Name: expression, purification, and liposome binding of budding yeast snx-bar heterodimers
Uploaded: 2019-12-06T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Expression, Purification, and Liposome Binding of Budding Yeast SNX-BAR Heterodimers at JoVE.com

La investigación reportada en esta publicación fue apoyada por el Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales de los Institutos Nacionales de Salud bajo el número de premio GM060221 y en parte por el Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales de los Institutos Nacionales salud bajo el número de premio T32GM007223. R.C. fue apoyado en parte por el Programa de Becas de Investigación de la Facultad de la UNC-Charlotte.

1. Construcción de cepas de levadura
<ol><li>Comience con TVY614 (pep4 ::LEU2 prb1 ::hisG prc1 ::HIS3)11 como la cepa principal. Esta cepa es deficiente para las proteasas vacuolar, que contribuyen a la mayor parte de la degradación de las proteínas después de la lisis celular, y por lo tanto permite una purificación más limpia y eficiente.</li>
	<li>Diseñe imprimaciones12 e integre la etiqueta de purificación de afinidad en tándem (TAP...

<ol>
	<li>Teasdale, R. D., Collins, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+the+PX+(phox-homology)+domain+and+SNX+(sorting+nexin)+protein+families:+structures,+functions+and+roles+in+disease.">Insights into the PX (phox-homology) domain and SNX (sorting nexin) protein families: structures, functions and roles in disease.</a> The Biochemical Journal. 441 (1), 39-59 (2012).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Retromer+Complex+and+Sorting+Nexins+in+Neurodegenerative+Diseases.">The Retromer Complex and Sorting Nexins in Neurodegenerative Diseases.</a> Frontiers in Aging Neuroscience. 10, 79 (2018).</li><li>Burd, C., Cullen, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retromer:+a+master+conductor+of+endosome+sorting.">Retromer: a master conductor of endosome sorting.</a> Cold Spring Harbor perspectives in Biology. 6 (2), (2014).</li><li>Chi, R. J., Harrison, M. S., Burd, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogenesis+of+endosome-derived+transport+carriers.">Biogenesis of endosome-derived transport carriers.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 72 (18), 3441-3455 (2015).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endosomal+receptor+trafficking:+Retromer+and+beyond.">Endosomal receptor trafficking: Retromer and beyond.</a> Traffic (Copenhagen, Denmark). 19 (8), 578-590 (2018).</li><li>Ma, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+trafficking+by+yeast+Snx4+family+SNX-BAR+proteins+promotes+autophagy+and+vacuole+membrane+fusion.">Lipid trafficking by yeast Snx4 family SNX-BAR proteins promotes autophagy and vacuole membrane fusion.</a> Molecular Biology of the Cell. , (2018).</li><li>van Weering, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+for+SNX-BAR-mediated+assembly+of+distinct+endosomal+sorting+tubules.">Molecular basis for SNX-BAR-mediated assembly of distinct endosomal sorting tubules.</a> The EMBO Journal. 31 (23), 4466-4480 (2012).</li><li>Chi, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fission+of+SNX-BAR-coated+endosomal+retrograde+transport+carriers+is+promoted+by+the+dynamin-related+protein+Vps1.">Fission of SNX-BAR-coated endosomal retrograde transport carriers is promoted by the dynamin-related protein Vps1.</a> The Journal of Cell Biology. 204 (5), 793-806 (2014).</li><li>Purushothaman, L. K., Arlt, H., Kuhlee, A., Raunser, S., Ungermann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retromer-driven+membrane+tubulation+separates+endosomal+recycling+from+Rab7/Ypt7-dependent+fusion.">Retromer-driven membrane tubulation separates endosomal recycling from Rab7/Ypt7-dependent fusion.</a> Molecular Biology of the Cell. 28 (6), 783-791 (2017).</li><li>Purushothaman, L. K., Ungermann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cargo+induces+retromer-mediated+membrane+remodeling+on+membranes.">Cargo induces retromer-mediated membrane remodeling on membranes.</a> Molecular Biology of the Cell. 29 (22), 2709-2719 (2018).</li><li>Wurmser, A. E., Emr, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphoinositide+signaling+and+turnover:+PtdIns(3)P,+a+regulator+of+membrane+traffic,+is+transported+to+the+vacuole+and+degraded+by+a+process+that+requires+lumenal+vacuolar+hydrolase+activities.">Phosphoinositide signaling and turnover: PtdIns(3)P, a regulator of membrane traffic, is transported to the vacuole and degraded by a process that requires lumenal vacuolar hydrolase activities.</a> The EMBO journal. 17 (17), 4930-4942 (1998).</li><li>Puig, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tandem+affinity+purification+(TAP)+method:+a+general+procedure+of+protein+complex+purification.">The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification.</a> Methods. 24 (3), 218-229 (2001).</li><li>Kushnirov, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+reliable+protein+extraction+from+yeast.">Rapid and reliable protein extraction from yeast.</a> Yeast. 16 (9), 857-860 (2000).</li><li>Longtine, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Additional+modules+for+versatile+and+economical+PCR-based+gene+deletion+and+modification+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Additional modules for versatile and economical PCR-based gene deletion and modification in Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 14 (10), 953-961 (1998).</li><li>Tropea, J. E., Cherry, S., Waugh, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+purification+of+soluble+His(6)-tagged+TEV+protease.">Expression and purification of soluble His(6)-tagged TEV protease.</a> Methods in Molecular Biology. 498, 297-307 (2009).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphology+and+structure+of+lipoproteins+revealed+by+an+optimized+negative-staining+protocol+of+electron+microscopy.">Morphology and structure of lipoproteins revealed by an optimized negative-staining protocol of electron microscopy.</a> Journal of Lipid Research. 52 (1), 175-184 (2011).</li><li>Yong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+purification+of+the+SNX1/SNX6+complex.">Expression and purification of the SNX1/SNX6 complex.</a> Protein Expression and Purification. 151, 93-98 (2018).</li></ol>

