フィルターサポート間の膜を挟み、ミニ押出機に膜を配置します。平衡化された1ミリリットルシリンジの1つを使用して、ミニ押出機を通してリポソーム混合物の体積に類似した結合バッファーのボリュームを渡し、他のシリンジを使用してマイクロ遠心分離チューブを反転させ、リポソームチューブの最後を収集してそのコレクションのチューブキャップに取り込みます。その後、200ナノメートル膜を通してリポソームを19〜21回押し出し、押し出されたリポソームを新しいマイクロ遠心チューブに集める。SNX-BARのリポソーム結合および細管アッセイを行う前に、精製したタンパク質を超遠心分離によって予めクリアし、ペレットを邪魔することなく上清を新しいマイクロ遠心管に移します。次に、精製されたSNX4-ATG20の4マイクロモルと2.5ミリモルのリポソームを合計20マイクロリットルの30分の摂氏でインキュベートします。リポソーム細管を視覚化して定量化するには、インキュベーションの終わりに、炭素被覆銅メッシュグリッドと1%の酢酸ウラニルとの負の汚れにサンプルをすぐに見つけます。その後、200キロボルトで透過型電子顕微鏡でサンプルを分析します。リポソーム結合および沈下のために、ポリカーボネート遠心管に反応の20マイクロリットルを移し、超遠心分離機で互換性のあるルータでサンプルを回す。遠心分離の終わりに、上清を新しいマイクロ遠心分離管に慎重に移し、SDSページサンプルバッファーの40マイクロリットルでペレットを再懸濁します。ペレット懸濁液を新しいマイクロ遠心分離チューブに移し、20マイクロリットルのサンプルバッファーを上清に加えます。その後、10%ポリアクリルアミドSDSページゲルに同等のサンプル量のペレットと上清をロードし、リポソームに結合したSNX-BARsを可視化するためにクーマシー染色を行います。SNX-BAR発現の適切な誘導を確認するために、タンデムアフィニティー精製タグに対するウェスタンブロットは、クーマシー染色を介してSNX-BARのタンパク質レベルを検出できない可能性があるため使用できます。SNX-BARヘテロダイマーの精製後、2つのSNX-BARのバンドは1対1の量論比で現れ、汚染バンドはほとんどまたは全く存在しないはずです。この代表的な分析では、SNX-BARヘテロダイマーを発現させ、精製し、実証したように合成リポソームに結合した。なお、MVP1はホモダイマーを形成し、期待通り細菌で発現した。SNX-BARは、様々なリポソーム組成物に結合し、例えばリポソーム結合に対するホスファチジルセリンの影響を評価するために、デンジソメトリーによって定量化することができる。電子顕微鏡イメージングは、通常14〜26ナノメートルの間の直径を有するほとんどの管管を有するSNX4-ATG20リポソーム細管の測定を可能にする。精製されたSNX-BAはリポソームの貨物捕獲複合体で再構成され、完全なアセンブリが膜のリモデリングに与える影響を理解することができることに注意してください。精製されたSNX-BARダイマーの異なる組み合わせと異なる脂質で構成される合成リポソームとの結合を比較した場合、SNX-BARタンパク質は、明確な脂質結合性の好みを有することが判明した。クロロホルムを扱う際は常にフードで作業し、シャープやガラス材料を扱う際には適切なPPEを着用してください。

Research

JoVE Journal

Genetics

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ターゲットを絞りました<em&gt;その場で</em出芽酵母におけるヒストン遺伝子の&gt;突然変異誘発

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Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere

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Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization (smFISH) Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

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単一分子蛍光In-situハイブリダイゼーション (smFISH) における出芽酵母の栄養増殖と減数分裂

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Informatic Analysis of Sequence Data from Batch Yeast 2-Hybrid Screens

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Mating-based Overexpression Library Screening in Yeast

酵母の過剰発現の交尾ベース ライブラリ スクリーニング

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A Deep-sequencing-assisted, Spontaneous Suppressor Screen in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe

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分裂酵母分裂酵母のディープ シーケンス アシスト、自発的な抑制画面

A genetic screen for mutant alleles that suppress phenotypic defects caused by a mutation is a powerful approach to identify genes that belong to closely ...

Enhanced Yeast One-hybrid Screens To Identify Transcription Factor Binding To Human DNA Sequences

人間の DNA 配列に結合する転写因子を識別するために強化されたイースト 1 ハイブリッド スクリーン

Identifying the sets of transcription factors (TFs) that regulate each human gene is a daunting task that requires integrating numerous experimental and ...