Name: expression, purification, and liposome binding of budding yeast snx-bar heterodimers
Uploaded: 2019-12-06T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Expression, Purification, and Liposome Binding of Budding Yeast SNX-BAR Heterodimers at JoVE.com

Forskning rapportert i denne publikasjonen ble støttet av National Institute of General Medical Sciences i National Institutes of Health under pris nummer GM060221 og delvis av National Institute of General Medical Sciences i National Institutes av helse under tildeling nummer T32GM007223. R.C. ble støttet delvis av UNC-Charlotte fakultet Research Grants program.

1. gjær stammekonstruksjon
<ol><li>Begynn med TVY614 (pep4Δ:: LEU2 Prb1Δ:: HisG prc1Δ:: HIS3)11 som den overordnede belastningen. Denne belastningen er mangelfull for vacuolar proteaser, som bidrar til flertallet av protein degradering etter cellelyse, og derfor gir en renere og mer effektiv rensing.</li>
	<li>Design primere12 og integrere tandem affinitet rensing (tap) tag på C-Terminus av ATG20 (SNX-bar ORF 1) ved hjelp homologe rekombina...

<ol>
	<li>Teasdale, R. D., Collins, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+the+PX+(phox-homology)+domain+and+SNX+(sorting+nexin)+protein+families:+structures,+functions+and+roles+in+disease.">Insights into the PX (phox-homology) domain and SNX (sorting nexin) protein families: structures, functions and roles in disease.</a> The Biochemical Journal. 441 (1), 39-59 (2012).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Retromer+Complex+and+Sorting+Nexins+in+Neurodegenerative+Diseases.">The Retromer Complex and Sorting Nexins in Neurodegenerative Diseases.</a> Frontiers in Aging Neuroscience. 10, 79 (2018).</li><li>Burd, C., Cullen, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retromer:+a+master+conductor+of+endosome+sorting.">Retromer: a master conductor of endosome sorting.</a> Cold Spring Harbor perspectives in Biology. 6 (2), (2014).</li><li>Chi, R. J., Harrison, M. S., Burd, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogenesis+of+endosome-derived+transport+carriers.">Biogenesis of endosome-derived transport carriers.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 72 (18), 3441-3455 (2015).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endosomal+receptor+trafficking:+Retromer+and+beyond.">Endosomal receptor trafficking: Retromer and beyond.</a> Traffic (Copenhagen, Denmark). 19 (8), 578-590 (2018).</li><li>Ma, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+trafficking+by+yeast+Snx4+family+SNX-BAR+proteins+promotes+autophagy+and+vacuole+membrane+fusion.">Lipid trafficking by yeast Snx4 family SNX-BAR proteins promotes autophagy and vacuole membrane fusion.</a> Molecular Biology of the Cell. , (2018).</li><li>van Weering, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+for+SNX-BAR-mediated+assembly+of+distinct+endosomal+sorting+tubules.">Molecular basis for SNX-BAR-mediated assembly of distinct endosomal sorting tubules.</a> The EMBO Journal. 31 (23), 4466-4480 (2012).</li><li>Chi, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fission+of+SNX-BAR-coated+endosomal+retrograde+transport+carriers+is+promoted+by+the+dynamin-related+protein+Vps1.">Fission of SNX-BAR-coated endosomal retrograde transport carriers is promoted by the dynamin-related protein Vps1.</a> The Journal of Cell Biology. 204 (5), 793-806 (2014).</li><li>Purushothaman, L. K., Arlt, H., Kuhlee, A., Raunser, S., Ungermann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retromer-driven+membrane+tubulation+separates+endosomal+recycling+from+Rab7/Ypt7-dependent+fusion.">Retromer-driven membrane tubulation separates endosomal recycling from Rab7/Ypt7-dependent fusion.</a> Molecular Biology of the Cell. 28 (6), 783-791 (2017).</li><li>Purushothaman, L. K., Ungermann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cargo+induces+retromer-mediated+membrane+remodeling+on+membranes.">Cargo induces retromer-mediated membrane remodeling on membranes.</a> Molecular Biology of the Cell. 29 (22), 2709-2719 (2018).</li><li>Wurmser, A. E., Emr, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphoinositide+signaling+and+turnover:+PtdIns(3)P,+a+regulator+of+membrane+traffic,+is+transported+to+the+vacuole+and+degraded+by+a+process+that+requires+lumenal+vacuolar+hydrolase+activities.">Phosphoinositide signaling and turnover: PtdIns(3)P, a regulator of membrane traffic, is transported to the vacuole and degraded by a process that requires lumenal vacuolar hydrolase activities.</a> The EMBO journal. 17 (17), 4930-4942 (1998).</li><li>Puig, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tandem+affinity+purification+(TAP)+method:+a+general+procedure+of+protein+complex+purification.">The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification.</a> Methods. 24 (3), 218-229 (2001).</li><li>Kushnirov, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+reliable+protein+extraction+from+yeast.">Rapid and reliable protein extraction from yeast.</a> Yeast. 16 (9), 857-860 (2000).</li><li>Longtine, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Additional+modules+for+versatile+and+economical+PCR-based+gene+deletion+and+modification+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Additional modules for versatile and economical PCR-based gene deletion and modification in Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 14 (10), 953-961 (1998).</li><li>Tropea, J. E., Cherry, S., Waugh, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+purification+of+soluble+His(6)-tagged+TEV+protease.">Expression and purification of soluble His(6)-tagged TEV protease.</a> Methods in Molecular Biology. 498, 297-307 (2009).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphology+and+structure+of+lipoproteins+revealed+by+an+optimized+negative-staining+protocol+of+electron+microscopy.">Morphology and structure of lipoproteins revealed by an optimized negative-staining protocol of electron microscopy.</a> Journal of Lipid Research. 52 (1), 175-184 (2011).</li><li>Yong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+purification+of+the+SNX1/SNX6+complex.">Expression and purification of the SNX1/SNX6 complex.</a> Protein Expression and Purification. 151, 93-98 (2018).</li></ol>