Aquí, demostramos un flujo de trabajo optimizado para purificar dimers SNX-BAR en levadura y dos ensayos para evaluar sus propiedades biofísicas en liposomas sintéticos. La principal ventaja sobre la expresión típica de proteínas recombinantes en Escherichia coli u otros sistemas es la capacidad de expresar uniformemente proteínas SNX-BAR en un huésped nativo, evitando así los problemas de toxicidad e insolubilidad encontrados en la purificación de SNX-BARs en otros sistemas. También es notable que nu...

Los orgánulos ligados a la membrana como la membrana plasmática, el retículo endoplasmático, el aparato Golgi, el lisosoma (vacuole de levadura) y el endosoma comprenden el sistema endomembrana de la célula eucariota. La mayoría de los orgánulos tienen la capacidad de comunicarse e intercambiar material con otros orgánulos a través de portadores de transporte vesícula. No se entiende bien cómo la célula coordina el envasado y la formación de portadores de transporte de vesículas dentro del sistema de endomembrana. Sin embargo, se sabe que las proteínas y lípidos que constituyen gran parte del sistema de endomembrana se originan a partir de vesículas endoccíticas internalizadoras de la membrana plasmática (PM). El endosoma es el principal orgánulo aceptador para estas vesículas y se compone de múltiples conjuntos interconectados de orgánulos tubulares. La función principal del endosoma es facilitar la adquisición de nutrientes, regular la rotación de proteínas y lípidos, proteger de la infección de patógenos y servir como la principal fuente de reposición de lípidos para la membrana plasmática. Como el endosoma recibe la mayor parte de proteínas de carga y lípidos de la membrana plasmática, actúa como un compartimento de clasificación mediante el aíslamiento de cargas en los transportadores endosómicos tubulares (ETC). Cualquier proteína que no se secuestre en los ETCs se deja degradar a través del sistema endo-lisosomal. La desregulación de la clasificación de carga en ETCs puede conducir a la pérdida de la sutoma de nutrientes, rotación de proteínas o homeostasis lipídica, lo que resulta en numerosos trastornos metabólicos, de desarrollo y neurológicos1,2. Sin embargo, a pesar del papel central de los CTE en el endosoma, no se conoce el mecanismo subyacente de cómo el endosoma puede coordinar selectivamente el empaquetado de una multitud de cargas heterogéneas en portadores tubulares.
La familia de nexina de clasificación (SNX) es una clase evolutivamente conservada de proteínas que se han encontrado críticas para muchas reacciones de transporte vesícula en la celda3,4,5. Los nexinos de clasificación se reclutan para la membrana endosoma y ayudan en la captura de carga a través de su característico dominio de la homología phox (PX), que une el fosfatidilinositol-3-monofosfato (PtdIns(3)P), un lípido enriquecido en la membrana endosoma. Los mamíferos codifican treinta y tres proteínas SNX, que se pueden dividir en múltiples subfamilias, según la presencia de otros dominios1. Más notablemente, la subfamilia SNX-BAR es la subfamilia más grande que consta de doce en humanos, mientras que en levadura en ciernes, Saccharomyces cerevisiae, la subfamilia se reduce a sólo siete SNX-BARs. Las proteínas SNX-BAR tienen un dominio PX y un dominio Bin-Amphiphysin-Rvs (BAR) que activa los reservorios lipídis para unir curvaturas positivas. En consecuencia, la familia SNX-BAR tiene una afinidad natural por el endosoma y puede mediar la formación de ETC a través de sus capacidades de remodelación de membrana. In vitro, las propiedades de remodelación de sNX-BARs pueden ser inducidas por la adición de SNX-BARpurificados a liposomas sintéticos y la posterior formación de túbulos estrechos y recubiertos se puede visualizar mediante microscopía electrónica. Utilizando estos métodos, los investigadores han determinado que tanto la concentración de oligomerización como la fuerza de constricción parecen variar entre la familia SNX-BAR, lo que sugiere que podrían ayudar tanto en la formación como en la cissión de los CTE.
Los SNX-BARs se pueden clasificar aún más por sus propiedades exclusivas de dimerización. Los ensayos de unión in vitro y los estudios estructurales han demostrado que las proteínas SNX-BAR sólo pueden formar homodímeros o heterodímeros específicos. Por lo tanto, en principio, cada potencial dimer-oligomero SNX-BAR podría proporcionar una capa de túbulo para una vía de tráfico específica de carga y, del mismo modo, la oligomerización restringida de los otros protomeros SNX-BAR, también puede definir distintas vías de exportación. Sin embargo, debido al gran número de SNX-BARs y diversidad dentro de la familia SNX, una hipótesis de carga nexin-one de clasificación es altamente improbable. En su lugar, es más probable un esfuerzo coordinado utilizando una multitud de factores como SNX-BARs, carga, especificidad lipídica y otras dependencias. Asimismo, estudios recientes de la familia de levaduras SNX4 revelaron