Name: expression, purification, and liposome binding of budding yeast snx-bar heterodimers
Uploaded: 2019-12-06T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Expression, Purification, and Liposome Binding of Budding Yeast SNX-BAR Heterodimers at JoVE.com

Pesquisa relatada nesta publicação foi apoiada pelo Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais dos Institutos Nacionais de Saúde o número de premiação GM060221 e em parte pelo Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais dos Institutos Nacionais de Saúde o número de prêmio T32GM007223. R.C. foi apoiado em parte pelo Programa de Bolsas de Pesquisa da Faculdade UNC-Charlotte.

1. Construção da tensão do fermento
<ol><li>Comece com TVY614 (pep4Δ::LEU2 prb1Δ::hisG prc1Δ::HIS3)11 como a cepa pai. Esta cepa é deficiente para proteases vacuolares, que contribuem para a maioria da degradação da proteína após a lisose celular e, portanto, permite uma purificação mais limpa e eficiente.</li>
	<li>Projetar primers12 e integrar aplicação em conjunto purificação (TAP) tag no C-terminus de Atg20 (SNX-BAR ORF 1) u...

<ol>
	<li>Teasdale, R. D., Collins, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+the+PX+(phox-homology)+domain+and+SNX+(sorting+nexin)+protein+families:+structures,+functions+and+roles+in+disease.">Insights into the PX (phox-homology) domain and SNX (sorting nexin) protein families: structures, functions and roles in disease.</a> The Biochemical Journal. 441 (1), 39-59 (2012).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Retromer+Complex+and+Sorting+Nexins+in+Neurodegenerative+Diseases.">The Retromer Complex and Sorting Nexins in Neurodegenerative Diseases.</a> Frontiers in Aging Neuroscience. 10, 79 (2018).</li><li>Burd, C., Cullen, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retromer:+a+master+conductor+of+endosome+sorting.">Retromer: a master conductor of endosome sorting.</a> Cold Spring Harbor perspectives in Biology. 6 (2), (2014).</li><li>Chi, R. J., Harrison, M. S., Burd, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogenesis+of+endosome-derived+transport+carriers.">Biogenesis of endosome-derived transport carriers.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 72 (18), 3441-3455 (2015).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endosomal+receptor+trafficking:+Retromer+and+beyond.">Endosomal receptor trafficking: Retromer and beyond.</a> Traffic (Copenhagen, Denmark). 19 (8), 578-590 (2018).</li><li>Ma, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+trafficking+by+yeast+Snx4+family+SNX-BAR+proteins+promotes+autophagy+and+vacuole+membrane+fusion.">Lipid trafficking by yeast Snx4 family SNX-BAR proteins promotes autophagy and vacuole membrane fusion.</a> Molecular Biology of the Cell. , (2018).</li><li>van Weering, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+for+SNX-BAR-mediated+assembly+of+distinct+endosomal+sorting+tubules.">Molecular basis for SNX-BAR-mediated assembly of distinct endosomal sorting tubules.</a> The EMBO Journal. 31 (23), 4466-4480 (2012).</li><li>Chi, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fission+of+SNX-BAR-coated+endosomal+retrograde+transport+carriers+is+promoted+by+the+dynamin-related+protein+Vps1.">Fission of SNX-BAR-coated endosomal retrograde transport carriers is promoted by the dynamin-related protein Vps1.</a> The Journal of Cell Biology. 204 (5), 793-806 (2014).</li><li>Purushothaman, L. K., Arlt, H., Kuhlee, A., Raunser, S., Ungermann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retromer-driven+membrane+tubulation+separates+endosomal+recycling+from+Rab7/Ypt7-dependent+fusion.">Retromer-driven membrane tubulation separates endosomal recycling from Rab7/Ypt7-dependent fusion.</a> Molecular Biology of the Cell. 28 (6), 783-791 (2017).</li><li>Purushothaman, L. K., Ungermann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cargo+induces+retromer-mediated+membrane+remodeling+on+membranes.">Cargo induces retromer-mediated membrane remodeling on membranes.</a> Molecular Biology of the Cell. 29 (22), 2709-2719 (2018).</li><li>Wurmser, A. E., Emr, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphoinositide+signaling+and+turnover:+PtdIns(3)P,+a+regulator+of+membrane+traffic,+is+transported+to+the+vacuole+and+degraded+by+a+process+that+requires+lumenal+vacuolar+hydrolase+activities.">Phosphoinositide signaling and turnover: PtdIns(3)P, a regulator of membrane traffic, is transported to the vacuole and degraded by a process that requires lumenal vacuolar hydrolase activities.</a> The EMBO journal. 17 (17), 4930-4942 (1998).</li><li>Puig, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tandem+affinity+purification+(TAP)+method:+a+general+procedure+of+protein+complex+purification.">The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification.</a> Methods. 24 (3), 218-229 (2001).</li><li>Kushnirov, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+reliable+protein+extraction+from+yeast.">Rapid and reliable protein extraction from yeast.</a> Yeast. 16 (9), 857-860 (2000).</li><li>Longtine, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Additional+modules+for+versatile+and+economical+PCR-based+gene+deletion+and+modification+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Additional modules for versatile and economical PCR-based gene deletion and modification in Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 14 (10), 953-961 (1998).</li><li>Tropea, J. E., Cherry, S., Waugh, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+purification+of+soluble+His(6)-tagged+TEV+protease.">Expression and purification of soluble His(6)-tagged TEV protease.</a> Methods in Molecular Biology. 498, 297-307 (2009).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphology+and+structure+of+lipoproteins+revealed+by+an+optimized+negative-staining+protocol+of+electron+microscopy.">Morphology and structure of lipoproteins revealed by an optimized negative-staining protocol of electron microscopy.</a> Journal of Lipid Research. 52 (1), 175-184 (2011).</li><li>Yong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+purification+of+the+SNX1/SNX6+complex.">Expression and purification of the SNX1/SNX6 complex.</a> Protein Expression and Purification. 151, 93-98 (2018).</li></ol>

