Name: measuring the effects of bacteria and chemicals on the intestinal permeability of caenorhabditis elegans
Uploaded: 2019-12-03T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring the Effects of Bacteria and Chemicals on the Intestinal Permeability of Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Deze studie werd gesteund door een Korea Institute of Science and Technology intramurale Research Grant (2E29563).

1. bereiding van P. aeruginosa PAO1 en Escherichia coli OP50 cultuur
<ol><li>Bereid 500 mL gesteriliseerde Luria-Bertani (LB) medium (tabel 1) en inoculeren een enkele kolonie van P. aeruginosa in het medium. Inbroed de kweek van 14 tot 15 uur bij 37 °C met een trillende snelheid van 150 rpm.</li>
	<li>Verdeel de bacteriecultuur gelijkmatig in 2 500 mL centrifugebuizen en centrifugeer de buisjes op 3.220 x g bij 4 °c gedurende 30 minuten.</li>
	<li>Verwijder het su...

<ol>
	<li>Bischoff, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+permeability&#8211;a+new+target+for+disease+prevention+and+therapy.">Intestinal permeability&#8211;a new target for disease prevention and therapy.</a> BMC Gastroenterology. 14 (1), 189 (2014).</li><li>Peng, L., Li, Z. R., Green, R. S., Holzman, I. R., Lin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Butyrate+enhances+the+intestinal+barrier+by+facilitating+tight+junction+assembly+via+activation+of+AMP-activated+protein+kinase+in+Caco-2+cell+monolayers.">Butyrate enhances the intestinal barrier by facilitating tight junction assembly via activation of AMP-activated protein kinase in Caco-2 cell monolayers.</a> The Journal of Nutrition. 139 (9), 1619-1625 (2009).</li><li>Ren, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+basis+for+intestinal+barrier+against+the+toxicity+of+graphene+oxide.">Developmental basis for intestinal barrier against the toxicity of graphene oxide.</a> Particle Fibre Toxicology. 15 (1), 26 (2018).</li><li>Kissoyan, K. A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+C.+elegans+microbiota+protects+against+infection+via+production+of+a+cyclic+lipopeptide+of+the+viscosin+group.">Natural C. elegans microbiota protects against infection via production of a cyclic lipopeptide of the viscosin group.</a> Current Biology. 29 (6), 1030-1037 (2019).</li><li>Gelino, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+autophagy+improves+healthspan+and+longevity+in+C.+elegans+during+dietary+restriction.">Intestinal autophagy improves healthspan and longevity in C. elegans during dietary restriction.</a> PLoS Genetics. 12 (7), 1006135 (2016).</li><li>Escorcia, W., Ruter, D. L., Nhan, J., Curran, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+lipid+abundance+and+evaluation+of+lipid+distribution+in+Caenorhabditis+elegans+by+Nile+red+and+oil+red+O+staining.">Quantification of lipid abundance and evaluation of lipid distribution in Caenorhabditis elegans by Nile red and oil red O staining.</a> Journal of Visualized Experiments. (133), e57352 (2018).</li><li>Johnson, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advantages+and+disadvantages+of+Caenorhabditis+elegans+for+aging+research.">Advantages and disadvantages of Caenorhabditis elegans for aging research.</a> Experimental Gerontology. 38 (11-12), 1329-1332 (2003).</li><li>Culetto, E., Sattelle, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+Caenorhabditis+elegans+in+understanding+the+function+and+interactions+of+human+disease+genes.">A role for Caenorhabditis elegans in understanding the function and interactions of human disease genes.</a> Human Molecular Genetics. 9 (6), 869-877 (2000).</li><li>Hubbard, E. J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+germ+line:+A+model+for+stem+cell+biology.">Caenorhabditis elegans germ line: A model for stem cell biology.</a> Developmental Dynamics. 236 (12), 3343-3357 (2007).</li><li>Park, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probiotic+Lactobacillus+fermentum+strain+JDFM216+stimulates+the+longevity+and+immune+response+of+Caenorhabditis+elegans+through+a+nuclear+hormone+receptor.">Probiotic Lactobacillus fermentum strain JDFM216 stimulates the longevity and immune response of Caenorhabditis elegans through a nuclear hormone receptor.</a> Scientific Reports. 8, 7441 (2018).