evidencia de especificidad lipídica adicional, más allá de PtdIns(3)P, para potenciar losportadoresde transporte endosoma6. En este estudio, el homodimer SNX-BAR Mvp1-Mvp1 fue purificado a partir de bacterias y heterodímeros nativos Snx4-Atg20 y Vps5-Vps17 fueron expresados y purificados en alto rendimiento de la levadura, mientras que sólo Snx4-Atg20 se encontró para unir preferentemente fosfatidilserina (PS) y formar estructuras estrechas tipo tubo en estudios de unión liposoma6. Mientras que otros en el campo han revelado importantes propiedades de los SNX-BARs utilizando homodímeros SNX-BAR purificados recombinantemente de bacterias, toxicidad asociada con la expresión de heterodímeros SNX-BAR en sistemas similares han obstaculizado su caracterización nativa7,8,9,10. Por lo tanto, sin un sistema confiable para obtener heterodímeros nativos expresados recombinantemente puros, los investigadores deben renunciar a estas líneas de investigación. En la Figura 1, presentamos un flujo de trabajo de cuatro partes para 1) construir una cepa de levadura sobreexpresando heterodímeros SNX-BAR para purificación de afinidad en tándem, 2) expresar y purificar heterodímeros nativos SNX-BAR, 3) preparar liposomas sintéticos unilamellares, y 4) establecer un ensayo de tubulación liposoma o sedimentaciones, proporcionando una herramienta vital para que los investigadores investiguen el creciente catálogo de nexinos de clasificación encontrados en la naturaleza.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 micrometer PC Membranes</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>610006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Poly-Prep Chromatography column (Bio-Rad)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>731-1550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27 Gauge needle</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>301629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra Centrifugal Filter with 10K cutoff</td>
			<td>Amicon</td>
			<td>UFC501024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avestin EmulsiFlex-C3 Homogenizer</td>
			<td>Avestin</td>
			<td>EF-C3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA assay</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman Optima MAX-XP Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>393315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4693116001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOPC</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>850375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOPS</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>840035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ergosterol (Sigma)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>47130-U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extruder Set with Block 0.2 microlter/1mL</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>610000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">FEI Tecnai F20 transmission electron microscope (200 kV)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass culture tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>47729-570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG sepharose beads (GE Healthcare)</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0969-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microlter glass syringes</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>7637-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New Brunswick Excella E25</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>M1353-0000</td>
			<td>or equivalent shaking 30 C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA Magnetic Agarose Beads</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>78605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima XE-90 Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A94516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M</td>
			<td>VWR</td>
			<td>52858-076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PI3P</td>
			<td>Echelon</td>
			<td>P-3016</td>
			<td>or Echelon equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate bottle assembly</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>355622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLA-100 Fixed-Angle Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>343840</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type 45 Ti Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Desiccator, Bottom and Lid with Socket Valve</td>
			<td>VWR</td>
			<td>75871-436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Pump Alcatel (Pascal 2005 C1)</td>
			<td>A&#38;J Vacuum</td>
			<td>PN07050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex with foam holder</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10153-838</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR KIT MICROTUBE</td>
			<td>VWR</td>
			<td>12620-880</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

