Name: measuring the effects of bacteria and chemicals on the intestinal permeability of caenorhabditis elegans
Uploaded: 2019-12-03T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring the Effects of Bacteria and Chemicals on the Intestinal Permeability of Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Denne undersøgelse blev støttet af en Korea Institute of Science and Technology murene Research Grant (2e29563).

1. klargøring af P. aeruginosa PAO1 og Escherichia coli OP50 kultur
<ol><li>Forbered 500 mL steriliseret Luria-Bertani (LB) medium (tabel 1) og inokulere en enkelt koloni af P. aeruginosa i mediet. Inkubatér kulturen i 14 til 15 timer ved 37 °C med en ryste hastighed på 150 rpm.</li>
	<li>Den bakterielle kultur fordeles ligeligt i 2 500 mL centrifugeglas, og rørene centrifugeres ved 3.220 x g ved 4 °c i 30 minutter.</li>
	<li>Supernatanten fjernes, indtil volum...

<ol>
	<li>Bischoff, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+permeability&#8211;a+new+target+for+disease+prevention+and+therapy.">Intestinal permeability&#8211;a new target for disease prevention and therapy.</a> BMC Gastroenterology. 14 (1), 189 (2014).</li><li>Peng, L., Li, Z. R., Green, R. S., Holzman, I. R., Lin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Butyrate+enhances+the+intestinal+barrier+by+facilitating+tight+junction+assembly+via+activation+of+AMP-activated+protein+kinase+in+Caco-2+cell+monolayers.">Butyrate enhances the intestinal barrier by facilitating tight junction assembly via activation of AMP-activated protein kinase in Caco-2 cell monolayers.</a> The Journal of Nutrition. 139 (9), 1619-1625 (2009).</li><li>Ren, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+basis+for+intestinal+barrier+against+the+toxicity+of+graphene+oxide.">Developmental basis for intestinal barrier against the toxicity of graphene oxide.</a> Particle Fibre Toxicology. 15 (1), 26 (2018).</li><li>Kissoyan, K. A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+C.+elegans+microbiota+protects+against+infection+via+production+of+a+cyclic+lipopeptide+of+the+viscosin+group.">Natural C. elegans microbiota protects against infection via production of a cyclic lipopeptide of the viscosin group.</a> Current Biology. 29 (6), 1030-1037 (2019).</li><li>Gelino, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+autophagy+improves+healthspan+and+longevity+in+C.+elegans+during+dietary+restriction.">Intestinal autophagy improves healthspan and longevity in C. elegans during dietary restriction.</a> PLoS Genetics. 12 (7), 1006135 (2016).</li><li>Escorcia, W., Ruter, D. L., Nhan, J., Curran, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+lipid+abundance+and+evaluation+of+lipid+distribution+in+Caenorhabditis+elegans+by+Nile+red+and+oil+red+O+staining.">Quantification of lipid abundance and evaluation of lipid distribution in Caenorhabditis elegans by Nile red and oil red O staining.</a> Journal of Visualized Experiments. (133), e57352 (2018).</li><li>Johnson, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advantages+and+disadvantages+of+Caenorhabditis+elegans+for+aging+research.">Advantages and disadvantages of Caenorhabditis elegans for aging research.</a> Experimental Gerontology. 38 (11-12), 1329-1332 (2003).</li><li>Culetto, E., Sattelle, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+Caenorhabditis+elegans+in+understanding+the+function+and+interactions+of+human+disease+genes.">A role for Caenorhabditis elegans in understanding the function and interactions of human disease genes.</a> Human Molecular Genetics. 9 (6), 869-877 (2000).</li><li>Hubbard, E. J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+germ+line:+A+model+for+stem+cell+biology.">Caenorhabditis elegans germ line: A model for stem cell biology.</a> Developmental Dynamics. 236 (12), 3343-3357 (2007).</li><li>Park, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probiotic+Lactobacillus+fermentum+strain+JDFM216+stimulates+the+longevity+and+immune+response+of+Caenorhabditis+elegans+through+a+nuclear+hormone+receptor.">Probiotic Lactobacillus fermentum strain JDFM216 stimulates the longevity and immune response of Caenorhabditis elegans through a nuclear hormone receptor.