Name: expression, purification, and liposome binding of budding yeast snx-bar heterodimers
Uploaded: 2019-12-06T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Expression, Purification, and Liposome Binding of Budding Yeast SNX-BAR Heterodimers at JoVE.com

Bu yayında bildirilen araştırma, GM060221 ödül numarası altında Ulusal Sağlık Enstitüleri Genel Tıp Bilimleri Enstitüsü ve kısmen Ulusal Enstitüler Genel Tıp Bilimleri Enstitüsü tarafından desteklenmiştir. t32GM007223 ödül numarası altında Sağlık. R.C. kısmen UNC-Charlotte Fakültesi Araştırma Hibe Programı tarafından desteklendi.

1. Maya Zorlanma İnşaat
<ol><li>TVY614 ile başlayın (pep4Δ::LEU2 prb1Δ::hisG prc1Δ::HIS3)11 ebeveyn zorlanma olarak. Bu suş, hücre lisisi sonrası protein yıkımının çoğunluğuna katkıda bulunan ve bu nedenle daha temiz ve daha verimli bir arınma sağlayan vakuolar proteazlar için eksiktir.</li>
	<li>Homolog rekombinasyon kullanarak Atg20 'nin (SNX-BAR ORF 1) C terminusuna tandem afinite saflaştırma (TAP) etiketini tasarlave e...

<ol>
	<li>Teasdale, R. D., Collins, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+the+PX+(phox-homology)+domain+and+SNX+(sorting+nexin)+protein+families:+structures,+functions+and+roles+in+disease.">Insights into the PX (phox-homology) domain and SNX (sorting nexin) protein families: structures, functions and roles in disease.</a> The Biochemical Journal. 441 (1), 39-59 (2012).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Retromer+Complex+and+Sorting+Nexins+in+Neurodegenerative+Diseases.">The Retromer Complex and Sorting Nexins in Neurodegenerative Diseases.</a> Frontiers in Aging Neuroscience. 10, 79 (2018).</li><li>Burd, C., Cullen, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retromer:+a+master+conductor+of+endosome+sorting.">Retromer: a master conductor of endosome sorting.</a> Cold Spring Harbor perspectives in Biology. 6 (2), (2014).</li><li>Chi, R. J., Harrison, M. S., Burd, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogenesis+of+endosome-derived+transport+carriers.">Biogenesis of endosome-derived transport carriers.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 72 (18), 3441-3455 (2015).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endosomal+receptor+trafficking:+Retromer+and+beyond.">Endosomal receptor trafficking: Retromer and beyond.</a> Traffic (Copenhagen, Denmark). 19 (8), 578-590 (2018).</li><li>Ma, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+trafficking+by+yeast+Snx4+family+SNX-BAR+proteins+promotes+autophagy+and+vacuole+membrane+fusion.">Lipid trafficking by yeast Snx4 family SNX-BAR proteins promotes autophagy and vacuole membrane fusion.</a> Molecular Biology of the Cell. , (2018).</li><li>van Weering, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+for+SNX-BAR-mediated+assembly+of+distinct+endosomal+sorting+tubules.">Molecular basis for SNX-BAR-mediated assembly of distinct endosomal sorting tubules.</a> The EMBO Journal. 31 (23), 4466-4480 (2012).