Name: expression, purification, and liposome binding of budding yeast snx-bar heterodimers
Uploaded: 2019-12-06T12:00:00
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이 간행물에 보고 된 연구는 수상 번호 GM060221에서 건강의 국립 연구소의 국립 연구소에 의해 지원 되었다 그리고 부분적으로 국립 연구소의 일반 의학의 국립 연구소에 의해 수상 번호 T32GM007223에서 건강의. R.C.는 UNC-샬롯 교수 연구 보조금 프로그램에 의해 부분적으로 지원되었습니다.

1. 효모 변형 공사
<ol><li>TVY614(pep4Δ::LEU2 prb1Δ::hisG prc1Δ::HIS3)11로 시작하십시오. 이 균주는 세포 용해 후 단백질 분해의 대부분에 기여하는 백공 프로테아제에 대한 결핍, 따라서 깨끗하고 보다 효율적인 정제를 허용.</li>
	<li>디자인프라이머(12)는 동형 재조합을 사용하여 Atg20(SNX-BAR ORF 1)의 C-종점(T-terminus)에서 탠덤 친화도 정제(TAP) 태그를 통...

<ol>
	<li>Teasdale, R. D., Collins, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+the+PX+(phox-homology)+domain+and+SNX+(sorting+nexin)+protein+families:+structures,+functions+and+roles+in+disease.">Insights into the PX (phox-homology) domain and SNX (sorting nexin) protein families: structures, functions and roles in disease.</a> The Biochemical Journal. 441 (1), 39-59 (2012).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Retromer+Complex+and+Sorting+Nexins+in+Neurodegenerative+Diseases.">The Retromer Complex and Sorting Nexins in Neurodegenerative Diseases.</a> Frontiers in Aging Neuroscience. 10, 79 (2018).</li><li>Burd, C., Cullen, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retromer:+a+master+conductor+of+endosome+sorting.">Retromer: a master conductor of endosome sorting.</a> Cold Spring Harbor perspectives in Biology. 6 (2), (2014).</li><li>Chi, R. J., Harrison, M. S., Burd, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogenesis+of+endosome-derived+transport+carriers.">Biogenesis of endosome-derived transport carriers.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 72 (18), 3441-3455 (2015).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endosomal+receptor+trafficking:+Retromer+and+beyond.">Endosomal receptor trafficking: Retromer and beyond.</a> Traffic (Copenhagen, Denmark). 19 (8), 578-590 (2018).</li><li>Ma, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+trafficking+by+yeast+Snx4+family+SNX-BAR+proteins+promotes+autophagy+and+vacuole+membrane+fusion.">Lipid trafficking by yeast Snx4 family SNX-BAR proteins promotes autophagy and vacuole membrane fusion.</a> Molecular Biology of the Cell. , (2018).</li><li>van Weering, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+for+SNX-BAR-mediated+assembly+of+distinct+endosomal+sorting+tubules.">Molecular basis for SNX-BAR-mediated assembly of distinct endosomal sorting tubules.</a> The EMBO Journal. 31 (23), 4466-4480 (2012).</li><li>Chi, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fission+of+SNX-BAR-coated+endosomal+retrograde+transport+carriers+is+promoted+by+the+dynamin-related+protein+Vps1.">Fission of SNX-BAR-coated endosomal retrograde transport carriers is promoted by the dynamin-related protein Vps1.</a> The Journal of Cell Biology. 204 (5), 793-806 (2014).</li><li>Purushothaman, L. K., Arlt, H., Kuhlee, A., Raunser, S., Ungermann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retromer-driven+membrane+tubulation+separates+endosomal+recycling+from+Rab7/Ypt7-dependent+fusion.">Retromer-driven membrane tubulation separates endosomal recycling from Rab7/Ypt7-dependent fusion.</a> Molecular Biology of the Cell. 28 (6), 783-791 (2017).</li><li>Purushothaman, L. K., Ungermann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cargo+induces+retromer-mediated+membrane+remodeling+on+membranes.">Cargo induces retromer-mediated membrane remodeling on membranes.</a> Molecular Biology of the Cell. 29 (22), 2709-2719 (2018).</li><li>Wurmser, A. E., Emr, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphoinositide+signaling+and+turnover:+PtdIns(3)P,+a+regulator+of+membrane+traffic,+is+transported+to+the+vacuole+and+degraded+by+a+process+that+requires+lumenal+vacuolar+hydrolase+activities.">Phosphoinositide signaling and turnover: PtdIns(3)P, a regulator of membrane traffic, is transported to the vacuole and degraded by a process that requires lumenal vacuolar hydrolase activities.</a> The EMBO journal. 17 (17), 4930-4942 (1998).</li><li>Puig, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tandem+affinity+purification+(TAP)+method:+a+general+procedure+of+protein+complex+purification.">The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification.</a> Methods. 24 (3), 218-229 (2001).</li><li>Kushnirov, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+reliable+protein+extraction+from+yeast.">Rapid and reliable protein extraction from yeast.</a> Yeast. 16 (9), 857-860 (2000).</li><li>Longtine, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Additional+modules+for+versatile+and+economical+PCR-based+gene+deletion+and+modification+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Additional modules for versatile and economical PCR-based gene deletion and modification in Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 14 (10), 953-961 (1998).</li><li>Tropea, J. E., Cherry, S., Waugh, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+purification+of+soluble+His(6)-tagged+TEV+protease.">Expression and purification of soluble His(6)-tagged TEV protease.</a> Methods in Molecular Biology. 498, 297-307 (2009).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphology+and+structure+of+lipoproteins+revealed+by+an+optimized+negative-staining+protocol+of+electron+microscopy.">Morphology and structure of lipoproteins revealed by an optimized negative-staining protocol of electron microscopy.</a> Journal of Lipid Research. 52 (1), 175-184 (2011).</li><li>Yong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+purification+of+the+SNX1/SNX6+complex.">Expression and purification of the SNX1/SNX6 complex.</a> Protein Expression and Purification. 151, 93-98 (2018).</li></ol>