</a> Scientific Reports. 8, 7441 (2018).</li><li>Kim, Y., Mylonakis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+immune+conditioning+with+the+probiotic+bacterium+Lactobacillus+acidophilus+strain+NCFM+enhances+gram-positive+immune+responses.">Caenorhabditis elegans immune conditioning with the probiotic bacterium Lactobacillus acidophilus strain NCFM enhances gram-positive immune responses.</a> Infection and Immunity. 80 (7), 2500-2508 (2012).</li><li>Nakagawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+and+mechanisms+of+prolongevity+induced+by+Lactobacillus+gasseri+SBT2055+in+Caenorhabditis+elegans.">Effects and mechanisms of prolongevity induced by Lactobacillus gasseri SBT2055 in Caenorhabditis elegans.</a> Aging Cell. 15 (2), 227-236 (2016).</li><li>Dinh, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cranberry+extract+standardized+for+proanthocyanidins+promotes+the+immune+response+of+Caenorhabditis+elegans+to+Vibrio+cholerae+through+the+p38+MAPK+pathway+and+HSF-1.">Cranberry extract standardized for proanthocyanidins promotes the immune response of Caenorhabditis elegans to Vibrio cholerae through the p38 MAPK pathway and HSF-1.</a> PLoS One. 9 (7), 103290 (2014).</li><li>Vayndorf, E. M., Lee, S. S., Liu, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+apple+extracts+increase+lifespan,+healthspan+and+resistance+to+stress+in+Caenorhabditis+elegans.">Whole apple extracts increase lifespan, healthspan and resistance to stress in Caenorhabditis elegans.</a> Journal of Functional Foods. 5 (3), 1236-1243 (2013).</li><li>Huycke, M. M., Abrams, V., Moore, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enterococcus+faecalis+produces+extracellular+superoxide+and+hydrogen+peroxide+that+damages+colonic+epithelial+cell+DNA.">Enterococcus faecalis produces extracellular superoxide and hydrogen peroxide that damages colonic epithelial cell DNA.</a> Carcinogenesis. 23 (3), 529-536 (2002).</li><li>Laughlin, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+key+role+of+Pseudomonas+aeruginosa+PA-I+lectin+on+experimental+gut-derived+sepsis.">The key role of Pseudomonas aeruginosa PA-I lectin on experimental gut-derived sepsis.</a> Annals of Surgery. 232 (1), 133-142 (2000).</li><li>Huang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3,3'-Diindolylmethane+decreases+VCAM-1+expression+and+alleviates+experimental+colitis+via+a+BRCA1-dependent+antioxidant+pathway.">3,3'-Diindolylmethane decreases VCAM-1 expression and alleviates experimental colitis via a BRCA1-dependent antioxidant pathway.</a> Free Radical Biology, Medicine. 50 (2), 228-236 (2011).</li><li>Jeon, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Oral+Administration+of+3,3'-Diindolylmethane+on+Dextran+Sodium+Sulfate-Induced+Acute+Colitis+in+Mice.">Effect of Oral Administration of 3,3'-Diindolylmethane on Dextran Sodium Sulfate-Induced Acute Colitis in Mice.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 64, 7702-7709 (2016).</li><li>Kim, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3,3'-Diindolylmethane+improves+intestinal+permeability+dysfunction+in+cultured+human+intestinal+cells+and+the+model+animal+Caenorhabditis+elegans.">3,3'-Diindolylmethane improves intestinal permeability dysfunction in cultured human intestinal cells and the model animal Caenorhabditis elegans.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 67 (33), 9277-9285 (2019).</li><li>Lee, S. Y., Kang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+the+Effect+of+Chemicals+on+the+Growth+and+Reproduction+of+Caenorhabditis+elegans.">Measuring the Effect of Chemicals on the Growth and Reproduction of Caenorhabditis elegans.</a> Journal of Visualized Experiments. (128), e56437 (2017).</li><li>Schmeisser, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+ROS+signaling+rather+than+AMPK/sirtuin-mediated+energy+sensing+links+dietary+restriction+to+lifespan+extension.">Neuronal ROS signaling rather than AMPK/sirtuin-mediated energy sensing links dietary restriction to lifespan extension.</a> Molecular Metabolism. 