Her viser vi en optimalisert arbeidsflyt for å rense SNX-BAR-dimers i gjær og to analyser for å evaluere sine Biofysiske egenskaper på syntetiske liposomer. Den største fordelen over typiske rekombinant protein uttrykk i Escherichia coli eller andre systemer er evnen til å uttrykke SNX-bar proteiner i en innfødt vert, og dermed unngår toksisitet og uoppløselig problemer som finnes i rensende SNX-barer i andre systemer. Det er også bemerkelsesverdig at systemet ikke krever molekylær kloning eller harbo...

Membran-bundet organeller som plasma membranen, den endoplasmatiske retikulum, det Golgi apparatet, lysosome (gjær vacuole), og endosome utgjør endomembrane systemet av eukaryote cellen. De fleste organeller har evnen til å kommunisere og utveksle materiale med andre organeller gjennom vesicle transport bærere. Hvordan cellen koordinerer emballasjen og dannelsen av vesicle transport bærere innenfor endomembrane systemet er ikke godt forstått. Imidlertid er proteiner og lipider som utgjør mye av endomembrane systemet kjent for å stamme fra internalizing endocytic blemmer fra plasma membranen (PM). Endosome er den primære Acceptor organelle for disse blemmer og består av flere sammenkoblede sett av rørformede organeller. Den viktigste funksjonen til endosome er å lette nærings kjøp, regulere protein og lipid omsetning, beskytte mot patogen infeksjon, og å tjene som den primære påfyll av lipider for plasma membranen. Etter hvert som endosome mottar Hovedtyngden av Last proteiner og lipider fra plasma membranen, fungerer den som et sorterings rom ved å isolere cargos inn i rørformede endosomal transport bærere (ETCs). Alle proteiner som ikke er sequestered i ETCs, blir etterlatt for å bli degradert via Endo-lysosomal-systemet. Den feilregulering av Last sortering i ETCS kan føre til tap av næringsinnhold opptak, protein omsetning eller lipid homeostase, noe som resulterer i mange metabolske, utviklingsmessige, og nevrologiske lidelser1,2. Til tross for ETCs sentrale rolle ved endosome, kan imidlertid den underliggende mekanismen for hvordan endosome selektivt koordinerer emballasjen til en rekke heterogene cargos i rørformede bærere ikke er kjent.
The sortering nexin (SNX) familie er en evolutionarily bevart klasse av proteiner som har blitt funnet å være avgjørende for mange vesicle transport reaksjoner i cellen3,4,5. Sortering nexins er rekruttert til endosome membran og bistand i lasten fangst via deres karakteristiske phox homologi (PX) domene, som binder phosphatidylinositol-3-monofosfat (PtdIns (3) P), en lipid beriket på endosome membran. Pattedyr kode 33 SNX proteiner, som kan videre deles inn i flere underfamilier, i henhold til tilstedeværelsen av andre domener1. Mest spesielt er SNX-BAR gruppe den største gruppe bestående av tolv i menneske, mens i spirende gjær, Saccharomyces cerevisiae, gruppe er redusert til bare syv SNX-barer. SNX-BAR proteiner har både en PX domene og en bin-Amphiphysin-RVs (BAR) domene som utløser lipid reservoarer å binde positive krumning membraner. Følgelig SNX-BAR-familien har en naturlig affinitet for endosome og kan megle ETC formasjon via deres membran remodeling evner. In vitro, remodeling egenskapene til SNX-barer kan bli indusert ved tilsetning av renset SNX-barer til syntetiske liposomer og den påfølgende dannelsen av smale, belagt tubuli kan bli visualisere av elektron mikroskopi. Ved hjelp av disse metodene, har forskerne fastslått at både oligomerisering konsentrasjon og innsnevring styrke ser ut til å variere blant SNX-BAR familien antyder de kunne hjelpe i både dannelse og scission av ETCs.
Den SNX-barer kan bli ytterligere klassifisert av sine eksklusive dimerization egenskaper. Analyser og strukturelle studier har vist at SNX-BAR proteiner bare kan danne spesifikke homodimers eller heterodimerer. Derfor, i prinsippet, kan hver potensiell SNX-BAR dimer-oligomer gi en tubule pels for en Last-spesifikk menneskehandel sti og likeledes, den begrensede oligomerisering av de andre SNX-BAR protomers, kanne likeledes definere distinkte eksport trasé. Men på grunn av det store antallet SNX-barer og mangfoldet i SNX-familien, er det svært usannsynlig med én sorterings nexin-en Last hypotese. I stedet en koordinert innsats ved hjelp av en rekke faktorer som SNX-barer, Last, lipid spesifisitet og andre avhengigheter er mer sannsynlig. Likeledes, nyere studier av gjær SNX4 familien avdekket bevis for ekstra lipid spesifisitet, utover PtdIns (3) P, til forsterke endosome transport bærere6. I denne studien, SNX-BAR homodimer Mvp1-Mvp1 ble renset fra bakterier og innfødte