</li><li>Chi, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fission+of+SNX-BAR-coated+endosomal+retrograde+transport+carriers+is+promoted+by+the+dynamin-related+protein+Vps1.">Fission of SNX-BAR-coated endosomal retrograde transport carriers is promoted by the dynamin-related protein Vps1.</a> The Journal of Cell Biology. 204 (5), 793-806 (2014).</li><li>Purushothaman, L. K., Arlt, H., Kuhlee, A., Raunser, S., Ungermann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retromer-driven+membrane+tubulation+separates+endosomal+recycling+from+Rab7/Ypt7-dependent+fusion.">Retromer-driven membrane tubulation separates endosomal recycling from Rab7/Ypt7-dependent fusion.</a> Molecular Biology of the Cell. 28 (6), 783-791 (2017).</li><li>Purushothaman, L. K., Ungermann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cargo+induces+retromer-mediated+membrane+remodeling+on+membranes.">Cargo induces retromer-mediated membrane remodeling on membranes.</a> Molecular Biology of the Cell. 29 (22), 2709-2719 (2018).</li><li>Wurmser, A. E., Emr, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphoinositide+signaling+and+turnover:+PtdIns(3)P,+a+regulator+of+membrane+traffic,+is+transported+to+the+vacuole+and+degraded+by+a+process+that+requires+lumenal+vacuolar+hydrolase+activities.">Phosphoinositide signaling and turnover: PtdIns(3)P, a regulator of membrane traffic, is transported to the vacuole and degraded by a process that requires lumenal vacuolar hydrolase activities.</a> The EMBO journal. 17 (17), 4930-4942 (1998).</li><li>Puig, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tandem+affinity+purification+(TAP)+method:+a+general+procedure+of+protein+complex+purification.">The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification.</a> Methods. 24 (3), 218-229 (2001).</li><li>Kushnirov, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+reliable+protein+extraction+from+yeast.">Rapid and reliable protein extraction from yeast.</a> Yeast. 16 (9), 857-860 (2000).</li><li>Longtine, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Additional+modules+for+versatile+and+economical+PCR-based+gene+deletion+and+modification+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Additional modules for versatile and economical PCR-based gene deletion and modification in Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 14 (10), 953-961 (1998).</li><li>Tropea, J. E., Cherry, S., Waugh, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+purification+of+soluble+His(6)-tagged+TEV+protease.">Expression and purification of soluble His(6)-tagged TEV protease.</a> Methods in Molecular Biology. 498, 297-307 (2009).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphology+and+structure+of+lipoproteins+revealed+by+an+optimized+negative-staining+protocol+of+electron+microscopy.">Morphology and structure of lipoproteins revealed by an optimized negative-staining protocol of electron microscopy.</a> Journal of Lipid Research. 52 (1), 175-184 (2011).</li><li>Yong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+purification+of+the+SNX1/SNX6+complex.">Expression and purification of the SNX1/SNX6 complex.</a> Protein Expression and Purification. 151, 93-98 (2018).</li></ol>