여기에서는 효모와 2개의 분석에 SNX-BAR 이분무를 정화하여 합성 리포좀에 대한 생물물리학적 특성을 평가하기 위한 최적화된 워크플로우를 시연합니다. 대장균 또는 다른 시스템에서 일반적인 재조합 단백질 발현에 비해 주요 장점은 기본 숙주에서 SNX-BAR 단백질을 고르게 발현할 수 있는 능력으로, 다른 시스템에서 SNX-BARs를 정화할 때 발견되는 독성 및 불용성 문제를 피할 수 있다는 것입?...

혈장막, 소포체, 골지 장치, 리소좀(yeast vacuole) 및 내막과 같은 막-결합 소기관은 진핵 세포의 내막 시스템을 포함한다. 대부분의 세포기관은 소포 수송 캐리어를 통해 다른 세포기관과 통신하고 교환할 수 있습니다. 세포가 내막 시스템 내의 소포 수송 운반체의 포장 그리고 대형을 조정하는 방법은 잘 이해되지 않습니다. 그러나, 내막 시스템의 대부분을 구성하는 단백질 및 지질은 혈장 막 (PM)에서 내분비 소포에서 유래하는 것으로 알려져 있다. endosome는 이 소포를 위한 1 차적인 수용자 소기관이고 관 성 소기관의 다중 상호 연결된 세트로 이루어져 있습니다. endosome의 주요 기능은 영양 수집을 촉진 하는, 단백질 및 지질 회전율을 조절, 병원 체 감염으로부터 보호, 플라즈마 막에 대 한 지질의 기본 보충 소스 역할을. endosome는 혈장 막에서 화물 단백질 및 지질의 대량수신으로, 관 내인체 수송 캐리어 (ETCs)로 화물을 격리해서 분류 구획으로 작동합니다. ETC로 격리되지 않은 모든 단백질은 내분비계통 시스템을 통해 분해되도록 남아 있습니다. ETC로 분류하는 화물의 역조절은 영양소 섭취, 단백질 회전율 또는 지질 항상성의 손실로 이어질 수 있으며, 이로 인해 수많은 대사, 발달 및 신경 장애1,2. 그러나, 내인성에서 ETC의 중심 역할에도 불구하고, 내인성이 관상 운반체로 이질적인 화물의 다수의 포장을 선택적으로 조정할 수 있는 방법의 근본적인 기계장치는 알려져 있지 않다.
선별된 넥신(SNX) 패밀리는 세포3,4,5에서많은 소포 수송 반응에 중요한 것으로 밝혀진 진화적으로 보존된 단백질 등급이다. 선별 넥신은 내막에 모집되고 인내막에 농축된 지질인 인산염리노시톨-3-모노포스페이트(PtdIns(3)P)를 결합하는 특징적인 인록 상동성(PX) 도메인을 통해 화물 포획을 돕습니다. 포유동물은 다른 도메인1의존재에 따라 다중 하위 패밀리로 더 분할될 수 있는 33개의 SNX 단백질을 인코딩한다. 가장 주목할 만한, SNX-BAR 하위 가족은 인간에서 열두 로 구성된 가장 큰 하위 가족이며, 신생 효모, 사카로미세세스 세레비시아에있는 동안, 하위 패밀리는 단지 7개의 SNX-BARs로 감소된다. SNX-BAR 단백질은 PX 도메인과 양성 곡률 막을 결합하는 지질 저장소를 유발하는 빈-암피히신-Rvs(BAR) 도메인을 모두 가지고 있습니다. 따라서 SNX-BAR 제품군은 내인성에 대한 자연스러운 친화력을 가지며 멤브레인 리모델링 능력을 통해 ETC 형성을 중재할 수 있습니다. 시험관내에서 SNX-BARs의 리모델링 특성은 합성 리포좀에 정제된 SNX-BARs를 첨가하여 유도될 수 있으며, 이에 따른 좁고 코팅된 튜블의 형성은 전자 현미경으로 가시화될 수 있다. 이러한 방법을 사용하여, 연구원은 올리고머화 농도와 수축 강도 모두 그들이 ETC의 형성과 가위 모두에 도움이 될 수 제안 SNX-BAR 가족 사이에 변화하는 것으로 나타났습니다 결정했다.
SNX-BAR은 독점적인 이화 특성에 의해 추가로 분류될 수 있습니다. 시험관 내 결합 검사 및 구조 연구는 SNX-BAR 단백질이 특정 호모디머 또는 이종만 형성할 수 있음을 입증했습니다. 따라서, 원칙적으로, 각 잠재적SNX-BAR 디머-올리고머는 화물 별 인신매매 경로에 대한 튜번 코트를 제공할 수 있으며, 마찬가지로 다른 SNX-BAR 프로토머의 제한된 올리고머화는 또한 뚜렷한 수출 경로를 정의할 수 있다. 그러나 SNX 제품군 내에서 많은 수의 SNX-BARs와 다양성으로 인해 하나의 선별 된 넥신 원 화물 가설은 매우 드물다. 대신 SNX-BARs, 화물, 지질 특이성 및 기타 종속성과 같은 다양한 요인을 사용하여 조정된 노력이 더 가능성이 높습니다. 마찬가지로, 효모 SNX4 가족의 최근 연구는 PtdIns (3)P를 넘어 추가 지질 특이성에 대한 증거를 밝혀, 내분비 수송캐리어를potentiate 6. 본 연구에서, SNX-BAR 호모디머 Mvp1-Mvp1은 박테리아와 토종 이종자 Snx4-Atg20 및 Vps5-Vps17에서 정제되었으며, 효모에서 높은 수율로 정제되었으며, Snx4-Atg20만이 포스파티딜세린(PS) 및 좁은 결합 체형(PS) 및 좁은 결합 구조에서 포스파티딜세린(PS) 및 좁은 결합 체형(PS)을 우선적으로 결합하는 것으로나타났습니다. 현장에서 다른 사람들이 박테리아로부터 재조합 정제된 SNX-BAR 호모디머를 사용하여 SNX-BAR의 중요한 특성을 밝혀냈지만, 유사한 시스템에서 SNX-BAR 헤테로디머를 발현하는 것과 관련된 독성은 그들의 본래 특성화를 저해한7,8,9,10. 따라서 순수한 재조합으로 표현된 네이티브 헤테로디머를 얻기 위한 신뢰할 수 있는 시스템이 없다면, 연구자들은 이러한 조사 라인을 포기해야 한다. 도 1에서는,우리는 탠덤 친화도 정제를 위해 SNX-BAR 헤테로디머를 과발현하는 효모 균주를 구성하기 위해 4부트 워크플로우를 제시하고, 2) 네이티브 SNX-BAR 헤테로디머를 표현하고 정화하고, 3) 단층 합성 리포솜을 준비하고, 4) 리포솜 관 또는 침전검을 설정하여 연구원들이 자연에서 발견되는 넥신을 선별하는 카탈로그를 조사하는 데 중요한 도구를 제공한다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 micrometer PC Membranes</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>610006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Poly-Prep Chromatography column (Bio-Rad)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>731-1550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27 Gauge needle</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>301629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra Centrifugal Filter with 10K cutoff</td>