heterodimerer Snx4-Atg20 og Vps5-Vps17 ble uttrykt og renset i høy avkastning fra gjær, mens bare Snx4-Atg20 ble funnet å fortrinnsvis bind fosfatidylserin (PS) og danner smale rør-lignende strukturer i liposome bindende studier6. Mens andre i feltet har avdekket viktige egenskaper av SNX-barer bruker recombinantly renset SNX-bar homodimers fra bakterier, har toksisitet forbundet med å uttrykke SNX-bar heterodimerer i lignende systemer hindret deres innfødte karakterisering7,8,9,10. Derfor, uten et pålitelig system for å få rene recombinantly uttrykt innfødt heterodimerer, må forskerne avkall disse linjene av etterforskningen. I figur 1, presenterer vi en fire-del arbeidsflyt til 1) konstruere en gjær STAMME overexpressing SNX-bar heterodimerer for tandem affinitet rensing, 2) uttrykke og RENSE native SNX-bar heterodimerer, 3) forberede unilamellære syntetiske liposomer, og 4) sette opp en liposome tubulation eller sedimentations analysen, som gir et viktig verktøy for forskere å undersøke den voksende katalog av sortering nexins funnet i naturen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 micrometer PC Membranes</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>610006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Poly-Prep Chromatography column (Bio-Rad)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>731-1550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27 Gauge needle</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>301629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra Centrifugal Filter with 10K cutoff</td>
			<td>Amicon</td>
			<td>UFC501024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avestin EmulsiFlex-C3 Homogenizer</td>
			<td>Avestin</td>
			<td>EF-C3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA assay</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman Optima MAX-XP Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>393315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4693116001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOPC</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>850375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOPS</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>840035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ergosterol (Sigma)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>47130-U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extruder Set with Block 0.2 microlter/1mL</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>610000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">FEI Tecnai F20 transmission electron microscope (200 kV)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass culture tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>47729-570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG sepharose beads (GE Healthcare)</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0969-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microlter glass syringes</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>7637-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New Brunswick Excella E25</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>M1353-0000</td>
			<td>or equivalent shaking 30 C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA Magnetic Agarose Beads</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>78605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima XE-90 Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A94516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M</td>
			<td>VWR</td>
			<td>52858-076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PI3P</td>
			<td>Echelon</td>
			<td>P-3016</td>
			<td>or Echelon equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate bottle assembly</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>355622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLA-100 Fixed-Angle Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>343840</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type 45 Ti Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Desiccator, Bottom and Lid with Socket Valve</td>
			<td>VWR</td>
			<td>75871-436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Pump Alcatel (Pascal 2005 C1)</td>
			<td>A&#38;J Vacuum</td>
			<td>PN07050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex with foam holder</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10153-838</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR KIT MICROTUBE</td>
			<td>VWR</td>
			<td>12620-880</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