2 (2), 92-102 (2013).</li><li>Lee, S. Y., Kim, J. Y., Jung, Y. J., Kang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxicological+evaluation+of+the+topoisomerase+inhibitor,+etoposide,+in+the+model+animal+Caenorhabditis+elegans+and+3T3-L1+normal+murine+cells.">Toxicological evaluation of the topoisomerase inhibitor, etoposide, in the model animal Caenorhabditis elegans and 3T3-L1 normal murine cells.</a> Environmental Toxicology. 32 (6), 1836-1843 (2017).</li><li>Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+Caenorhabditis+elegans+life+span+on+solid+media.">Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media.</a> Journal of Visualized Experiments. (27), e1152 (2009).</li><li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Caenorhabditis+elegans+methods:+synchronization+and+observation.">Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation.</a> Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).</li><li>Al Atya, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probiotic+potential+of+Enterococcus+faecalis+strains+isolated+from+meconium.">Probiotic potential of Enterococcus faecalis strains isolated from meconium.</a> Frontiers in Microbiology. 6, 227 (2015).</li><li>Hanchi, H., Mottawea, W., Sebei, K., Hammami, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Genus+Enterococcus:+Between+Probiotic+Potential+and+Safety+Concerns-An+Update.">The Genus Enterococcus: Between Probiotic Potential and Safety Concerns-An Update.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 1791 (2018).</li><li>Pollack, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+exotoxin+A+in+pseudomonas+disease+and+immunity.">The role of exotoxin A in pseudomonas disease and immunity.</a> Reviews of Infectious Diseases. 5, 979-984 (1983).</li><li>Vasil, M. L., Liu, P. V., Iglewski, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature-dependent+inactivating+factor+of+Pseudomonas+aeruginosa+exotoxin+A.">Temperature-dependent inactivating factor of Pseudomonas aeruginosa exotoxin A.</a> Infection and Immunity. 13 (5), 1467-1472 (1976).</li><li>Horii, T., Muramatsu, H., Monji, A., Miyagishima, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Release+of+exotoxin+A,+peptidoglycan+and+endotoxin+after+exposure+of+clinical+Pseudomonas+aeruginosa+isolates+to+carbapenems+in+vitro.">Release of exotoxin A, peptidoglycan and endotoxin after exposure of clinical Pseudomonas aeruginosa isolates to carbapenems in vitro.</a> Chemotherapy. 51 (6), 324-331 (2005).</li><li>Kirikae, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+characterization+of+endotoxins+released+from+antibiotic-treated+Pseudomonas+aeruginosa+and+Escherichia+coli.">Biological characterization of endotoxins released from antibiotic-treated Pseudomonas aeruginosa and Escherichia coli.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 42 (5), 1015-1021 (1998).</li><li>Morlon-Guyot, J., Mere, J., Bonhoure, A., Beaumelle, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+of+Pseudomonas+aeruginosa+exotoxin+A+is+dispensable+for+cell+intoxication.">Processing of Pseudomonas aeruginosa exotoxin A is dispensable for cell intoxication.</a> Infection and Immunity. 77 (7), 3090-3099 (2009).</li><li>Kim, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3,3'-diindolylmethane+attenuates+colonic+inflammation+and+tumorigenesis+in+mice.">3,3'-diindolylmethane attenuates colonic inflammation and tumorigenesis in mice.</a> Inflammatory Bowel Diseases. 15 (8), 1164-1173 (2009).</li><li>Kanmani, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probiotics+and+its+functionally+valuable+products-a+review.">Probiotics and its functionally valuable products-a review.</a> Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 53 (6), 641-658 (2013).</li><li>Nguyen, M. T., Gotz, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipoproteins+of+Gram-Positive+Bacteria:+Key+Players+in+the+Immune+Response+and+Virulence.">Lipoproteins of Gram-Positive Bacteria: Key Players in the Immune Response and Virulence.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 80 (3), 891-903 (2016).</li></ol>