</li><li>Kim, Y., Mylonakis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+immune+conditioning+with+the+probiotic+bacterium+Lactobacillus+acidophilus+strain+NCFM+enhances+gram-positive+immune+responses.">Caenorhabditis elegans immune conditioning with the probiotic bacterium Lactobacillus acidophilus strain NCFM enhances gram-positive immune responses.</a> Infection and Immunity. 80 (7), 2500-2508 (2012).</li><li>Nakagawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+and+mechanisms+of+prolongevity+induced+by+Lactobacillus+gasseri+SBT2055+in+Caenorhabditis+elegans.">Effects and mechanisms of prolongevity induced by Lactobacillus gasseri SBT2055 in Caenorhabditis elegans.</a> Aging Cell. 15 (2), 227-236 (2016).</li><li>Dinh, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cranberry+extract+standardized+for+proanthocyanidins+promotes+the+immune+response+of+Caenorhabditis+elegans+to+Vibrio+cholerae+through+the+p38+MAPK+pathway+and+HSF-1.">Cranberry extract standardized for proanthocyanidins promotes the immune response of Caenorhabditis elegans to Vibrio cholerae through the p38 MAPK pathway and HSF-1.</a> PLoS One. 9 (7), 103290 (2014).</li><li>Vayndorf, E. M., Lee, S. S., Liu, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+apple+extracts+increase+lifespan,+healthspan+and+resistance+to+stress+in+Caenorhabditis+elegans.">Whole apple extracts increase lifespan, healthspan and resistance to stress in Caenorhabditis elegans.</a> Journal of Functional Foods. 5 (3), 1236-1243 (2013).</li><li>Huycke, M. M., Abrams, V., Moore, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enterococcus+faecalis+produces+extracellular+superoxide+and+hydrogen+peroxide+that+damages+colonic+epithelial+cell+DNA.">Enterococcus faecalis produces extracellular superoxide and hydrogen peroxide that damages colonic epithelial cell DNA.</a> Carcinogenesis. 23 (3), 529-536 (2002).</li><li>Laughlin, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+key+role+of+Pseudomonas+aeruginosa+PA-I+lectin+on+experimental+gut-derived+sepsis.">The key role of Pseudomonas aeruginosa PA-I lectin on experimental gut-derived sepsis.</a> Annals of Surgery. 232 (1), 133-142 (2000).</li><li>Huang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3,3'-Diindolylmethane+decreases+VCAM-1+expression+and+alleviates+experimental+colitis+via+a+BRCA1-dependent+antioxidant+pathway.">3,3'-Diindolylmethane decreases VCAM-1 expression and alleviates experimental colitis via a BRCA1-dependent antioxidant pathway.</a> Free Radical Biology, Medicine. 50 (2), 228-236 (2011).</li><li>Jeon, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Oral+Administration+of+3,3'-Diindolylmethane+on+Dextran+Sodium+Sulfate-Induced+Acute+Colitis+in+Mice.">Effect of Oral Administration of 3,3'-Diindolylmethane on Dextran Sodium Sulfate-Induced Acute Colitis in Mice.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 64, 7702-7709 (2016).</li><li>Kim, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3,3'-Diindolylmethane+improves+intestinal+permeability+dysfunction+in+cultured+human+intestinal+cells+and+the+model+animal+Caenorhabditis+elegans.">3,3'-Diindolylmethane improves intestinal permeability dysfunction in cultured human intestinal cells and the model animal Caenorhabditis elegans.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 67 (33), 9277-9285 (2019).</li><li>Lee, S. Y., Kang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+the+Effect+of+Chemicals+on+the+Growth+and+Reproduction+of+Caenorhabditis+elegans.">Measuring the Effect of Chemicals on the Growth and Reproduction of Caenorhabditis elegans.</a> Journal of Visualized Experiments. (128), e56437 (2017).</li><li>Schmeisser, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+ROS+signaling+rather+than+AMPK/sirtuin-mediated+energy+sensing+links+dietary+restriction+to+lifespan+extension.">Neuronal ROS signaling rather than AMPK/sirtuin-mediated energy sensing links dietary restriction to lifespan extension.</a> Molecular Metabolism. 2 (2), 92-102 (2013).</li><li>Lee, S. Y., Kim, J. Y., Jung, Y. J., Kang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxicological+evaluation+of+the+topoisomerase+inhibitor,+etoposide,+in+the+model+animal+Caenorhabditis+elegans+and+3T3-L1+normal+murine+cells.">Toxicological evaluation of the topoisomerase inhibitor, etoposide, in the model animal Caenorhabditis elegans and 3T3-L1 normal murine cells.