expression, purification, and liposome binding of budding yeast snx-bar heterodimers

SNX-BAR proteiner er en evolutionarily, bevart klasse av membran remodeling proteiner som spiller nøkkelroller i sortering og smugling av proteiner og lipider under endocytose, sortering i endosomal systemet, og autofagi. Sentralt i SNX-BAR protein funksjon er evnen til å danne homodimers eller heterodimerer som binder membraner ved hjelp av svært bevarte phox-homologi (PX) og BAR (bin/Amphiphysin/RVs) domener. I tillegg kan oligomerisering av SNX-BAR dimers på membraner lokke fram dannelsen av membran tubuli og blemmer, og denne aktiviteten er antatt å reflektere deres funksjoner som pels proteiner for endosome-avledet transport bærere. Forskere har lenge utnyttet in vitro bindende studier ved hjelp av rekombinant SNX-BAR proteiner på syntetiske liposomer eller gigantiske unilamellære blemmer (GUVs) for å avdekke presis makeup av lipider som trengs for å drive membran remodeling, og dermed avsløre deres virkningsmekanisme. Men på grunn av tekniske utfordringer med doble uttrykks systemer, toksisitet av SNX protein uttrykk i bakterier, og dårlig løselighet av individuelle SNX-BAR proteiner, har de fleste studier hittil undersøkt SNX-BAR homodimers, inkludert ikke-fysiologiske dimers som dannes underuttrykk i bakterier. Nylig har vi optimalisert en protokoll for å overvinne de store svakhetene ved en typisk bakteriell uttrykk system. Ved hjelp av denne arbeidsflyten demonstrerer vi hvordan du kan uttrykke og rense store mengder SNX-heterodimerer og hvordan du Rekonstituer dem på syntetiske liposomer for bindende og tubulation analyser.

Denne protokollen beskriver en metode for reproduserbar og robust produksjon av endogene gjær SNX-BAR komplekser som kan brukes til nedstrøms membran remodeling analyser (figur 1). Byggingen av gjær belastningen som brukes for rensing utnytter effektiviteten av homologe rekombinasjon i spirende gjær, noe som åpner for modifikasjoner på genomisk Loci av målrettede SNX-barer (figur 2). Denne designen har to fordeler, (i) som...