Ved at udnytte denne nye metode til bestemmelse af tarm permeabilitet i C. elegans, som kombinerer automatiseret Fluorescens mikroskopi og kvantitativ billedanalyse, kan forskellene forårsaget af intestinale mikroorganismer eller kemikalier bestemmes in vivo, specifikt i C. elegans tarmen. Denne protokol er nyttig for tarm permeabilitet undersøgelser og gælder for mange opgaver, såsom reaktive ilt arter (ROS) bestemmelse under stress betingelser og morfologiske undersøgelser, på grund af sin bekve...

Intestinal permeabilitet betragtes som en af de vigtigste barrierer i forbindelse med den intestinale mikrobiota og slimhinde immunitet og vil sandsynligvis blive påvirket af flere faktorer, såsom Gut mikrobiota modifikationer, epitelial svækkelse, eller slim Layer ændringer1. Nylige papirer har rapporteret effektive protokoller til at måle tarm permeabilitet af dyrkede humane tarmceller ved at analysere fluorescens flux satser på tværs af tarm celle lag2, men færre forskningspapirer præsentere en passende procedure til måling af tarm permeabilitet i nematodes, især i C. elegans, ved hjælp af FITC-dextran farvning.
Der er to repræsentative protokoller til måling af tarm permeabilitet i C. elegans ved hjælp af Nile Red3 og erioglaucin dinatrium (eller Smurf assay)4,5. I denne protokol brugte vi FITC-dextran (gennemsnitlig molekylvægt 10.000), som har en meget højere molekylvægt end Nilen rød (MW = 318,37) og erioglaucindinatrium (MW = 792,85). FITC-dextran er mere ens end Nilen rød eller erioglaucin dinatrium farvestoffer til faktiske makromolekylære næringsstoffer såsom kulhydrater, som absorberes gennem tarm laget. Den intestinale permeabilitet af C. elegans fodret med erioglaucindinatrium (blåt Smurf farvestof) kan let evalueres uden Fluorescens mikroskopi. I Smurf-analysen er kvantitativ analyse af intestinal permeabilitet imidlertid vanskelig på grund af manglende standardisering og bør evalueres manuelt4,5. I tilfælde af Nilen rød analyse, også Nile Red pletter lipid dråber i celler, som kan forstyrre den nøjagtige bestemmelse af tarm permeabilitet i C. elegans6. De nuværende protokoller muliggør en hurtig og præcis kvantitativ analyse af tarm permeabilitet i C. elegans behandlet med forskellige tarm bakterier og kemikalier, samtidig med at uspecifik lipid farvning undgås.
C. elegans er en typisk model i biologiske felter på grund af sin overkommelige pris, nem manipulation, begrænset dyreetiske spørgsmål, og kort levetid, som er gavnlig for hurtige eksperimenter7. Især, efter at hele c. elegans genom blev offentliggjort, næsten 40% af gener i C. elegans genom blev fundet at være orthologous til gener, der forårsager sygdomme hos mennesker8. Desuden giver det gennemsigtige organ observation inde i organismen, hvilket er fordelagtigt for at forske i cellulære hændelser og for fluorescens applikationer i cellebiologi, for eksempel stamcelle farvning med DAPI eller immunhistochemistry9. C. elegans bruges ofte som forsøgsdyr til at studere interaktionen mellem Gut mikrobiota og værten; Desuden, C. elegaNS bruges til at screene sundhedsfremmende probiotiske bakterier10,11,12 samt kosten kemikalier fremme tarm sundhed13,14.
Pseudomonas aeruginosa og Enterococcus fæalis er velkendte tarm bakterier, der påvirker mave-tarmsystemet negativt, især de koloniske epiteliale celler i tarmkanalen15,16. Derfor er måling af tarm permeabilitet udløst af disse bakterier er nødvendig for screening og udvikling af nye lægemidler, der kan genvinde og reducere skaderne forårsaget af bakteriel inflammation og infektion. I denne protokol, vi testede virkningerne af disse tarm bakterier på tarm permeabilitet af C. elegans.
Vi rapporterer også en optimeret protokol til afprøvning af kemikalier på tarm permeabilitet af C. elegans. Til dette formål brugte vi 3, 3 '-diindolylmethane (Dim) som en model kemikalie, fordi Dim er en Bioaktiv metabolit sammensatte afledt af indol-3-carbinol, som er til stede i Brassica fødevarer planter, og er blevet rapporteret at have terapeutiske virkninger på IBD i mus17,18. Desuden har vi for nylig opdaget, at DIM forbedrer tarm permeabilitet dysfunktion i både dyrkede humane tarmceller samt model fyrretræsnematoden C. elegans19.
I denne undersøgelse, vi brugte tre forskellige eksperimentelle betingelser. For det første målte vi virkningerne af de forskellige bakterier, P. aeruginosa og E. fæalis, på intestinal permeabilitet (figur 1). For det andet målte vi virkningerne af levende og varme inaktiverede P. aeruginosa på intestinal permeabilitet (figur 2). For det tredje målte vi virkningerne af DIM (et model kemikalie) på tarm permeabiliteten af C. elegans fodret med P. aeruginosa (figur 3).
Formålet med denne undersøgelse var at udvikle optimerede protokoller, der måler intestinal permeabilitet af C. elegans, som er ændret ved behandling med forskellige tarm bakterier samt med kemikalier.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >3,3&#8217;-diindolylmethane&#160;</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >D9568</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >90&#215;15 mm Petri dishes</td>
			<td >SPL Life Sciences, South Korea</td>
			<td >10090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >60&#215;15 mm Petri dishes</td>
			<td >SPL Life Sciences, South Korea</td>
			<td >10060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bactor Agar</td>
			<td >Beckton Dickinson</td>
			<td >REF. 214010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Formaldehyde solution&#160;</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >F1635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Brain Heart Infusion (BHI)&#160;</td>
			<td >Becton Dickinson</td>
			<td >REF. 237500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Caenorhabditis elegans N2</td>
			<td >Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td ></td>
			<td>Wild type&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cholesterol</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >C3045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Costa Assay Plate, 96 Well Black With Clear Flat Bottom Non-treated, No Lid Polystyrene</td>
			<td >Corning Incorporated</td>
			<td >REF. 3631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dimethyl sulfoxide</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Enterococcus faecalis KCTC 3206</td>
			<td >Korean Collection for Type Culture</td>
			<td >KCTC NO. 3206</td>
			<td>Falcutative anaerobic</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Escherichia coli OP50</td>
			<td >Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fluorescein isothiocyanate - dextran</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >FD10S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Harmony software&#160;</td>
			<td >PerkinElmer</td>
			<td ></td>
			<td>verson 3.5</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Luria-Bertani LB medium</td>
			<td >Merck</td>
			<td >VM743185 626&#160; 1.10285.5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Magnesium sulfate heptahydrate&#160;</td>
			<td >Fisher Bioreagents</td>
			<td >BP2213-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fluoromount aqueous mounting medium</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >F4680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Operetta CLS High-Content Analysis System</td>
			<td >PerkinElmer</td>
			<td>&#160;HH16000000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Peptone</td>
			<td >Merck</td>
			<td >EMD 1.07213.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pseudomonas aeruginosa PA01</td>
			<td >Korean Collection for Type Culture</td>
			<td >KCTC NO. 1637</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium Chloride</td>
			<td >Fisher Bioreagents</td>
			<td >BP358-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Stereo Microscope</td>
			<td >Nikon, Japan</td>
			<td >SMZ800N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Yeast extract</td>
			<td >Becton Dickinson</td>
			<td >REF. 212750</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring the effects of bacteria and chemicals on the intestinal permeability of caenorhabditis elegans