Burada, mayada SNX-BAR dimerlerini arındırmak için optimize edilmiş bir iş akışı ve sentetik lipozomlar üzerindeki biyofiziksel özelliklerini değerlendirmek için iki deneme gösteriyoruz. Escherichia coli veya diğer sistemlerde tipik rekombinant protein ekspresyonuna göre en büyük avantaj, SNX-BAR proteinlerini yerli bir konakta eşit olarak ifade edebilme, böylece diğer sistemlerde SNX-BAR'ların arındırılmasında bulunan toksisite ve çözünmezlik sorunlarından kaçınabilme yeteneğidir...

Plazma zarı, endoplazmik retikulum, Golgi aparatı, lizom (maya vakuol) ve endoskopi gibi membrana bağlı organeller ökaryotik hücrenin endomembran sistemini oluşturur. Çoğu organel vezikül taşıyıcıları aracılığıyla diğer organeller ile iletişim ve malzeme alışverişi yeteneğine sahiptir. Hücrenin endoskopi sistemi içinde vezikül taşıyıcılarının ambalajını ve oluşumunu nasıl koordine ettiginin tam olarak anlaşılamamıştır. Ancak, endoskopi sisteminin büyük bir kısmını oluşturan protein ve lipidlerin plazma zarından (PM) endositik veziküllerin içselleştirilmesinden kaynaklandığı bilinmektedir. Endozos bu veziküller için birincil kabul organıdır ve birden fazla birbiriyle bağlantılı tübüler organel kümesinden oluşur. Endozobonun temel işlevi besin alımını kolaylaştırmak, protein ve lipid cirosunu düzenlemek, patojen enfeksiyonundan korunmak ve plazma zarı için birincil yağ ikmal kaynağı olarak hizmet vermektir. Endozos, plazma zarından kargo proteinlerinin ve lipidlerin büyük bir kısmını aldığından, kargoları borulu endozomal taşıma taşıyıcılarına (ETC) izole ederek bir ayırma bölmesi görevi görür. ETC'lere ayrılmayan proteinler endo-lysozomal sistem ile bozulmaya bırakılır. ETCs içine kargo sıralama disregülasyonu besin alımı, protein ciro veya lipid homeostaz kaybına yol açabilir, çok sayıda metabolik sonuçlanan, gelişimsel, ve nörolojik bozukluklar1,2. Ancak, endozomda ETC'lerin merkezi rolüne rağmen, endozosun borutaşıyıcılarına çok sayıda heterojen kargonun ambalajını seçici olarak nasıl koordine edebileceği ne kadar temel mekanizma bilinmemektedir.
Sıralama nexin (SNX) ailesi hücre de birçok vezikül taşıma reaksiyonları için kritik olduğu tespit edilmiştir proteinlerin evrimsel olarak korunmuşsınıftır 3,4,5. Sıralama neksinler endozom membran ve endozom membran üzerinde zenginleştirilmiş bir lipid fosfatidillinositol-3-monofosfat (PtdIns(3)P) bağlar karakteristik phox homoloji (PX) etki alanı ile kargo yakalama yardım işe alınır. Memeliler otuz üç SNX proteini kodlarlar, diğer etki alanlarının varlığına göre daha fazla alt familyaya ayrılabilir1. En önemlisi, SNX-BAR alt familyası insan on iki oluşan en büyük alt familye, tomurcuklanan maya ise, Saccharomyces cerevisiae, alt familya sadece yedi SNX-BAR azalır. SNX-BAR proteinleri hem PX etki alanına hem de pozitif eğrilik zarlarını bağlamak için lipid rezervuarlarını tetikleyen Bin-Amphiphysin-Rvs (BAR) etki alanına sahiptir. Sonuç olarak, SNX-BAR ailesi endoskopiye doğal bir yakınlık sağlar ve membran remodeling yetenekleri aracılığıyla ETC oluşumuna aracılık edebilir. In vitro, SNX-BAR'ların yeniden şekillendirme özellikleri sentetik lipozomlara saflaştırılmış SNX-BAR eklenmesi yle indüklenebilir ve daha sonra dar, kaplanmış tübüllerin oluşumu elektron mikroskobu ile görselleştirilebilir. Bu yöntemleri kullanarak, araştırmacılar hem oligomerizasyon konsantrasyonu ve daralma gücü SNX-BAR ailesi arasında etcs oluşumu ve makası hem de yardımcı olabileceğini düşündüren arasında farklılık gösterdiğini belirledik.
SNX-BAR'lar özel dimerizasyon özelliklerine göre sınıflandırılabilir. İn vitro bağlayıcı tahliller ve yapısal çalışmalar SNX-BAR proteinlerinin sadece spesifik homodimer veya heterodimer ler oluşturabilenleri göstermiştir. Bu nedenle, prensip te, her potansiyel SNX-BAR dimer-oligomer bir kargo özgü kaçakçılık yolu için bir tübül kat sağlayabilir ve aynı şekilde, diğer SNX-BAR protomerlerin sınırlı oligomerizasyon, aynı zamanda farklı ihracat yolları tanımlayabilirsiniz. Ancak, SNX ailesi içinde SNX-R'lerin ve çeşitliliğin çok sayıda olması nedeniyle, bir sıralama nexin-one kargo hipotezi son derece düşüktür. Bunun yerine SNX-R'ler, kargo, lipid özgüllüğü ve diğer bağımlılıklar gibi çok sayıda faktör kullanılarak koordineli bir çaba daha olasıdır. Aynı şekilde, maya SNX4 ailesinin son çalışmalar ek lipid özgüllüğü için kanıt ortaya, PtdIns ötesinde(3)P, endozom taşıma taşıyıcıları güçlendirmek için6. Bu çalışmada, SNX-BAR homodimer Mvp1-Mvp1 bakteri ve yerli heterodimers Snx4-Atg20 ve Vps5-Vps17 ifade edildi ve maya yüksek