Watch this Scientific Journal Video about Expression, Purification, and Liposome Binding of Budding Yeast SNX-BAR Heterodimers at JoVE.com

Expression, Purification, and Liposome Binding of Budding Yeast SNX-BAR Heterodimers

Her presenterer vi en arbeidsflyt for uttrykk, rensing og liposome binding av SNX-BAR heterodimerer i gjær.

Uttrykk, rensing, og liposome binding av spirende gjær SNX-BAR heterodimerer

SNX-BAR proteins are an evolutionarily conserved class of membrane remodeling proteins that play key roles in sorting and trafficking of protein and ...

SNX-BARs er membran ombygging proteiner som spiller sentrale roller i menneskelig sykdom. Ved hjelp av våre metoder kan vi bestemme deres presise biofysiske egenskaper for å lette lipidbinding og membran ombygging. Rensing av SNB-BAR-proteinene fra gjærceller gjør det mulig å anskaffe innfødte homo- og hetero SNX-BAR-dimers samtidig som toksisiteten og uløseligheten ofte oppstår med ikke-innfødte uttrykkssystemer.Våre metoder kan brukes til å forstå lipidspesifisitetene til alle gjærSNX-BARs eller for å produsere rekombinante SNX-BAR proteiner fra andre organismer. En korrekt ekstruderenhet er avgjørende for å forhindre liposomtap under ekstruderingsprosessen. For å begynne studenter eller de som er nye på feltet, vil visuelt observere de mest kritiske trinnene i stor grad forbedre sjansene dine for suksess.Begynn med å vaksinere en stor vattpinne av gjærceller i en kolbe minst fire ganger volumet av kulturen som inneholder 50 milliliter standard YP-medium supplert med 2% raffinose og 0,1% glukose som karbonkilde og vokse kulturen over natten i en 30 grader Celsius shaker. Neste morgen, inokulerer 50 milliliter pre-kultur i en liter standard YP medium med 2% raffinose og 0,1% glukose i en 2,8 liters volum forvirret Fernbach kolbe for en fire til fem timers kultur i risting inkubator. Når den optiske tettheten på 600 nanometer når 0,2, legg galaktose til en endelig konsentrasjon på 2% til cellene for en overnattingskultur i risting inkubatoren.Neste morgen høster du celler ved sentrifugering og overfører gjærpellet til et 50 milliliter konisk rør. Resuspend pellet i 15 milliliter rensing buffer for å oppnå et endelig volum på ca 30 milliliter og laste celle suspensjon på en homogenisator kjølt til fire grader Celsius. Lyse prøvene på 20 til 25, 000 pounds per kvadrattomme for to til tre runder og overføre lysate til en ny 50 milliliter konisk rør på is.Fjern umiddelbart cellelylat ved sentrifugering og overfør forsiktig supernatanten til et nytt rør. Deretter likevekt 300 mikroliter av IgG Sepharose perler med tre re-suspensjoner i rensing buffer før du legger perlene til ryddet celle lysate for en to-timers inkubasjon med roterende ved fire grader Celsius. På slutten av inkubasjonen, legg perlene til en 10 milliliter kromatografikolonne og la det ubundne lysatet strømme gjennom.Vask perlene 10 ganger med en milliliter vaskebuffer per vask slik at hver vask kan strømme gjennom helt før du legger til neste volum. Etter siste vask, bruk en pipette og frisk buffer for å overføre perlene til et mikrocentrifugerør. Ta det totale volumet av perlene til 500 mikroliter med fersk vaskebuffer og fjern perlene fra lysatet med to mikroliter på 10 mg per milliliter TEV protease for en overnattingsinkubasjon med rotasjon ved fire grader Celsius.Neste morgen, bruk en 27 gauge nål for å fjerne supernatant helt og vurdere protein renhet med 10% polyakrylamid SDS side. Kvantifisere deretter de konsentrerte proteinene ved hjelp av Bradford-proteinanalysen i henhold til standardprotokoller og lagre proteinet i opptil en uke ved fire grader Celsius. For å forberede liposomer, bruk glasssprøyter til å overføre lagerlipider til et rent glasskulturrør for å oppnå en endelig lipidblanding av 1% fosfaforylinositol-3-fosfat, 20% ergosterol, 30% fosfalydylserin, fosfatatidylcholine som beskrevet i tabellen.Avhengig av løsemidlene hver lipid er resuspended i, blandingen kan slå overskyet ved tilsetning av hver lipid. Tørk forsiktig ned lipidblandingene ved å rette nitrogengass med lav strøm mot blandingene i en sirkulær bevegelse for å behandle lipidene jevnt på bunnen av glassrøret. Pakk deretter glasskulturrøret med folie som forlater åpningen avdekket og dehydrerer