I levende organismer, intestinal hyperpermeabilitet er et alvorligt symptom, der fører til mange inflammatoriske tarmsygdomme (IBDs). Caenorhabditis elegans er en nonmammalian dyremodel, der er almindeligt anvendt som en analyse system på grund af sin korte levetid, gennemsigtighed, omkostningseffektivitet, og mangel på dyreetiske spørgsmål. I denne undersøgelse, en metode blev udviklet til at undersøge virkningerne af forskellige bakterier og 3, 3 '-diindolylmethane (DIM) på tarm permeabilitet af C. elegans med et højt gennemløb billedanalyse system. Ormene blev inficeret med forskellige tarm bakterier eller cobehandlet med DIM for 48 h og fodret med fluorescein isothiocyanat (FITC)-dextran natten over. Derefter blev intestinal permeabilitet undersøgt ved at sammenligne fluorescensbilleder og fluorescens intensiteten inde i orme organerne. Denne metode kan også have potentiale til at identificere probiotiske og patogene tarm bakterier, der påvirker tarm permeabilitet i dyremodellen og er effektiv til at undersøge virkningerne af skadelige eller sundhedsfremmende kemikalier på intestinal permeabilitet og tarm sundhed. Men denne protokol har også nogle betydelige begrænsninger på det genetiske niveau, især for at bestemme, hvilke gener der er ændret til at kontrollere sygdom, fordi denne metode er for det meste anvendes til fænotypiske bestemmelse. Desuden er denne metode begrænset til at bestemme præcis, hvilke sygdomsfremkaldende substrater forårsager betændelse eller øge permeabilitet af orme tarme under infektion. Derfor er yderligere dybtgående undersøgelser, herunder undersøgelse af den molekylære genetiske mekanisme ved hjælp af mutant bakterier og nematoder samt kemisk komponent analyse af bakterier, forpligtet til fuldt ud at evaluere funktionen af bakterier og kemikalier til bestemmelse af tarm permeabilitet.