verim saflaştırılmış, sadece Snx4-Atg20 tercihen fosfatidilserine bağlamak bulundu (PS) ve lipozom ciltleme çalışmalarında dar tüp benzeri yapılar formu6. Alanında diğerleri bakterilerden rekombinantlı Saflaştırılmış SNX-BAR homodimers kullanarak SNX-BAR önemli özelliklerini ortaya çıkarmış olsa da, benzer sistemlerde SNX-BAR heterodimers ifade ile ilişkili toksisite kendi yerli karakterizasyonuengelvar7 ,8,9,10. Bu nedenle, saf rekombinantly ifade yerli heterodimers elde etmek için güvenilir bir sistem olmadan, araştırmacılar araştırma bu satırları telafi etmelidir. Şekil1'de, dört parçalı bir iş akışı satıyoruz 1) tandem afinite arınması için SNX-BAR heterodimerlerini aşırı ifade eden bir maya zorlanması oluşturmak, 2) ekspres ve yerli SNX-BAR heterodimers arındırmak, 3) unilamellar sentetik lipozomlar hazırlamak, ve 4) doğada bulunan sıralama nexins büyüyen katalog araştırmak için araştırmacılar için hayati bir araç sağlayan, bir lipozom tubulation veya sedimantasyon lar teşbik kurmak.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 micrometer PC Membranes</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>610006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Poly-Prep Chromatography column (Bio-Rad)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>731-1550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27 Gauge needle</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>301629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra Centrifugal Filter with 10K cutoff</td>
			<td>Amicon</td>
			<td>UFC501024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avestin EmulsiFlex-C3 Homogenizer</td>
			<td>Avestin</td>
			<td>EF-C3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA assay</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman Optima MAX-XP Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>393315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4693116001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOPC</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>850375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOPS</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>840035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ergosterol (Sigma)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>47130-U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extruder Set with Block 0.2 microlter/1mL</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>610000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">FEI Tecnai F20 transmission electron microscope (200 kV)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass culture tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>47729-570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG sepharose beads (GE Healthcare)</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0969-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microlter glass syringes</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>7637-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New Brunswick Excella E25</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>M1353-0000</td>
			<td>or equivalent shaking 30 C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA Magnetic Agarose Beads</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>78605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima XE-90 Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A94516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M</td>
			<td>VWR</td>
			<td>52858-076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PI3P</td>
			<td>Echelon</td>
			<td>P-3016</td>
			<td>or Echelon equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate bottle assembly</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>355622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLA-100 Fixed-Angle Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>343840</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type 45 Ti Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Desiccator, Bottom and Lid with Socket Valve</td>
			<td>VWR</td>
			<td>75871-436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Pump Alcatel (Pascal 2005 C1)</td>
			<td>A&#38;J Vacuum</td>
			<td>PN07050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex with foam holder</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10153-838</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR KIT MICROTUBE</td>
			<td>VWR</td>
			<td>12620-880</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