Aqui, demonstramos um fluxo de trabalho otimizado para purificar os dimers SNX-BAR em levedura e dois ensaios para avaliar suas propriedades biofísicas em lipossomas sintéticos. A principal vantagem sobre a expressão típica de proteína recombinante em Escherichia coli ou outros sistemas é a capacidade de expressar uniformemente as proteínas SNX-BAR em um hospedeiro nativo, evitando assim as questões de toxicidade e insolubilidade encontradas na purificação de SNX-BARs em outros sistemas. Também é not...

Organelas ligadas à membrana, como a membrana plasmática, o retículo endoplasmico, o aparelho Golgi, o lisósoma (vacuole de levedura) e o endosome compõem o sistema de endosmembrana da célula eucariótica. A maioria das organelas tem a capacidade de comunicar e trocar material com outras organelas através de transportadores de transporte de vesículas. Como a célula coordena a embalagem e formação de transportadores de transporte de vesículas dentro do sistema de endosmembrana não é bem compreendida. No entanto, as proteínas e lipídios que constituem grande parte do sistema de endosmembrana são conhecidos por se originar de internalizar vesículas endócticas da membrana plasmática (PM). O endosome é o organela principal do acceptor para estas vesículas e é compreendido de jogos interconectados múltiplos de organelas tubulares. A principal função do endosome é facilitar a aquisição de nutrientes, regular o volume de negócios de proteínas e lipídios, proteger contra a infecção por patógenos e servir como a principal fonte de reposição de lipídios para a membrana plasmática. Como o endosome recebe a maior parte das proteínas de carga e lipídios da membrana plasmática, ele atua como um compartimento de triagem, isolando as cargas em transportadores de transporte endosômico tubular (ETCs). Quaisquer proteínas não seqüecidas em ETCs são deixadas para serem degradadas através do sistema endo-lossômico. A desregulação da classificação de carga em ETCs pode levar à perda de absorção de nutrientes, rotatividade de proteínas ou homeostase lipídica, resultando em inúmeras distúrbios metabólicos, de desenvolvimento e neurológicos1,2. No entanto, apesar do papel central dos ETCs no endossômico, o mecanismo subjacente de como o endossôpode pode coordenar seletivamente a embalagem de uma infinidade de cargas heterogêneas em portadores tubulares não é conhecido.
A família de triagem nexina (SNX) é uma classe evolutivamente conservada de proteínas que foram consideradas críticas para muitas reações de transporte de vesículana na célula3,4,5. A triagem de nexinas é recrutada para a membrana endossômica e ajuda na captura de carga através de seu domínio característico de homologia foscar (PX), que liga fosphatidylinositol-3-monofosfato (PtdIns(3)P), um lipídio enriquecido na membrana endossô. Mamíferos codificam trinta e três proteínas SNX, que podem ser ainda mais divididas em várias subfamílias, de acordo com a presença de outros domínios1. Mais notavelmente, a subfamília SNX-BAR é a maior subfamília composta por doze em humanos, enquanto no fermento em ascensão, Saccharomyces cerevisiae, a subfamília é reduzida para apenas sete SNX-BARs. As proteínas SNX-BAR têm um domínio PX e um domínio Bin-Anfiphysin-Rvs (BAR) que desencadeia reservatórios lipídicos para ligar membranas de curvatura positiva. Consequentemente, a família SNX-BAR tem uma afinidade natural com o endossôe e pode mediar a formação etc através de suas habilidades de remodelação da membrana. In vitro, as propriedades de remodelação dos SNX-BARs podem ser induzidas pela adição de SNX-BARs purificados a lipossomos sintéticos e a formação subsequente de tubulos estreitos e revestidos pode ser visualizada por microscopia eletrônica. Usando esses métodos, os pesquisadores determinaram que tanto a concentração de oligomerização quanto a força de constrição parecem variar entre a família SNX-BAR, sugerindo que eles poderiam ajudar tanto na formação quanto na scission dos ETCs.
Os SNX-BARs podem ser classificados ainda mais por suas propriedades exclusivas de dimerização. Ensaios e estudos estruturais in vitro vinculativos demonstraram que as proteínas SNX-BAR só podem formar homodimers ou heterodimers específicos. Portanto, em princípio, cada potencial dimer-oligomer SNX-BAR poderia fornecer um casaco tubule para uma via de tráfico específico de carga e, da mesma forma, a oligomerização restrita dos outros protomermers SNX-BAR, também pode definir caminhos de exportação distintos. No entanto, devido ao grande número de SNX-BARs e diversidade dentro da família SNX, uma hipótese de carga nexina-one de triagem é altamente improvável. Em vez disso, um esforço coordenado usando uma infinidade de fatores, como SNX-BARs, carga, especificidade lipídicas e outras dependências é mais provável. Da mesma forma, estudos recentes da família levedura SNX4 revelaram evidências de especificidade