lipidene ytterligere i et vakuum i en time.På slutten av inkubasjonen, tilsett 400 mikroliter med bindingsbuffer til hvert hetteglass for å fullstendig rehydrere lipidene ved en endelig liposomkonsentrasjon på 2,5 millimolar før du gjenbruker lipidene med middels hastighet på en virvel ved romtemperatur i 30 minutter. Bufferen skal bli overskyet etter hvert som lipidene blir gjenbrukt. Overfør de resuspended liposomer til en mikrocentrifuge rør og fryse rørene i flytende nitrogen etterfulgt av tining i en 37 grader Celsius vannbad syv til åtte ganger.I en kjemisk røykhette rengjør du to en milliliter glasssprøyter med et fullt volum kloroform tre ganger per sprøyte for å fjerne eventuelle gjenværende lipider og likevekte hver sprøyte med to volumer ultrapure vann og to binders buffer. Monter en mini-ekstruder i henhold til produsentens anbefalinger. Senk deretter to stykker filterstøtte i en 200 nanometer membran i bindingsbuffer.Det er viktig å montere mini-ekstruderen slik at den er helt lufttett. Og en god måte å se etter lekkasjer på er å sende buffer gjennom enheten. Smør membranen mellom filterstøttene og legg membranen i mini-ekstruderen.Ved hjelp av en av de likevektede en millilitersprøytene, send et volum av bindingsbuffer som ligner på volumet av liposometblandingen gjennom mini-ekstruderen og bruk den andre sprøyten til å slippe liposometblandingen som inverterer mikrocentrifugerøret for å samle den siste av liposomer inn i rørhetten for deres samling. Ekstruder deretter liposomer gjennom 200 nanometermembranen 19 til 21 ganger og samle ekstruderte liposomer i et nytt mikrocentrifugerør. Før du utfører SNX-BAR liposombindings- og tubuleringsanalysene, må du forhåndsklarere det rensede proteinet ved ultracentrifugation og overføre supernatanten til et nytt mikrocentrifugerør uten å forstyrre pelleten.Deretter inkubere fire mikromolar renset SNX4-ATG20 og 2,5 millimolar liposomer i et totalt reaksjonsvolum på 20 mikroliter for en 30-minutters inkubasjon ved 30 grader Celsius. For å visualisere og kvantifisere liposomet tubulation, på slutten av inkubasjonen, umiddelbart oppdage prøvene på en karbonbelagt kobber mesh rutenett og negativ flekk med 1% uranyl acetat. Analyser deretter prøvene på et transmisjonselektronmikroskop ved 200 kilovolt.For liposombinding og sedimentering, overfør 20 mikroliter av reaksjonen på et polykarbonat sentrifugerør og spinn prøven med en kompatibel ruter i en ultracentrifuge. På slutten av sentrifugeringen, nøye overføre supernatant til en ny mikrocentrifuge rør og gjenbruk pellet i 40 mikroliter sDS side prøvebuffer. Overfør pelletsuspensjonen til et nytt mikrocentrifugerør og tilsett 20 mikroliter prøvebuffer til det supernatante.Deretter laster du tilsvarende prøvevolumer av pellet og supernatant på en 10% polyakrylamid SDS-sidegel og utfører Coomassie-farging for å visualisere SNX-BARs bundet til liposomene. For å se etter riktig induksjon av SNX-BAR-uttrykk, kan en vestlig flekk mot tandemaffinitetsrensingskoden brukes, da proteinnivåene til SNX-BARs ikke kan oppdages via Coomassie-flekken. Etter rensing av SNX-BAR heterodimer, bør båndene til de to SNX-BARs vises i et en-til-en stoichiometrisk forhold, og det bør være lite eller ingen forurensende bånd.I denne representative analysen ble SNX-BAR heterodimerer uttrykt, renset og bundet til syntetiske liposomer som vist. Merk at MVP1 dannet homodimers og ble uttrykt i bakterier som forventet. SNX-BAR binding til varierende liposomsammensetninger kan kvantifiseres ved densitometri for å vurdere effekten av fosfadylserin for eksempel på liposombinding.Elektronmikroskopiavbildning gjør det mulig å måle SNX4-ATG20 liposomtubuli med de fleste tubuli som vanligvis har diameter mellom 14 og 26 nanometer. Vær oppmerksom på at rensede SNX-BARs kan rekonstitueres med lastfangstkomplekser på liposomer for å forstå hvordan fulle forsamlinger kan påvirke ombygging av membran. Ved sammenligning av bindingen av ulike kombinasjoner av rensede SNX-BAR-dimers med syntetiske liposomer bestående av forskjellige lipider, ble SNX-BAR-proteiner funnet å ha forskjellige lipidbindende preferanser.Arbeid alltid i en hette når du håndterer kloroform og sørg for å ha riktig PPE ved håndtering av skarpe eller glassmateriale.