expression, purification, and liposome binding of budding yeast snx-bar heterodimers

SNX-BAR proteinleri, endositon sırasında protein ve lipidlerin ayıklanmasında, endozomal sistem içinde ayrıştırma ve otofajide önemli rol oynayan, evrimsel olarak korunmuş membran remodeling proteinleri sınıfıdır. SNX-BAR protein fonksiyonunun merkezinde, yüksek oranda korunmuş foks-homoloji (PX) ve BAR (Bin/Amphiphysin/Rvs) etki alanlarını kullanarak membranları bağlayan homodimer veya heterodimer ler oluşturabilme yeteneği dir. Buna ek olarak, membranlar üzerinde SNX-BAR dimerlerin oliomerizasyonu membran tübülve veziküloluşumunu ortaya çıkarır ve bu aktivitenin endozom kaynaklı taşıyıcılar için kat proteinleri olarak işlevlerini yansıttığı düşünülmektedir. Araştırmacılar uzun sentetik lipozomlar veya dev unilamellar veziküller üzerinde rekombinant SNX-BAR proteinleri kullanarak in vitro bağlama çalışmaları yararlanarak (GUVs) membran remodeling sürücü için gerekli lipidlerin hassas makyaj ortaya çıkarmak için, böylece eylem mekanizması ortaya. Ancak, çift ifade sistemleri ile teknik zorluklar nedeniyle, bakterilerde SNX-BAR protein ekspresyonu toksisitesi, ve bireysel SNX-BAR proteinlerin kötü çözünürlük, bugüne kadar çoğu çalışma snx-BAR homodimers inceledik, bakterilerde ifade sırasında form fizyolojik olmayan dimers dahil. Son zamanlarda, tipik bir bakteriyel ekspresyon sisteminin büyük eksikliklerini aşmak için bir protokol optimize ettik. Bu iş akışını kullanarak, büyük miktarda SNX-BAR heterodimerinin nasıl başarılı bir şekilde ifade edilip arındırılacağı ve bağlama ve tükentme tahlilleri için sentetik lipozomlarda nasıl yeniden oluşturulabileceğimizi gösteriyoruz.

Bu protokol, alt akım membran remodeling tahlilleri için kullanılabilecek endojen maya SNX-BAR komplekslerinin tekrarlanabilir ve sağlam üretimi için bir yöntem tanımlamaktadır (Şekil 1). Arınma için kullanılan maya suşunun yapımı, tomurcuklanan mayada homolog rekombinasyon verimliliğinden yararlanarak hedeflenen SNX-BAR'ların genomik locisinde değişiklikleryapılmasını sağlar(Şekil 2). Bu tasarımın iki ...

Watch this Scientific Journal Video about Expression, Purification, and Liposome Binding of Budding Yeast SNX-BAR Heterodimers at JoVE.com

Expression, Purification, and Liposome Binding of Budding Yeast SNX-BAR Heterodimers

Burada, mayada SNX-BAR heterodimerlerinin ifade, saflaştırma ve lipozom bağlanması için bir iş akışı salıyoruz.

Tomurcuklanan Maya SNX-BAR Heterodimers İfade, Arınma ve Lipozom Bağlayıcı

SNX-BAR proteins are an evolutionarily conserved class of membrane remodeling proteins that play key roles in sorting and trafficking of protein and ...