expression, purification, and liposome binding of budding yeast snx-bar heterodimers

Las proteínas SNX-BAR son una clase evolutivamente conservada de proteínas de remodelación de membranas que desempeñan un papel clave en la clasificación y el tráfico de proteínas y lípidos durante la endotosis, la clasificación dentro del sistema endosomal y la autofagia. La función proteica central de SNX-BAR es la capacidad de formar homodímeros o heterodímeros que unen membranas utilizando dominios altamente conservados de phox-homología (PX) y BAR (Bin/Amphiphysin/Rvs). Además, el oligomerización de los dimers SNX-BAR en las membranas puede resultar en la formación de túbulos de membrana y vesículas y se cree que esta actividad refleja sus funciones como proteínas de capa para los portadores de transporte derivados del endosoma. Los investigadores han utilizado durante mucho tiempo estudios de unión in vitro utilizando proteínas SNX-BAR recombinantes en liposomas sintéticos o vesículas unilameláres gigantes (GUVs) para revelar la composición precisa de los lípidos necesarios para impulsar la remodelación de la membrana, revelando así su mecanismo de acción. Sin embargo, debido a los desafíos técnicos con los sistemas de doble expresión, la toxicidad de la expresión de proteínaSNX-BAR en bacterias y la baja solubilidad de las proteínas SNX-BAR individuales, la mayoría de los estudios realizados hasta la fecha han examinado los homodímeros SNX-BAR, incluidos los dimers no fisiológicos que se forman durante la expresión en bacterias. Recientemente, hemos optimizado un protocolo para superar las principales deficiencias de un sistema de expresión bacteriana típica. Usando este flujo de trabajo, demostramos cómo expresar y purificar con éxito grandes cantidades de heterodímeros SNX-BAR y cómo reconstituirlos en liposomas sintéticos para ensayos de unión y tublación.