Efter inkubation med P. aeruginosa PAO1 viste C. elegans en signifikant stigning i FITC-dextran fluorescens i orme legemet sammenlignet med den fluorescens, der blev vist efter inkubation med de to andre bakteriestammer (figur 1). Fluorescens intensiteter for orme fodret med e. coli OP50, P. aeruginosa PAO1 og e. fæalis KCTC3206 var henholdsvis 100,0 ± 6,6, 369,7 ± 38,9 og 105,6 ± 10,6%. Dataene understreger, at P. aeruginosa forårsa...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring the Effects of Bacteria and Chemicals on the Intestinal Permeability of Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Measuring the Effects of Bacteria and Chemicals on the Intestinal Permeability of Caenorhabditis elegans

Denne protokol beskriver, hvordan man måler tarm permeabilitet af Caenorhabditis elegans. Denne metode er nyttigt for grundlæggende biologisk forskning på tarm sundhed relateret til samspillet mellem tarm bakterier og deres vært og til screening for at identificere probiotiske og kemiske agenser til at helbrede utætte tarm syndrom og inflammatoriske tarmsygdomme.

Måling af virkningerne af bakterier og kemikalier på tarm permeabilitet af Caenorhabditis elegans

In living organisms, intestinal hyperpermeability is a serious symptom that leads to many inflammatory bowel diseases (IBDs). Caenorhabditis elegans is a ...