SNX-BAR'lar insan hastalığında kilit rol oynayan membran remodeling proteinleridir. Yöntemlerimizi kullanarak, lipid bağlanmasını ve membran remodeling kolaylaştırmak için onların kesin biyofiziksel özelliklerini belirleyebilirsiniz. SNB-BAR proteinlerinin maya hücrelerinden arındırılması, yerli homo ve hetero SNX-BAR dimerlerinin elde edilmesine olanak sağlarken, yerli olmayan ifade sistemlerinde sıkça karşılaşılan toksisiteyi ve çözünmezliği en aza indirir.Yöntemlerimiz tüm maya SNX-BAR'ların lipid özgüllüklerini anlamak veya başka bir organizmadan rekombinant SNX-BAR proteinleri üretmek için kullanılabilir. Ekstrüzyon işlemi sırasında lipozom kaybını önlemek için doğru bir ekstrüder montajı esastır. Başlangıç öğrencileri veya alana yeni başlayanlar için, en kritik adımları görsel olarak gözlemlemek başarı şansınızı büyük ölçüde artıracaktır.Bir şişe içine maya hücrelerinin büyük bir bez aşılama ile başlayın standart YP orta 50 mililitre içeren kültürün hacmi en az dört kez bir karbon kaynağı olarak% 2 raffinose ve% 0.1 glikoz ile takviye ve 30 derece santigrat shaker bir gecede kültür büyümek. Ertesi sabah, standart YP orta bir litre 50 mililitre ön kültür aşılamak 2%raffinose ve% 0.1 glikoz bir 2.8 litre hacmi sallayarak inkübatör dört ila beş saatlik bir kültür için Fernbach şişesi şaşırttı. 600 nanometredeki optik yoğunluk 0.2'ye ulaştığında, sallanan kuluçka makinesinde bir gecede kültür için hücrelere %2'lik son konsantrasyona galaktoz ekleyin.Ertesi sabah, santrifüj ile hasat hücreleri ve 50 mililitrekonik tüp içine maya pelet aktarın. Yaklaşık 30 mililitrelik son bir hacim elde etmek ve hücre süspansiyonu dört dereceye kadar soğutulmuş bir homogenizer yüklemek için 15 mililitre saflaştırma tamponundaki peleti yeniden askıya alın. Örnekleri 20-25,000 pound kare inç başına 2-3 mermi ve buz üzerinde yeni bir 50 mililitre konik tüp içine lysate aktarın lyse.Hemen santrifüj ile hücre lysate temizleyin ve dikkatle yeni bir tüp içine supernatant aktarın. Daha sonra, igG Sepharose boncuk300 mikrolitre saflaştırma tampon üç yeniden süspansiyonlar ile dengeleyin dört derece santigrat dönen iki saatlik kuluçka için temizlenmiş hücre lysate boncuk eklemeden önce. Kuluçka sonunda, boncukları 10 mililitrelik kromatografi sütununa ekleyin ve bağlı olmayan lysate'nin akmasını bekleyin.Boncukları yıkama başına bir mililitre yıkama tamponuyla 10 kez yıkayın ve bir sonraki hacmi eklemeden önce her yıkamanın tamamen akmasını bekleyin. Son yıkamadan sonra, bir mikrosantrifüj tüp içine boncuk aktarmak için bir pipet ve taze tampon kullanın. Boncukların toplam hacmini taze yıkama tamponuyla 500 mikrolitreye getirin ve boncukları mililitre başına 10 miligramlık iki mikrolitre tev protaz ile lysattan çıkarın.Ertesi sabah, supernatant tamamen kaldırmak ve% 10 poliakrilamid SDS sayfası ile protein saflığını değerlendirmek için bir 27 gauge iğne kullanın. Daha sonra bradford protein testini kullanarak konsantre proteinleri standart protokollere göre ölçün ve proteini bir haftaya kadar dört santigrat derecede saklayın. Lipozomları hazırlamak için, tabloda belirtildiği gibi % 1 fosfatitiklinositol-3-fosfat, %20 ergosterol, %30 fosfatidilserin, fosfatidilkolin karışımını elde etmek için stok lipitleri temiz bir cam kültür tüpüne aktarmak için cam şırıngalar kullanın.Çözücülere bağlı olarak her bir lipid yeniden askıda kalır, karışım her lipidin eklenmesi yle bulutlu olabilir. Cam tüpün altındaki lipitleri eşit şekilde tedavi etmek için düşük akışlı azot gazını dairesel bir hareketle karışımlara yönlendirerek lipid karışımlarını dikkatlice kurutun. Daha sonra cam kültür tüpünü folyo ile sarın ve bir saat boyunca bir vakumda lipitleri daha da susuz bırakın.Kuluçka sonunda, 30 dakika boyunca oda sıcaklığında bir girdap üzerinde orta hızda lipidler resuspend önce tamamen 2.5 milipozlar son lipozom konsantrasyonunda lipidler rehydrate için her şişe için bağlayıcı tampon 400 mikrolitre