</a> Environmental Toxicology. 32 (6), 1836-1843 (2017).</li><li>Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+Caenorhabditis+elegans+life+span+on+solid+media.">Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media.</a> Journal of Visualized Experiments. (27), e1152 (2009).</li><li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Caenorhabditis+elegans+methods:+synchronization+and+observation.">Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation.</a> Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).</li><li>Al Atya, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probiotic+potential+of+Enterococcus+faecalis+strains+isolated+from+meconium.">Probiotic potential of Enterococcus faecalis strains isolated from meconium.</a> Frontiers in Microbiology. 6, 227 (2015).</li><li>Hanchi, H., Mottawea, W., Sebei, K., Hammami, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Genus+Enterococcus:+Between+Probiotic+Potential+and+Safety+Concerns-An+Update.">The Genus Enterococcus: Between Probiotic Potential and Safety Concerns-An Update.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 1791 (2018).</li><li>Pollack, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+exotoxin+A+in+pseudomonas+disease+and+immunity.">The role of exotoxin A in pseudomonas disease and immunity.</a> Reviews of Infectious Diseases. 5, 979-984 (1983).</li><li>Vasil, M. L., Liu, P. V., Iglewski, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature-dependent+inactivating+factor+of+Pseudomonas+aeruginosa+exotoxin+A.">Temperature-dependent inactivating factor of Pseudomonas aeruginosa exotoxin A.</a> Infection and Immunity. 13 (5), 1467-1472 (1976).</li><li>Horii, T., Muramatsu, H., Monji, A., Miyagishima, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Release+of+exotoxin+A,+peptidoglycan+and+endotoxin+after+exposure+of+clinical+Pseudomonas+aeruginosa+isolates+to+carbapenems+in+vitro.">Release of exotoxin A, peptidoglycan and endotoxin after exposure of clinical Pseudomonas aeruginosa isolates to carbapenems in vitro.</a> Chemotherapy. 51 (6), 324-331 (2005).</li><li>Kirikae, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+characterization+of+endotoxins+released+from+antibiotic-treated+Pseudomonas+aeruginosa+and+Escherichia+coli.">Biological characterization of endotoxins released from antibiotic-treated Pseudomonas aeruginosa and Escherichia coli.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 42 (5), 1015-1021 (1998).</li><li>Morlon-Guyot, J., Mere, J., Bonhoure, A., Beaumelle, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+of+Pseudomonas+aeruginosa+exotoxin+A+is+dispensable+for+cell+intoxication.">Processing of Pseudomonas aeruginosa exotoxin A is dispensable for cell intoxication.</a> Infection and Immunity. 77 (7), 3090-3099 (2009).</li><li>Kim, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3,3'-diindolylmethane+attenuates+colonic+inflammation+and+tumorigenesis+in+mice.">3,3'-diindolylmethane attenuates colonic inflammation and tumorigenesis in mice.</a> Inflammatory Bowel Diseases. 15 (8), 1164-1173 (2009).</li><li>Kanmani, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probiotics+and+its+functionally+valuable+products-a+review.">Probiotics and its functionally valuable products-a review.</a> Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 53 (6), 641-658 (2013).</li><li>Nguyen, M. T., Gotz, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipoproteins+of+Gram-Positive+Bacteria:+Key+Players+in+the+Immune+Response+and+Virulence.">Lipoproteins of Gram-Positive Bacteria: Key Players in the Immune Response and Virulence.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 80 (3), 891-903 (2016).</li></ol>

Door gebruik te maken van deze nieuwe methode voor het bepalen van de doorlaatbaarheid van de darmen in C. elegans, die geautomatiseerde fluorescentiemicroscopie en kwantitatieve beeldanalyse combineert, kunnen de verschillen veroorzaakt door intestinale micro-organismen of chemicaliën in vivo worden bepaald, met name in de darm C. elegans . Dit protocol is nuttig voor onderzoeken van de darm permeabiliteit en toepasbaar op vele taken, zoals het bepalen van reactieve zuurstof soorten (ROS) onder stress...