Este protocolo describe un método para la producción reproducible y robusta de complejos endógenos de levadura SNX-BAR que se puede utilizar para ensayos de remodelación de membrana aguas abajo (Figura 1). La construcción de la cepa de levadura utilizada para la purificación aprovecha la eficiencia de la recombinación homóloga en levadura en ciernes, permitiendo modificaciones en los loci genómicos de los SNX-BARs específicos(Fi...

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Expression, Purification, and Liposome Binding of Budding Yeast SNX-BAR Heterodimers

Aquí, presentamos un flujo de trabajo para la expresión, purificación y unión liposoma de heterodímeros SNX-BAR en levadura.

Expresión, purificación y encuadernación liposoma de los heterodímeros SNX-BAR de levadura en ciernes

SNX-BAR proteins are an evolutionarily conserved class of membrane remodeling proteins that play key roles in sorting and trafficking of protein and ...

Los SNX-BAR son proteínas de remodelación de membranas que desempeñan un papel clave en las enfermedades humanas. Utilizando nuestros métodos, podemos determinar sus propiedades biofísicas precisas para facilitar la unión de lípidos y la remodelación de la membrana. La purificación de las proteínas SNB-BAR de las células de levadura permite la adquisición de dimers nativos homo y hetero SNX-BAR, minimizando al mismo tiempo la toxicidad y la insolubilidad que se encuentran con frecuencia con los sistemas de expresión no nativos.Nuestros métodos se pueden utilizar para comprender las especificidades lipídicas de todas las levaduras SNX-BAR o para producir proteínas SNX-BAR recombinantes de cualquier otro organismo. Un conjunto correcto del extrusor es esencial para prevenir la pérdida de liposomas durante el proceso de extrusión. Para los estudiantes principiantes o los nuevos en el campo, observar visualmente los pasos más críticos mejorará en gran medida sus posibilidades de éxito.Comience por inocular un gran hisopo de células de levadura en un matraz al menos cuatro veces el volumen del cultivo que contiene 50 mililitros de medio YP estándar complementado con 2%raffinosis y 0.1%glucosa como fuente de carbono y crecer el cultivo durante la noche en un shaker de 30 grados Celsius. A la mañana siguiente, inocular el preculero de 50 mililitros en un litro de medio YP estándar con 2% de rafinosa y 0,1% de glucosa en un matraz Fernbach desconfiado de volumen de 2,8 litros para un cultivo de cuatro a cinco horas en la incubadora de temblores. Cuando la densidad óptica a 600 nanómetros alcance 0,2, agregue gatactosa a una concentración final del 2% a las células para un cultivo nocturno en la incubadora de temblores.A la mañana siguiente, cosecha las células por centrifugación y transfiere el pellet de levadura a un tubo cónico de 50 mililitros. Resuspender el pellet en 15 mililitros de tampón de purificación para lograr un volumen final de unos 30 mililitros y cargar la suspensión celular en un homogeneizador refrigerado a cuatro grados centígrados. Lyse las muestras a 20 a 25,000 libras por pulgada cuadrada para dos a tres rondas y transferir el lysate en un nuevo tubo cónico de 50 mililitros sobre hielo.Limpie inmediatamente el izado celular por centrifugación y transfiera cuidadosamente el sobrenadante a un tubo nuevo. A continuación, equilibre 300 microlitros de cuentas de IgG Sepharose con tres re-suspensiones en tampón de purificación antes de agregar las perlas al izado celular despejado para una incubación de dos horas con rotación a cuatro grados Celsius. Al final de la incubación, agregue las cuentas a una columna de cromatografía de 10 mililitros y permita que el izado sin enlazar fluya a través.Lave las cuentas 10 veces con un mililitro de tampón de lavado por lavado, lo que permite que cada lavado fluya completamente antes de agregar el siguiente volumen. Después del último lavado, utilice una pipeta y un tampón fresco para transferir las perlas a un tubo de microcentrífuga. Llevar el volumen total de las cuentas a 500 microlitros con tampón de lavado fresco y eliminar las perlas del liso con dos microlitros de 10 miligramos por mililitro TEV proteasa para una incubación durante la noche con rotación a cuatro grados Celsius.A la mañana siguiente, utilice una aguja de calibre 27 para extraer completamente el sobrenadante y evaluar la pureza de la proteína en una página SDS de poliacrilamida 10%. A continuación, cuantifique las proteínas concentradas utilizando el ensayo de proteína Bradford de acuerdo con los protocolos estándar y almacene la proteína hasta una semana a cuatro grados centígrados. Para preparar los liposomas, utilice jeringas de vidrio para transferir lípidos en stock a un tubo de cultivo de vidrio limpio para lograr una mezcla final de lípidos de 1%fosfatidilinositol-3-fosfato, 20%ergosterol, 30%fosfatidilserina, fosfatidilcolina como se describe en la tabla.Dependiendo de los disolventes en los que se resuspende cada lípido, la mezcla puede volverse turbia al adición de cada lípido. Seque cuidadosamente las mezclas de lípidos dirigiendo el gas nitrógeno de bajo flujo a las mezclas en un movimiento