ekleyin. Lipidler yeniden askıya alındıkça tampon bulutlu hale gelmelidir. Bir mikrosantrifüj tüpü ne resuspended lipozomlar aktarın ve sıvı nitrojen tüpleri dondurma kardından 37 derece santigrat su banyosunda 7-8 kez çözülme.Kimyasal bir duman kaputunda, şırınga başına üç kez kloroform tam hacimli iki mililitrelik cam şırınga temizleyin ve her şırıngaultrasaf su iki cilt ve bağlayıcı tampon iki hacim ile her şırınga dengeleyin. Üreticinin tavsiyelerine göre bir mini ekstrüder monte edin. Daha sonra iki adet filtre desteğini bir 200 nanometre lik membrana bağlama tamponunda batırın.Mini ekstrüzyonu tamamen hava geçirmez olacak şekilde monte etmek önemlidir. Sızıntıları kontrol etmenin iyi bir yolu da arabelleği cihazdan geçirmektir. Filtre destekler için membran sandviç ve mini ekstrüder içine membran yerleştirin.Bir mililitre şırınga denk bir kullanarak, mini ekstrüder aracılığıyla lipozom karışımıhacmine benzer bağlayıcı tampon hacmi geçmek ve mikrocentrifuge tüp ters lipozom karışımı damla diğer şırınga kullanarak kendi toplama için tüp kapağı içine lipozomların son toplamak için. Sonra 200 nanometre membran 19 ila 21 kez ile lipozomlar ekstrüzyon ve yeni bir mikrosantrifüj tüp içine ekstrüzyon lipozomları toplamak. SNX-BAR lipozom bağlama ve tubulation tahlillerini yapmadan önce, saflaştırılmış proteini ultrasantrifüj ile önceden temizleyin ve süpernatant'ı peleti bozmadan yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.Daha sonra, saflaştırılmış SNX4-ATG20 dört mikromolar ve 30 santigrat derece 30 dakikalık kuluçka için 20 mikrolitre toplam reaksiyon hacmi lipozomlar 2.5 milipozlar kuluçka. Lipozom tubulation görselleştirmek ve ölçmek için, kuluçka sonunda, hemen bir karbon kaplı bakır örgü ızgara ve negatif leke üzerine% 1 uranyl asetat ile örnekleri nokta. Sonra 200 kilovolt bir iletim elektron mikroskobu üzerinde örnekleri analiz edin.Lipozom bağlanması ve sedimantasyon için, reaksiyonun 20 mikrolitresini polikarbonat santrifüj tüpüne aktarın ve numuneyi ultra santrifüjde uyumlu bir yönlendirici ile döndürün. Santrifüj sonunda, dikkatle yeni bir mikrosantrifüj tüp supernatant aktarın ve SDS sayfa örnek tampon 40 mikrolitre pelet resuspend. Pelet süspansiyonu yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve supernatant'a 20 mikrolitre numune tamponu ekleyin.Daha sonra %10 poliakrilamid SDS sayfa jeline eşdeğer numune hacimleri yükleyin ve lipozomlara bağlı SNX-BAR'ları görselleştirmek için Coomassie boyama yapın. SNX-BAR ekspresyonunun doğru indüksiyonu olup olmadığını kontrol etmek için, SNX-RER'lerin protein düzeyleri Coomassie lekesi ile tespit edilemeyebileceğinden, tandem afinite saflaştırma etiketine karşı batıda bir leke kullanılabilir. SNX-BAR heterodimer arındırılmasından sonra, iki SNX-BAR bantları bire bir stokiyometrik oranda görünmeli ve hiçbir kirletici bantları çok az olmalıdır.Bu temsili analizde, SNX-BAR heterodimerleri ifade edildi, saflaştırılmış ve sentetik lipozomlara bağlı olarak gösterilmiştir. MVP1 homodimers oluşan ve beklendiği gibi bakteri ifade edildi unutmayın. SNX-BAR değişen lipozom bileşimlerine bağlanma, örneğin fosfatidilserinin lipozom bağlama üzerindeki etkilerini değerlendirmek için densitometri ile ölçülebilir.Elektron mikroskobu görüntülemesi, genellikle 14 ila 26 nanometre arasında çapa sahip olan çoğu tübülile snx4-ATG20 lipozom tübüllerinin ölçülmesine olanak sağlar. Saflaştırılmış SNX-BAR'ların, tam montajların membran remodeling'i nasıl etkileyebileceğini anlamak için lipozomlarda kargo yakalama kompleksleri ile yeniden oluşturulabileceğini unutmayın. Saflaştırılmış SNX-BAR dimerlerinin farklı kombinasyonlarının farklı lipidlerden oluşan sentetik lipozomlarla bağlanması karşılaştırılırken, SNX-BAR proteinlerinin farklı lipid bağlama tercihlerine sahip olduğu saptandı.Kloroform kullanırken her zaman bir başlıkta çalışın ve keskin liği veya cam malzemeyi kullanırken uygun PPE'yi taktığından emin olun.