Denne metode vil være nyttig for grundlæggende biologiske undersøgelser i forbindelse med samspillet mellem intestinal mikrobiota og tarm sundhed. Desuden, denne protokol kan bruges til screening potentielle probiotika og nutraceuticals at helbrede tarm sundhedsmæssige problemer, såsom utæt tarmsyndrom og inflammatoriske tarmsygdomme. Denne protokol bruger et billedsystem med høj gennemløb til at muliggøre hurtig og præcis kvantitativ analyse af tarmpermeabilitet i C.elegans behandlet med forskellige bakterier og kemikalier.Vi anbefaler, at en videnskabsmand, der ikke er bekendt med denne teknik begrænser antallet af prøver for at undgå forkert mærkning og andre fejl. Denne procedure består af mange trin, der kræver visuel demonstration, såsom overførsel af orme til 96-brøndsplader og brug af operettemaskinen samt Harmony-softwaren. Start med at forberede 500 milliliter sterilt LB medium.Inokuler en enkelt koloni af P.aeruginosa i mediet, og inkuber kulturen i 14 til 15 timer ved 37 grader Celsius, mens du ryster ved 150 rpm. Den næste dag fordeler bakteriekulturen jævnt i to 500-milliliterrør og centrifugerer dem ved 3, 220 gange g og fire grader Celsius i 30 minutter. Fjern supernatanten, så der efterlades 25 milliliter i hvert rør, for et samlet resterende volumen på 50 milliliter, derefter opslæmpe bakteriepellet.Opbevar bakteriekulturen ved fire grader Celsius, indtil den er klar til brug. For at teste virkningerne af bakterier på tarmpermeabilitet af C.elegans, fjerne kulturer fra køleskabet, og grundigt vortex dem. Tilsæt i alt 800 mikroliter til hver frisk NGM plade, og lad pladerne tørre i en 20-graders Celsius inkubator natten over.For at forberede DIM plader, tilsættes 50 milliliter NGM agar medium i en flaske DIM indeholder NGM bouillon, og bland grundigt. Hæld derefter 20 milliliter af mediet i hver 90-by-15-millimeter petriskål. Dmso-pladerne klargøres ved at tilsætte 20 milliliter DMSO, der indeholder NGM-medie, til hver petriskål, og pladerne skal være ved stuetemperatur i mindst tre timer for at størkne.Spred 800 mikroliter vortexed E.coli eller P.aeruginosa kultur på hver frisk NGM plade, og lad pladerne tørre i en 20-graders Celsius inkubator natten over. Vask den alderssynkronerede L4 larver med S-buffer, og overfør ca. 500 orme til NGM-pladerne, der indeholder forskellige bakterier og kemikalier. Derefter inkubere pladerne ved 20 grader Celsius i 48 timer.Forbered de FITC-dextran-supplerede plader ved at blande to milliliter varmeinaktiveret E.coli med fire milligram FITC-dextran. Tilsæt 100 mikroliter af blandingen til hver af 20 friske NGM agar plader, og lad pladerne tørre i en time på en ren lab bænk. Efter 48 timers behandling vaskes ormene med S-buffer, overføre dem til FITC-dextran-supplerede plader og til NGM plader uden FITC-dextran, og inkubere pladerne natten over.Den næste dag, vaske orme med S-buffer, og give dem mulighed for at kravle i den friske NGM agar plade i en time. Tilføj 50 mikroliter af 4% formaldehyd til hver brønd af en sort, 96-godt, fladbundet plade, og overføre ca 50 orme i hver brønd. Efter en til to minutter, fjerne alle formaldehyd, og tilsæt 100 mikroliter montering medium i hver brønd.Formaldehyd er et giftigt kemikalie og bør håndteres med forsigtighed. Hvis du vil tage fluorescerende billeder, skal du trykke på ikonet Åbn låg i billedbehandlingssoftwaren og sætte pladen ind i maskinen. Klik på Opsætning, vælg pladetypen, og tilføj brightfield- og EGFP-kanalerne.Hvis du vil justere layoutet, skal du gå til valg af layout og vælge Spor. Indstil det første billede på et mikrometer, antal fly til 10 og afstanden til et mikrometer. Vælg en af behandlingstingerne og et opsamlingsfelt, og tryk på Test i sektionen Kør eksperiment.Hvis billederne er tilfredsstillende, skal du vende tilbage til afsnittet Opsætning og trykke på ikonet Nulstil. Vælg derefter alle mål godts og et passende antal capture felter. Gå til Kør eksperiment, skriv pladenavnet, og tryk på Start.Hvis du vil måle fluorescensintensiteten, skal du gå til afsnittet Billedanalyse, indtaste billedet og finde cellen ved at vælge EGFP-kanalen og -metoden B.Juster parametrene i henhold til håndskriftsanvisningerne, og vælg middeltivet som output. Tryk på ikonet Anvend for at gemme opsætningen. Få et varmekort og en datatabel ved at gå til afsnittet Evaluering og justere udlæsningsparameteren, og start derefter evalueringen.C.elegans viste en betydelig stigning i FITC-dextran fluorescens efter inkubation med P.aeruginosa sammenlignet med de to andre bakteriestammer, hvilket indikerer, at P.aeruginosa forårsagede mere afgørende skader på epitel gut barrieren og øget intestinal gennemtrængelighed. Levende og varmeinaktiveret P.aeruginosa udløste meget forskellige virkninger på tarmpermeabiliteten i C.elegans. Ved varmeinaktivering indikerer både fluorescensbillederne og de statistiske data, at P.aeruginosa ikke udløste nogen toksicitet for nematoder.En 48-timers co-behandling med DIM betydeligt faldt FITC-dextran fluorescens intensitet inde i tarme af orme udsat for P.aeruginosa, som viser, at DIM kan betragtes som et godt naturligt produkt til at helbrede intestinal permeabilitet dysfunktion forårsaget af bakterielle infektioner. Det er vigtigt at huske, at under udarbejdelsen af FITC-dextran-belagte plader, skal du minimere lyseksponeringen på grund af lysfølsomhed af FITC-dextran. Denne teknik kan bruges til at bestemme de patogene og probiotiske virkninger af tarmbakterier og deres aktive komponenter ved at teste bakterierne, samt deres kemiske sammensætning.