circular para tratar los lípidos uniformemente en la parte inferior del tubo de vidrio. A continuación, envuelva el tubo de cultivo de vidrio con papel de aluminio dejando la abertura descubierta y deshidratar aún más los lípidos en un vacío durante una hora.Al final de la incubación, añadir 400 microlitros de tampón de unión a cada vial para rehidratar completamente los lípidos a una concentración liposoma final de 2,5 milimolares antes de resuspending los lípidos a velocidad media en un vórtice a temperatura ambiente durante 30 minutos. El búfer debe nublarse a medida que se resuspenden los lípidos. Transfiera los liposomas resuspendidos a un tubo de microcentrífuga y congele los tubos en nitrógeno líquido seguido de descongelación en un baño de agua Celsius de 37 grados de siete a ocho veces.En una campana de humo química, limpie dos jeringas de vidrio de un mililitro con un volumen completo de cloroformo tres veces por jeringa para eliminar los lípidos residuales y equilibre cada jeringa con dos volúmenes de agua ultrapura y dos volúmenes de tampón de unión. Montar un mini-extrusor de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. A continuación, sumerja dos piezas de soporte de filtro en una membrana de 200 nanómetros en el tampón de unión.Es importante montar el mini-extrusor para que sea completamente hermético. Y una buena manera de comprobar si hay fugas es pasar el búfer a través del dispositivo. Sandwichar la membrana entre los soportes del filtro y colocar la membrana en el mini-extrusor.Usando una de las jeringas equilibradas de un mililitro, pase un volumen de tampón de unión similar al volumen de la mezcla liposoma a través del mini-extrusor y utilice la otra jeringa para dejar caer la mezcla liposoma invirtiendo el tubo de microcentrífuga para recoger el último de los liposomas en la tapa del tubo para su recolección. A continuación, extruya los liposomas a través de la membrana de 200 nanómetros de 19 a 21 veces y recoja los liposomas extruidos en un nuevo tubo de microcentrífuga. Antes de realizar los ensayos de unión y tubulación de liposomas SNX-BAR, pre-limpiar la proteína purificada por ultracentrifugación y transferir el sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrífuga sin alterar el pellet.A continuación, incubar cuatro micromolares de SNX4-ATG20 purificados y 2,5 milivolares de liposomas en un volumen de reacción total de 20 microlitros para una incubación de 30 minutos a 30 grados centígrados. Para visualizar y cuantificar la tubulación liposoma, al final de la incubación, detecte inmediatamente las muestras en una rejilla de malla de cobre recubierta de carbono y la mancha negativa con 1%acetato de uranilo. A continuación, analice las muestras en un microscopio electrónico de transmisión a 200 kilovoltas.Para la unión y sedimentación de liposomas, transfiera 20 microlitros de la reacción a un tubo centrífugo de policarbonato y gire la muestra con un router compatible en una ultracentrífuga. Al final de la centrifugación, transfiera cuidadosamente el sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrífuga y resusppend el pellet en 40 microlitros del tampón de muestra de página SDS. Transfiera la suspensión de pellets a un nuevo tubo de microcentrífuga y añada 20 microlitros de tampón de muestra al sobrenadante.A continuación, cargue volúmenes de muestra equivalentes de pellets y sobrenadantes en un gel de página SDS de 10% poliacrilamida y realice la tinción de Coomassie para visualizar los SNX-BAR unidos a los liposomas. Para comprobar la inducción adecuada de la expresión SNX-BAR, se puede utilizar una mancha occidental contra la etiqueta de purificación de afinidad en tándem, ya que los niveles de proteína de los SNX-BAR pueden no ser detectados a través de la mancha de Coomassie. Después de la purificación del heterodista SNX-BAR, las bandas de los dos SNX-BAR deben aparecer en una relación estequiométrica uno a uno y debe haber poca o ninguna banda contaminante.En este análisis representativo, los heterodémeros SNX-BAR fueron expresados, purificados y unidos a liposomas sintéticos como se demostró. Tenga en cuenta que MVP1 formó homodómeros y se expresó en bacterias como se esperaba. La unión SNX-BAR a diferentes composiciones de liposomas podría cuantificarse por densitometría para evaluar los efectos de la fosfatidilserina, por ejemplo, en la unión de liposomas.La microscopía electrónica permite la medición de los túbulos liposomas SNX4-ATG20 con la mayoría de los túbulos que normalmente poseen diámetros entre 14 y 26 nanómetros. Tenga en cuenta que los SNX-VAR purificados se pueden reconstituir con complejos de captura de carga en liposomas para entender cómo los ensamblajes completos pueden influir en la remodelación de la membrana. Al comparar la unión de diferentes combinaciones de dimers SNX-BAR purificados con liposomas sintéticos compuestos de diferentes lípidos, se encontró que las proteínas SNX-BAR poseen preferencias de unión a lípidos distintas.Trabaje siempre en una capucha cuando manipule cloroformo y asegúrese de usar el EPP adecuado cuando manipule objetos punzantes o materiales de vidrio.