			<td>Amicon</td>
			<td>UFC501024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avestin EmulsiFlex-C3 Homogenizer</td>
			<td>Avestin</td>
			<td>EF-C3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA assay</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman Optima MAX-XP Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>393315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4693116001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOPC</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>850375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOPS</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>840035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ergosterol (Sigma)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>47130-U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extruder Set with Block 0.2 microlter/1mL</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>610000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">FEI Tecnai F20 transmission electron microscope (200 kV)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass culture tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>47729-570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG sepharose beads (GE Healthcare)</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0969-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microlter glass syringes</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>7637-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New Brunswick Excella E25</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>M1353-0000</td>
			<td>or equivalent shaking 30 C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA Magnetic Agarose Beads</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>78605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima XE-90 Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A94516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M</td>
			<td>VWR</td>
			<td>52858-076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PI3P</td>
			<td>Echelon</td>
			<td>P-3016</td>
			<td>or Echelon equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate bottle assembly</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>355622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLA-100 Fixed-Angle Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>343840</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type 45 Ti Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Desiccator, Bottom and Lid with Socket Valve</td>
			<td>VWR</td>
			<td>75871-436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Pump Alcatel (Pascal 2005 C1)</td>
			<td>A&#38;J Vacuum</td>
			<td>PN07050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex with foam holder</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10153-838</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR KIT MICROTUBE</td>
			<td>VWR</td>
			<td>12620-880</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