Research

JoVE Journal

Medicine

Measuring the Effects of Bacteria and Chemicals on the Intestinal Permeability of Caenorhabditis elegans

Measuring the Strength of Mice

Måle styrken af ​​mus

Kondziela7 devised the inverted screen test and published it in 1964. It is a test of muscle strength using all four limbs. Most normal mice easily score ...

Measuring Frailty in HIV-infected Individuals. Identification of Frail Patients is the First Step to Amelioration and Reversal of Frailty

Måling Frailty i HIV-smittede personer. Identifikation af svagelige patienter er det første skridt til forbedring og Tilbageførsel af Frailty

A simple, validated protocol consisting of a battery of tests is available to identify elderly patients with frailty syndrome. This syndrome of decreased ...

Non-invasive Assessment of the Efficacy of New Therapeutics for Intestinal Pathologies Using Serial Endoscopic Imaging of Live Mice

Ikke-invasiv vurdering af effekten af ​​nye lægemidler til behandling af Intestinal patologier Brug Serial Endoskopisk Imaging af levende mus

Animal models of inflammatory bowel disease (IBD) and colorectal cancer (CRC) have provided significant insight into the cell intrinsic and extrinsic ...

Ex Vivo Intestinal Sacs to Assess Mucosal Permeability in Models of Gastrointestinal Disease

Ex Vivo Intestinal Sacs to Assess Mucosal Permeability in Models of Gastrointestinal Disease

Ex Vivo Intestinal Sacs at vurdere slimhinder permeabilitet i modeller af gastrointestinal sygdom

The epithelial barrier is the first innate defense of the gastrointestinal tract and selectively regulates transport from the lumen to the underlying ...

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

Fosfor-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: et redskab til måling<em&gt; In vivo</em&gt; Mitokondrie Oxidativ phosphorylering Kapacitet i human skeletmuskulatur

Skeletal muscle mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) capacity, which is critically important in health and disease, can be measured in vivo ...

Analyzing Beneficial Effects of Nutritional Supplements on Intestinal Epithelial Barrier Functions During Experimental Colitis

Analyse Gavnlige virkninger af kosttilskud på Intestinal epitelbarriere funktioner under Eksperimentel Colitis

Inflammatory bowel diseases (IBD), including Crohn&#39;s disease and ulcerative colitis, are chronic relapsing disorders of the intestines. They cause ...

Measuring the Effect of Chemicals on the Growth and Reproduction of Caenorhabditis elegans

Measuring the Effect of Chemicals on the Growth and Reproduction of Caenorhabditis elegans

Måle effekten af kemikalier på vækst og reproduktion af Caenorhabditis elegans

Toxicological evaluation is crucial for understanding the effects of chemicals on living organisms in basic and applied biological science fields. A ...

A Murine Model of Fetal Exposure to Maternal Inflammation to Study the Effects of Acute Chorioamnionitis on Newborn Intestinal Development

En Murine Model af fostereksponering for mødrebetændelse for at studere virkningerne af akut chorioamnionitis på nyfødte tarm udvikling

Chorioamnionitis is a common precipitant of preterm birth and is associated with many of the morbidities of prematurity, including necrotizing ...

Isolation of Murine Intestinal Mesenchyme Resulting in a High Yield of Telocytes

Isolering af murine intestinal mesenchyme, hvilket resulterer i et højt udbytte af telocytter

The murine small intestine, or colon mesenchyme, is highly heterogenous, containing distinct cell types including blood and lymphatic endothelium, nerves, ...

Vurdering af styrketræningsvolumen og dens indvirkning på insulinfølsomhed ved fedme

Randomized Controlled Trial to Study the Acute Effects of Strength Exercise on Insulin Sensitivity in Obese Adults

Forfatter Spotlight: Udforskning af virkningen af reduceret modstandstræningsvolumen på metabolisk sundhed 

Randomiseret kontrolleret forsøg for at studere de akutte virkninger af styrketræning på insulinfølsomhed hos overvægtige voksne

An acute session of strength exercise (SE) ameliorates insulin sensitivity (IS) for several hours; however, the effects of SE volume (i.e., number of ...