lipídica adicional, além de PtdIns (3)P, para potencializar transportadores de transporte endôssomo6. Neste estudo, SNX-BAR homodimer Mvp1-Mvp1 foi purificado de bactérias e heterodimers nativos Snx4-Atg20 e Vps5-Vps17 foram expressos e purificados em alto rendimento de levedura, enquanto apenas Snx4-Atg20 foi encontrado para ligar preferencialmente phosphatidylserine (PS) e forma estreita tubo-como estruturas em estudos de ligação liposome6. Enquanto outros no campo revelaram propriedades importantes dos SNX-BARs usando homodimers SNX-BAR recombinantemente purificados de bactérias, toxicidade associada à expressão heterodimers SNX-BAR em sistemas semelhantes têm dificultado a sua caracterização nativa7,8,9,10. Portanto, sem um sistema confiável para obter heterodimers nativos recombinantemente expressos, os pesquisadores devem renunciar a essas linhas de investigação. Na Figura 1,apresentamos um fluxo de trabalho em quatro partes para 1) construímos uma cepa de levedura superexpressando heterodimers SNX-BAR para purificação de afinidade tandem, 2) expressar e purificar heterodimers nativos SNX-BAR, 3) preparar lipossomos sintéticos unilamellares, e 4) configurar uma tubulação liossoma ou ensaio sedimentações, fornecendo uma ferramenta vital para os pesquisadores para investigar o catálogo crescente de nexinos classificação encontradona natureza.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 micrometer PC Membranes</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>610006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Poly-Prep Chromatography column (Bio-Rad)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>731-1550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27 Gauge needle</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>301629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra Centrifugal Filter with 10K cutoff</td>
			<td>Amicon</td>
			<td>UFC501024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avestin EmulsiFlex-C3 Homogenizer</td>
			<td>Avestin</td>
			<td>EF-C3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA assay</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman Optima MAX-XP Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>393315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4693116001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOPC</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>850375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOPS</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>840035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ergosterol (Sigma)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>47130-U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extruder Set with Block 0.2 microlter/1mL</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>610000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">FEI Tecnai F20 transmission electron microscope (200 kV)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass culture tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>47729-570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG sepharose beads (GE Healthcare)</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0969-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microlter glass syringes</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>7637-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New Brunswick Excella E25</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>M1353-0000</td>
			<td>or equivalent shaking 30 C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA Magnetic Agarose Beads</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>78605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima XE-90 Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A94516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M</td>
			<td>VWR</td>
			<td>52858-076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PI3P</td>
			<td>Echelon</td>
			<td>P-3016</td>
			<td>or Echelon equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate bottle assembly</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>355622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLA-100 Fixed-Angle Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>343840</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type 45 Ti Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Desiccator, Bottom and Lid with Socket Valve</td>
			<td>VWR</td>
			<td>75871-436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Pump Alcatel (Pascal 2005 C1)</td>
			<td>A&#38;J Vacuum</td>
			<td>PN07050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex with foam holder</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10153-838</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR KIT MICROTUBE</td>
			<td>VWR</td>
			<td>12620-880</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