expression, purification, and liposome binding of budding yeast snx-bar heterodimers

SNX-BAR 단백질은 내분비증 중 단백질과 지질의 분류 및 인신 매매, 내인성 시스템 내에서 선별 및 자가 포식에 중요한 역할을하는 세포 리모델링 단백질의 진화적으로 보존 된 클래스입니다. SNX-BAR 단백질 기능의 핵심은 고도로 보존된 포크스 상동성(PX) 및 BAR(빈/암피히신/Rvs) 도메인을 사용하여 멤브레인을 결합하는 호모디머 또는 이종자를 형성하는 능력입니다. 또한, 막에 SNX-BAR 이체의 올리고머는 막 tubules 및 소포의 형성을 유도할 수 있고 이 활동은 endosome 파생된 수송 운반체를 위한 외투 단백질로 그들의 기능을 반영하는 것으로 생각됩니다. 연구원은 합성 리포좀 또는 거 대 한 unilamellar 소포에 재조합 SNX-BAR 단백질을 사용 하 여 생체 외 바인딩 연구에서 오랫동안 활용 (GUVs) 막 리모델링을 구동 하는 데 필요한 지질의 정확한 메이크업을 공개, 따라서 행동의 그들의 메커니즘을 공개. 그러나, 이중 발현 시스템과 기술적 인 도전으로 인해, 박테리아에서 SNX-BAR 단백질 발현의 독성, 개별 SNX-BAR 단백질의 가난한 용해도, 현재까지 대부분의 연구는 박테리아에서 발현 중에 형성 비 생리 적 이형제를 포함하여 SNX-BAR 호모디머를 검사했다. 최근에는 일반적인 세균 발현 시스템의 주요 단점을 극복하기 위해 프로토콜을 최적화했습니다. 이 워크플로우를 사용하여 다량의 SNX-BAR 헤테로디머를 성공적으로 표현하고 정화하는 방법과 결합 및 튜브 배관 법을 위해 합성 리포좀에서 재구성하는 방법을 보여줍니다.

이 프로토콜은 다운스트림 멤브레인 리모델링 분석에 사용될 수 있는 내인성 효모 SNX-BAR 복합체의 재현 가능하고 견고한 생산을 위한 방법을설명한다(도 1). 정제에 사용되는 효모 균주의 구성은 신생 효모에서 상동 재조합의 효율을 활용하여 표적 SNX-BARs의 게놈 성소에서 변형을 허용합니다(그림 2). 이러한 설계는 두 가지 장?...

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Expression, Purification, and Liposome Binding of Budding Yeast SNX-BAR Heterodimers

여기서, 우리는 효모에서 SNX-BAR 헤테로디머의 발현, 정제 및 리포좀 결합에 대한 워크플로우를 제시한다.