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetic Engineering of an Unconventional Yeast for Renewable Biofuel and Biochemical Production

Genetic Engineering av en ukonvensjonell gjær for fornybar Biodrivstoff og biokjemiske Produksjon

Yarrowia lipolytica is a non-pathogenic, dimorphic and strictly aerobic yeast species. Owing to its distinctive physiological features and metabolic ...

Analysis of Cap-binding Proteins in Human Cells Exposed to Physiological Oxygen Conditions

Analyse av Cap-bindende proteiner i humane celler eksponert for Fysiologiske oksygenforholdene

Translational control is a focal point of gene regulation, especially during periods of cellular stress. Cap-dependent translation via the eIF4F complex ...

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

målrettet<em&gt; I Situ</em&gt; mutagenese av Histone Gener i Budding Gjær

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting ...

Production and Purification of Baculovirus for Gene Therapy Application

Produksjon og rensing av Baculovirus for genterapi program

Baculovirus has traditionally been used for the production of recombinant protein and vaccine. However, more recently, baculovirus is emerging as a ...

Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere

Utforske rot Microbiome: utpakking bakterielle samfunnet Data fra jord, Rhizosphere og rot Endosphere

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to ...

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization (smFISH) Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Ett molekyl fluorescens In Situ hybridisering (smFISH) analyse i spirende gjær vegetativ vekst og meiose

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect ...

Informatic Analysis of Sequence Data from Batch Yeast 2-Hybrid Screens

Informatic analyse av sekvens Data fra satsvis gjær 2-Hybrid-skjermer

We have adapted the yeast 2-hybrid assay to simultaneously uncover dozens of transient and static protein interactions within a single screen utilizing ...

Mating-based Overexpression Library Screening in Yeast

Parring-baserte overuttrykte biblioteket Screening i gjær

Budding yeast has been widely used as a model in studying proteins associated with human diseases. Genome-wide genetic screening is a powerful tool ...

A Deep-sequencing-assisted, Spontaneous Suppressor Screen in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe

A Deep-sequencing-assisted, Spontaneous Suppressor Screen in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe

En dyp-sekvensering-assistert, spontane Suppressor skjerm i fisjon gjær Schizosaccharomyces pombe

A genetic screen for mutant alleles that suppress phenotypic defects caused by a mutation is a powerful approach to identify genes that belong to closely ...

Enhanced Yeast One-hybrid Screens To Identify Transcription Factor Binding To Human DNA Sequences

Forbedret gjær ett-hybrid-skjermer å identifisere transkripsjon faktor Binding til menneskelig DNA-sekvenser

Identifying the sets of transcription factors (TFs) that regulate each human gene is a daunting task that requires integrating numerous experimental and ...