expression, purification, and liposome binding of budding yeast snx-bar heterodimers

As proteínas SNX-BAR são uma classe evolutivamente conservada de proteínas de remodelação da membrana que desempenham papéis fundamentais na triagem e tráfico de proteínas e lipídios durante a endocitose, classificação dentro do sistema endosômico e autofagia. Central para a função de proteína SNX-BAR é a capacidade de formar homodimers ou heterodimers que ligam membranas usando altamente conservado phox-homologia (PX) e BAR (Bin / Anfiphysin / Rvs) domínios. Além disso, a oligomerização dos dimers SNX-BAR nas membranas pode provocar a formação de túbulos e vesículas de membrana e esta atividade é pensada para refletir suas funções como proteínas de revestimento para transportadores de transporte derivados do endosome. Os investigadores têm utilizado por muito tempo estudos de ligação in vitro usando proteínas recombinantes de SNX-BAR em lipossomos sintéticos ou vesículas unilamellares gigantes (GUVs) para revelar a composição precisa dos lipids necessários para conduzir a remodelação da membrana, assim revelando seu mecanismo da ação. No entanto, devido a desafios técnicos com sistemas de dupla expressão, toxicidade da expressão de proteína SNX-BAR em bactérias e falta de solubilidade de proteínas SNX-BAR individuais, a maioria dos estudos até o momento examinaram homodimers SNX-BAR, incluindo dimers não fisiológicos que se formam durante a expressão em bactérias. Recentemente, otimizamos um protocolo para superar as principais deficiências de um sistema típico de expressão bacteriana. Usando este fluxo de trabalho, demonstramos como expressar e purificar com sucesso grandes quantidades de heterodimers SNX-BAR e como reconstituí-los em lipossomos sintéticos para ensaios de ligação e tubulação.

Este protocolo descreve um método para a produção reproduzível e robusta de complexos endógenos de levedura SNX-BAR que podem ser usados para ensaios de remodelação da membrana a jusante (Figura 1). A construção da cepa de levedura utilizada para purificação aproveita a eficiência da recombinação homóloga no fermento em brotamento, permitindo modificações nos loci genômicos dos SNX-BARs alvo (Figura 2). Este pro...