신진 효모 SNX-BAR 헤테로디머의 발현, 정화 및 리포솜 결합

SNX-BAR proteins are an evolutionarily conserved class of membrane remodeling proteins that play key roles in sorting and trafficking of protein and ...

SNX-BaRs는 인간 질병에서 중요한 역할을 하는 막 리모델링 단백질입니다. 우리의 방법을 사용하여, 우리는 지질 결합 및 막 리모델링을 용이하게하기 위해 정확한 생물 학적 특성을 결정할 수 있습니다. 효모 세포로부터 SNB-BAR 단백질을 정화하면 네이티브 호모 및 이테로 SNX-BAR 디머를 획득하는 동시에 비네이티브 발현 시스템과 자주 발생하는 독성 및 불용성을 최소화할 수 있습니다.우리의 방법은 모든 효모 SNX-BAR의 지질 특이성을 이해하거나 다른 유기체에서 재조합 SNX-BAR 단백질을 생산하는 데 사용할 수 있습니다. 압출 공정 중 리포솜 손실을 방지하는 데 올바른 압출기 조립이 필수적입니다. 초등학생이나 현장에 새로 오신 학생의 경우 가장 중요한 단계를 시각적으로 관찰하면 성공 가능성이 크게 향상됩니다.먼저 큰 효모 세포를 플라스크로 접종하여 표준 YP 배지의 50 밀리리터를 함유한 배양물의 부피의 4배 이상을 탄소원으로 보충하고 30°C로 하룻밤 문화를 성장시키는 것으로 시작한다. 다음 날 아침, 50 밀리리터 프리 배양을 표준 YP 배지 1리터에 2%라피노스와 0.1%의 포도당을 2.8리터 부피로 접종하여 펀바흐 플라스크를 흔들어 서배양한 배양기에서 4~5시간 배양하였다. 600 나노미터의 광학 밀도가 0.2에 도달하면, 흔들리는 인큐베이터에서 하룻밤 배양을 위해 세포에 2%의 최종 농도에 갈라토스를 추가합니다.다음 아침, 원심 분리에 의해 세포를 수확하고 효모 펠릿을 50 밀리리터 원추형 튜브로 옮긴다. 정제 버퍼의 15 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단하고 약 30 밀리리터의 최종 부피를 달성하고 세포 현탁액을 섭씨 4도로 냉각된 균질화에 적재한다. 샘플을 20~25개, 평방 인치당 000파운드로 2~3라운드로 끌어들이고, 얼음 위에 50밀리리터 원피스 튜브로 라이세이트를 옮킨다.즉시 원심분리에 의해 세포 용양을 지우고 상체를 새로운 튜브로 조심스럽게 옮긴다. 다음으로, 4°C에서 회전하는 2시간 동안 구슬을 클리어셀 용액에 넣기 전에 정제 버퍼에 3개의 재서스펜션을 가진 IgG Sepharose 구슬 300마이크로리터를 평형화합니다. 인큐베이션의 끝에서 10 밀리리터 크로마토그래피 컬럼에 구슬을 추가하고 언바운드 라이세이터가 흐르도록 합니다.구슬을 세척당 1밀리리터의 세척 버퍼로 10회 세척하여 다음 볼륨을 추가하기 전에 각 세척이 완전히 흐르도록 합니다. 마지막 세척 후 파이펫과 신선한 버퍼를 사용하여 구슬을 미세 원심 분리기 튜브로 옮겨 넣습니다. 구슬의 총 부피를 신선한 세척 버퍼로 500 마이크로리터에 가져와 서술에서 구슬을 제거하고 밀리리터 TEV 프로테아제 당 10 밀리그램의 두 마이크로리터로 lysate에서 구슬을 제거하여 섭씨 4도에서 회전하여 하룻밤 동안 배양할 수 있습니다.다음 날 아침, 27 게이지 바늘을 사용하여 상체를 완전히 제거하고 단백질 순도를 10% 폴리아크릴아미드 SDS 페이지로 평가합니다. 그런 다음 표준 프로토콜에 따라 브래드포드 단백질 분석기를 사용하여 농축 된 단백질을 정량화하고 섭씨 4도에서 최대 1 주일 동안 단백질을 저장합니다. 리포솜을 준비하려면 유리 주사기를 사용하여 스톡 지질을 깨끗한 유리 배양 튜브로 옮기면 1%인산염-3-인산염, 20%에르고스테롤, 30%의 포스파디딜세린, 인산다이딜린의 최종 지질 혼합물을 얻을 수 있습니다.각 지질이 재장매되는 용매에 따라 각 지질을 첨가하면 혼합물이 흐리게 될 수 있다. 유리 튜브의 바닥에서 지질을 균일하게 취급하기 위해 원형 모션으로 혼합물에서 저유량 질소 가스를 지시하여 지질 혼합물을 조심스럽게 건조시다. 그런 다음 유리 배양 튜브를 호일로 감싸서 개구부를 발견하고 1 시간 동안 진공 상태에서 지질을 더 탈수합니다.