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetic Engineering of an Unconventional Yeast for Renewable Biofuel and Biochemical Production

Ingeniería genética de un levaduras no convencionales para biocombustible renovable y producción bioquímica

Yarrowia lipolytica is a non-pathogenic, dimorphic and strictly aerobic yeast species. Owing to its distinctive physiological features and metabolic ...

Investigación

Genética

Analysis of Cap-binding Proteins in Human Cells Exposed to Physiological Oxygen Conditions

Análisis de proteínas Cap-unión en células humanas expuestas a condiciones de oxígeno fisiológicas

Translational control is a focal point of gene regulation, especially during periods of cellular stress. Cap-dependent translation via the eIF4F complex ...

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

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Targeted<em&gt; In situ</em&gt; mutagénesis de histona genes en la levadura en ciernes

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting ...

Production and Purification of Baculovirus for Gene Therapy Application

Producción y purificación de Baculovirus para la aplicación de la terapia génica

Baculovirus has traditionally been used for the production of recombinant protein and vaccine. However, more recently, baculovirus is emerging as a ...

Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere

Explorar el microbioma de la raíz: extracción de datos de la comunidad bacteriana del suelo, rizosfera y raíz Endosphere

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to ...

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization (smFISH) Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

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Sola molécula fluorescencia In Situ hibridación (smFISH) análisis de florecimiento levadura crecimiento vegetativo y la Meiosis

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Mating-based Overexpression Library Screening in Yeast

Proyección de biblioteca sobreexpresión basado en apareamiento en levaduras

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A Deep-sequencing-assisted, Spontaneous Suppressor Screen in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe

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Una pantalla de supresor asistida por secuenciación profunda, espontánea en la levadura de fisión Schizosaccharomyces pombe

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