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Expression, Purification, and Liposome Binding of Budding Yeast SNX-BAR Heterodimers

Aqui, apresentamos um fluxo de trabalho para a expressão, purificação e ligação liposoma de heterodimers SNX-BAR em levedura.

Expressão, purificação e ligação lipossoma dos heterodimers brotamentos do SNX-BAR do fermento

SNX-BAR proteins are an evolutionarily conserved class of membrane remodeling proteins that play key roles in sorting and trafficking of protein and ...

SNX-BARs são proteínas de remodelação de membranas que desempenham papéis-chave na doença humana. Usando nossos métodos, podemos determinar suas propriedades biofísicas precisas para facilitar a ligação lipídica e a remodelação da membrana. A purificação das proteínas SNB-BAR das células de levedura permite a aquisição de dimers homo nativos e hetero SNX-BAR, minimizando a toxicidade e insolubilidade frequentemente encontradas com sistemas de expressão não-nativos.Nossos métodos podem ser usados para entender as especificidades lipídicas de todas as leveduras SNX-BARs ou para produzir proteínas SNX-BAR recombinantes de qualquer outro organismo. Um conjunto de extrusor correto é essencial para evitar a perda de lipossomos durante o processo de extrusão. Para os alunos iniciantes ou aqueles novos no campo, observar visualmente os passos mais críticos melhorará muito suas chances de sucesso.Comece inoculando um grande cotonete de células de levedura em um frasco pelo menos quatro vezes o volume da cultura contendo 50 mililitros de YP médio padrão complementados com 2% raffinose e 0,1% de glicose como fonte de carbono e crescer a cultura durante a noite em um shaker Celsius de 30 graus. Na manhã seguinte, inocular a pré-cultura de 50 mililitros em um litro de média YP padrão com 2%raffinose e 0,1% de glicose em um volume de 2,8 litros confundiu o frasco de Fernbach por uma cultura de quatro a cinco horas na incubadora de agitação. Quando a densidade óptica em 600 nanômetros atingir 0,2, adicione galactose a uma concentração final de 2% às células para uma cultura noturna na incubadora de agitação.Na manhã seguinte, colde células por centrifugação e transfira a pelota de levedura para um tubo cônico de 50 mililitros. Resuspengue a pelota em 15 mililitros de tampão de purificação para obter um volume final de cerca de 30 mililitros e carregue a suspensão da célula em um homogeneizador refrigerado a quatro graus Celsius. Lyse as amostras de 20 a 25.000 libras por polegada quadrada por duas a três rodadas e transfira o lysate para um novo tubo cônico de 50 mililitros no gelo.Limpe imediatamente o lisecelular por centrifugação e transfira cuidadosamente o sobrenante para um novo tubo. Em seguida, equilibre 300 microliters de contas IgG Sepharose com três re-suspensões no tampão de purificação antes de adicionar as contas ao lysate celular limpo para uma incubação de duas horas com rotação a quatro graus Celsius. No final da incubação, adicione as contas a uma coluna de cromatografia de 10 mililitros e permita que o lysate desvinculado flua.Lave as contas 10 vezes com um mililitro de tampão de lavagem por lavagem, permitindo que cada lavagem flua completamente antes de adicionar o próximo volume. Após a última lavagem, use uma pipeta e um tampão fresco para transferir as contas para um tubo de microcentrifutura. Leve o volume total das contas para 500 microliters com tampão de lavagem fresco e remova as contas do lysate com dois microliters de 10 miligramas por mililitro TEV protease para uma incubação noturna com rotação a quatro graus Celsius.Na manhã seguinte, use uma agulha de calibre 27 para remover completamente o sobrenante e avaliar a pureza proteica por 10% de policlamida página SDS. Em seguida, quantifique as proteínas concentradas usando o ensaio proteico de Bradford de acordo com os protocolos padrão e armazene a proteína por até uma semana a quatro graus Celsius. Para preparar os lipossomos, use seringas de vidro para transferir lipídios de estoque para um tubo de cultura de vidro limpo para alcançar uma mistura lipídica final de 1%fosfaticdylinositol-3-fosfato, 20% ergosterol, 30% fosfatidylserina, fosfatidylcholina como descrito na tabela.Dependendo dos solventes em que cada lipídio é resuspendido, a mistura pode ficar nublada após a adição de cada lipídio. Seque cuidadosamente as misturas lipídicas direcionando gás nitrogênio de baixo fluxo para as misturas em um movimento circular para tratar os lipídios uniformemente na parte inferior do tubo de vidro. Em seguida, enrole o tubo de cultura de vidro com papel alumínio deixando a abertura descoberta e desidratando ainda mais os lipídios no vácuo por uma