인큐베이션이 끝나면 각 유리병에 400 마이크로리터의 결합 버퍼를 추가하여 2.5 밀리몰러의 최종 립약 농도에서 지질을 완전히 재수화한 후 실온에서 소용돌이의 중간 속도로 지질을 30 분 동안 재연합니다. 지질이 다시 중단되면 버퍼가 흐리게 됩니다. 재중단 된 리포솜을 미세 원심 분리기 튜브로 옮기고 액체 질소로 튜브를 얼리고 37도 의 수증기에서 7 ~ 8 번 해동합니다.화학 연기 후드에서, 어떤 잔류 지질을 제거하고 초순수 물과 바인딩 버퍼의 두 볼륨각 주사기를 평형각 주사기를 제거하기 위해 주사기 당 세 번 클로로 폼의 전체 볼륨과 두 밀리리터 유리 주사기를 청소. 제조업체의 권장 사항에 따라 미니 압출기를 조립합니다. 그런 다음 결합 버퍼에 있는 1개의 200 나노미터 막에 필터 지지의 2개의 조각을 잠급니다.미니 압출기를 조립하여 완전히 밀폐되도록 하는 것이 중요합니다. 그리고 누출을 확인하는 좋은 방법은 장치를 통해 버퍼를 전달하는 것입니다. 필터 지지 사이에 멤브레인을 끼쳐 미니 압출기에 멤브레인을 배치합니다.평형 1 밀리리터 주사기 중 하나를 사용하여, 미니 압출기를 통해 리포솜 혼합물의 부피와 유사한 결합 버퍼의 볼륨을 전달하고 다른 주사기를 사용하여 미량 원심 분리튜브를 반전시키는 리포솜 혼합물을 떨어뜨려 리포솜의 마지막 을 튜브 캡으로 수집합니다. 그런 다음 200 나노미터 멤브레인을 19~21회 제거하고 압출된 리포솜을 새로운 미세원심분리기 튜브로 수집한다. SNX-BAR 리포솜 결합 및 관제 소심을 수행하기 전에, 초원심분리에 의한 정제된 단백질을 미리 지우고 펠릿을 방해하지 않고 새로운 미세원심분리기 튜브로 상체를 전달한다.다음으로, 정제된 SNX4-ATG20의 4개의 마이크로몰라와 2.5 밀리올러의 총 반응 부피에서 30분 동안 30분 동안 잠복할 수 있습니다. 리포솜 튜브를 시각화하고 정량화하려면 인큐베이션 끝에 즉시 샘플을 탄소 코팅 구리 메쉬 그리드에 발견하고 1%의 우란 아세테이트로 부정적인 얼룩을 발견합니다. 그런 다음 200킬로볼트에서 전염 전자 현미경의 샘플을 분석합니다.리포솜 결합 및 침전물의 경우, 폴리카보네이트 원심분리기 튜브에 반응의 20 마이크로리터를 전송하고 초원심분리기에서 호환 라우터로 샘플을 회전시. 원심분리가 끝나면, 상체를 새로운 미세원심분리기 튜브로 조심스럽게 이송하고 SDS 페이지 샘플 버퍼의 40 마이크로리터에서 펠릿을 재차판으로 재차한다. 펠릿 서스펜션을 새로운 미세원심분리기 튜브로 옮기고 20마이크로리터의 샘플 버퍼를 상퍼에 추가합니다.그런 다음 10% 폴리아크릴아미드 SDS 페이지 젤에 동등한 샘플 볼륨과 상피물을 적재하고 쿠마시 염색을 수행하여 리포솜에 결합된 SNX-BAR을 시각화합니다. SNX-BAR 발현의 적절한 유도를 확인하기 위해, 탠덤 친화 합리 태그에 대한 서쪽 블롯은 SNX-BAR의 단백질 수준으로 쿠마시 얼룩을 통해 검출되지 않을 수 있다. SNX-BAR 이종수의 정화 후, 두 SNX-BAR의 밴드는 일대일 스토이치오메트릭 비율로 나타나야하며 오염 밴드가 거의 또는 전혀 없어야합니다.본 대표적인 분석에서, SNX-BAR 이종성기는 입증된 바와 같이 합성 리포솜에 발현, 정제 및 결합되었다. MVP1은 호모를 형성하고 예상대로 박테리아로 표현되었다는 점에 유의하십시오. 다양한 리포솜 조성물에 결합하는 SNX-BAR는 예를 들어 리포솜 결합에 대한 인산화균제의 효과를 평가하기 위해 밀도에 의해 정량화될 수 있다.전자 현미경 이미징을 통해 SNX4-ATG20 리포솜 튜블을 측정할 수 있으며, 대부분의 튜벌레는 일반적으로 14~26나노미터 사이의 직경을 소유합니다. 정제된 SNX-BAR은 리포솜의 화물 포획 단지로 재구성하여 전체 어셈블리가 멤브레인 리모델링에 어떤 영향을 미칠 수 있는지 이해할 수 있습니다. 정제된 SNX-BAR 디머의 다른 조합의 결합을 다른 지질으로 구성된 합성 지질에 비교할 때, SNX-BAR 단백질은 뚜렷한 지질 결합 선호도를 가지고 있는 것으로 나타났습니다.클로로폼을 취급할 때항상 후드에서 작업하고 날카로운 또는 유리 재료를 취급할 때 적절한 PPE를 착용하십시오.