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetic Engineering of an Unconventional Yeast for Renewable Biofuel and Biochemical Production

Yenilenebilir Biyoyakıt ve Biyokimyasal Üretim için bir Sıradışı Maya Genetik Mühendisliği

Yarrowia lipolytica is a non-pathogenic, dimorphic and strictly aerobic yeast species. Owing to its distinctive physiological features and metabolic ...

Analysis of Cap-binding Proteins in Human Cells Exposed to Physiological Oxygen Conditions

Fizyolojik Oksijen Koşullarına Maruz İnsan hücrelerinde Cap-bağlayıcı proteinlerin analizi

Translational control is a focal point of gene regulation, especially during periods of cellular stress. Cap-dependent translation via the eIF4F complex ...

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

Hedeflenen<em&gt; In situ</emBudding Maya&gt; Mutajenezis Histon ve Genler

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting ...

Production and Purification of Baculovirus for Gene Therapy Application

Üretim ve Baculovirus arınma gen tedavisi uygulaması için

Baculovirus has traditionally been used for the production of recombinant protein and vaccine. However, more recently, baculovirus is emerging as a ...

Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere

Kök Microbiome keşfetmek: toprak, rizosferde ve kök Endosphere bakteriyel topluluk verileri ayıklama

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to ...

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization (smFISH) Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Tek molekül floresans In Situ hibridizasyon (smFISH) analizi Budding Maya bitkisel büyüme ve mayoz

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect ...

Informatic Analysis of Sequence Data from Batch Yeast 2-Hybrid Screens

Sıralı veri--dan toplu Maya 2-hibrid perde Bilişim Analizi

We have adapted the yeast 2-hybrid assay to simultaneously uncover dozens of transient and static protein interactions within a single screen utilizing ...

Mating-based Overexpression Library Screening in Yeast

Maya Overexpression çiftleşme tabanlı Kütüphane tarama

Budding yeast has been widely used as a model in studying proteins associated with human diseases. Genome-wide genetic screening is a powerful tool ...

A Deep-sequencing-assisted, Spontaneous Suppressor Screen in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe

A Deep-sequencing-assisted, Spontaneous Suppressor Screen in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe

Fisyon mayası Schizosaccharomyces pombe derin sıralama yoluyla, kendiliğinden bastırıcı ekran

A genetic screen for mutant alleles that suppress phenotypic defects caused by a mutation is a powerful approach to identify genes that belong to closely ...

Enhanced Yeast One-hybrid Screens To Identify Transcription Factor Binding To Human DNA Sequences

İnsan DNA dizileri için bağlama transkripsiyon faktörü belirlemek için gelişmiş Maya bir melez ekranlar

Identifying the sets of transcription factors (TFs) that regulate each human gene is a daunting task that requires integrating numerous experimental and ...