hora.No final da incubação, adicione 400 microliters de tampão de ligação a cada frasco para reidratar completamente os lipídios em uma concentração lipossa final de 2,5 mililitros antes de reutilizar os lipídios em velocidade média em um vórtice à temperatura ambiente por 30 minutos. O tampão deve ficar nublado à medida que os lipídios são resuspended. Transfira os lipossomos resuspendados para um tubo de microcentrífuga e congele os tubos em nitrogênio líquido seguido de descongelamento em um banho de água de 37 graus Celsius sete a oito vezes.Em um capô de fumaça química, limpe duas seringas de vidro de um mililitro com um volume total de clorofórmio três vezes por seringa para remover quaisquer lipídios residuais e equilibrar cada seringa com dois volumes de água ultrauso e dois volumes de tampão de ligação. Monte um mini-extrusor de acordo com as recomendações do fabricante. Em seguida, submergir dois pedaços de suporte de filtro em uma membrana de 200 nanômetros em tampão de ligação.É importante montar o mini-extrusor para que ele seja completamente hermético. E uma boa maneira de verificar se há vazamentos é passar buffer através do dispositivo. Sanduiche a membrana entre os suportes do filtro e coloque a membrana no mini-extrusor.Usando uma das seringas de um mililitro equilibrado, passe um volume de tampão de ligação semelhante ao volume da mistura lipossorosa através do mini-extrusor e use a outra seringa para soltar a mistura lipossa invertendo o tubo de microcentrifuuge para coletar o último dos lipossomos na tampa do tubo para sua coleta. Em seguida, extrude os lipossomos através da membrana de 200 nanômetros 19 a 21 vezes e colete os lipossomos extrudados em um novo tubo de microcentrífuga. Antes de realizar os ensaios de ligação lipossomo SNX-BAR e ensaios de tubulação, pré-limpe a proteína purificada por ultracentrifugação e transfira o supernatante para um novo tubo de microcentrifuuagem sem perturbar a pelota.Em seguida, incubar quatro micromolar de SNX4-ATG20 purificados e 2,5 mililitros de lipossomos em um volume total de reação de 20 microliters para uma incubação de 30 minutos a 30 graus Celsius. Para visualizar e quantificar a tubulação lipossa, no final da incubação, localize imediatamente as amostras em uma grade de malha de cobre revestida de carbono e mancha negativa com acetato de 1%uranyl. Em seguida, analise as amostras em um microscópio eletrônico de transmissão a 200 kilovolts.Para ligação liposódica e sedimentação, transfira 20 microlitadores da reação para um tubo de centrífuga de policarbonato e gire a amostra com um roteador compatível em uma ultracentrifuagem. No final da centrifugação, transfira cuidadosamente o supernante para um novo tubo de microcentrifuuagem e resuspenda a pelota em 40 microliters de buffer de amostra de página SDS. Transfira a suspensão da pelota para um novo tubo de microcentrifuuagem e adicione 20 microliters de tampão de amostra ao supernascer.Em seguida, carregue volumes de amostras equivalentes de pelota e supernascer em um gel de página SDS de 10% de poliacrilamida e execute a coloração coomassie para visualizar os SNX-BARs ligados aos lipossomos. Para verificar se há indução adequada da expressão SNX-BAR, uma mancha ocidental contra a etiqueta de purificação de afinidade tandem pode ser usada, pois os níveis de proteína dos SNX-BARs podem não ser detectados através da mancha de Coomassie. Após a purificação do heterodimer SNX-BAR, as bandas dos dois SNX-BARs devem aparecer em uma relação estequiométrica de um para um e deve haver pouca ou nenhuma banda contaminante.Nesta análise representativa, os heterodimers SNX-BAR foram expressos, purificados e ligados a lipossomos sintéticos como demonstrado. Note que o MVP1 formou homodimers e foi expresso em bactérias como esperado. A ligação SNX-BAR a diferentes composições lipossas poderia ser quantificada por densitometria para avaliar os efeitos da fosfatidíserina, por exemplo, na ligação lipossosom.A imagem de microscopia eletrônica permite a medição de túbulos lipossois SNX4-ATG20 com a maioria dos túbulos tipicamente possuindo diâmetros entre 14 e 26 nanômetros. Observe que sNX-BARs purificados podem ser reconstituídos com complexos de captura de carga em lipossomos para entender como montagens completas podem influenciar a remodelação da membrana. Ao comparar a ligação de diferentes combinações de dimers SNX-BAR purificados com lipossomos sintéticos compostos por liposetos diferentes, as proteínas SNX-BAR foram encontradas possuindo preferências distintas de ligação lipídica.Sempre trabalhe em um capô ao manusear clorofórmio e certifique-se de usar o EPI adequado ao manusear afiadas ou material de vidro.