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetic Engineering of an Unconventional Yeast for Renewable Biofuel and Biochemical Production

신 재생 바이오 연료 및 생물 생산에 대한 자유로운 효모의 유전 공학

Yarrowia lipolytica is a non-pathogenic, dimorphic and strictly aerobic yeast species. Owing to its distinctive physiological features and metabolic ...

연구

유전학

Analysis of Cap-binding Proteins in Human Cells Exposed to Physiological Oxygen Conditions

생리 산소 조건에 노출 된 인간 세포의 캡 결합 단백질의 분석

Translational control is a focal point of gene regulation, especially during periods of cellular stress. Cap-dependent translation via the eIF4F complex ...

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

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대상<em&gt; 현장에서</em신진 효모에서&gt; 돌연변이 유발 히스톤의 유전자

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting ...

Production and Purification of Baculovirus for Gene Therapy Application

생산 및 유전자 치료 응용 프로그램에 대 한 잠재의 정화

Baculovirus has traditionally been used for the production of recombinant protein and vaccine. However, more recently, baculovirus is emerging as a ...

Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere

루트 미생물 탐색: 토양, Rhizosphere, 및 루트 Endosphere에서 세균성 지역 사회 데이터 추출

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to ...

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization (smFISH) Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

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단일 분자 형광에서 제자리 교 잡 (smFISH) 신진 효 모 무성 한 성장 및 감수 분열 분석

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect ...

Informatic Analysis of Sequence Data from Batch Yeast 2-Hybrid Screens

일괄 처리 효 모 2 잡종 스크린에서 시퀀스 데이터의 informatic 분석

We have adapted the yeast 2-hybrid assay to simultaneously uncover dozens of transient and static protein interactions within a single screen utilizing ...

Mating-based Overexpression Library Screening in Yeast

효 모에 짝짓기 기반 Overexpression 라이브러리 심사

Budding yeast has been widely used as a model in studying proteins associated with human diseases. Genome-wide genetic screening is a powerful tool ...

A Deep-sequencing-assisted, Spontaneous Suppressor Screen in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe

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분열 효 모 Schizosaccharomyces pombe 에 깊은 시퀀싱 지원, 자발적인 억압 화면

A genetic screen for mutant alleles that suppress phenotypic defects caused by a mutation is a powerful approach to identify genes that belong to closely ...

Enhanced Yeast One-hybrid Screens To Identify Transcription Factor Binding To Human DNA Sequences

인간의 DNA 시퀀스에 바인딩 전사 요소를 식별 하기 위해 향상 된 효 모 한 하이브리드 화면

Identifying the sets of transcription factors (TFs) that regulate each human gene is a daunting task that requires integrating numerous experimental and ...