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetic Engineering of an Unconventional Yeast for Renewable Biofuel and Biochemical Production

Engenharia genética de um fermento Unconventional para Renewable Biofuel e Produção Biochemical

Yarrowia lipolytica is a non-pathogenic, dimorphic and strictly aerobic yeast species. Owing to its distinctive physiological features and metabolic ...

Genética

Analysis of Cap-binding Proteins in Human Cells Exposed to Physiological Oxygen Conditions

Análise de proteínas Cap-ligação em células humanas expostas a condições de oxigênio fisiológicos

Translational control is a focal point of gene regulation, especially during periods of cellular stress. Cap-dependent translation via the eIF4F complex ...

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

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Visadas<em&gt; In Situ</em&gt; mutagénese de histona Genes em brotamento Yeast

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting ...

Production and Purification of Baculovirus for Gene Therapy Application

Produção e purificação de Baculovirus para aplicação de terapia gênica

Baculovirus has traditionally been used for the production of recombinant protein and vaccine. However, more recently, baculovirus is emerging as a ...

Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere

Explorando o microbioma da raiz: extraindo dados da comunidade bacteriana do solo

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to ...

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization (smFISH) Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

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Única molécula fluorescência In Situ Hybridization (smFISH) análise em Budding fermento crescimento vegetativo e meiose

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect ...

Informatic Analysis of Sequence Data from Batch Yeast 2-Hybrid Screens

Análise informática de dados da sequência do lote levedura híbrida-2 telas

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Mating-based Overexpression Library Screening in Yeast

Rastreio de biblioteca superexpressão de acasalamento-baseado no fermento

Budding yeast has been widely used as a model in studying proteins associated with human diseases. Genome-wide genetic screening is a powerful tool ...

A Deep-sequencing-assisted, Spontaneous Suppressor Screen in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe

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Uma tela de supressor de Deep-sequenciamento-assistida, espontânea na fissão levedura Schizosaccharomyces pombe

A genetic screen for mutant alleles that suppress phenotypic defects caused by a mutation is a powerful approach to identify genes that belong to closely ...

Enhanced Yeast One-hybrid Screens To Identify Transcription Factor Binding To Human DNA Sequences

Telas de um híbrido levedura melhorada para identificar o fator de transcrição, vinculando a sequências de DNA humano

Identifying the sets of transcription factors (TFs) that regulate each human gene is a daunting task that requires integrating numerous experimental and ...