Intestinale permeabiliteit wordt beschouwd als een van de belangrijkste barrières in verband met de intestinale microbiota en mucosale immuniteit en is waarschijnlijk worden beïnvloed door verschillende factoren, zoals gut microbiota modificaties, epitheliale stoornis, of slijm laagwijzigingen1. Recente papers hebben gerapporteerd effectieve protocollen voor het meten van de intestinale permeabiliteit van gekweekte menselijke intestinale cellen door het analyseren van de fluorescentie flux tarieven over de intestinale cel Layer2, maar minder onderzoek papers presenteren een geschikte procedure voor het meten van de darm permeabiliteit in nematoden, met name in C. elegans, met behulp van FITC-dextran kleuring.
Er zijn twee representatieve protocollen voor het meten van de darm permeabiliteit in C. elegans met behulp van Nile Red3 en erioglaucine Dinatrium (of de Smurf assay)4,5. In dit protocol gebruikten we FITC-dextran (gemiddeld molecuulgewicht 10.000), dat een veel hoger molecuulgewicht heeft dan Nijl rood (MW = 318,37) en erioglaucine Dinatrium (MW = 792,85). FITC-dextran is meer vergelijkbaar dan de Nijl rode of erioglaucine dinatriumkleurstoffen aan werkelijke macromoleculaire voedingsstoffen zoals koolhydraten, die worden geabsorbeerd door de intestinale laag. De intestinale permeabiliteit van C. elegans gevoed met erioglaucine Dinatrium(blauwe Smurf kleurstof) kan eenvoudig worden geëvalueerd zonder fluorescentiemicroscopie. Echter, in de Smurf Assay, kwantitatieve analyse van intestinale permeabiliteit is moeilijk te wijten aan het gebrek aan standaardisatie en moet handmatig worden geëvalueerd4,5. In het geval van de Nijl rode Assay, Nile Red ook vlekken lipide druppels in cellen, die kunnen interfereren met de exacte bepaling van de darm permeabiliteit in C. elegans6. De huidige protocollen maken snelle en nauwkeurige kwantitatieve analyse mogelijk van intestinale permeabiliteit in C. elegans behandeld met verschillende intestinale bacteriën en chemicaliën terwijl het vermijden van onspecifieke lipide-kleuring.
C. elegans is een typisch model in biologische gebieden vanwege de betaalbare prijs, eenvoudige manipulatie, beperkte dierlijke ethische kwesties en een korte levensduur, wat gunstig is voor snelle experimenten7. In het bijzonder, nadat de gehele c. elegans genoom werd gepubliceerd, bleek bijna 40% van de genen in de C. elegans genoom orthologous te zijn voor genen die menselijke ziekten8veroorzaken. Bovendien maakt het transparante lichaam observatie in het organisme mogelijk, wat voordelig is voor het onderzoeken van cellulaire gebeurtenissen en voor fluorescentie toepassingen in celbiologie, zoals stamcel kleuring met DAPI of immunohistochemie9. C. elegans wordt vaak gebruikt als een experimenteel dier om de interactie tussen de darm microbiota en de gastheer te bestuderen; Bovendien, C. elegaNS wordt gebruikt voor het scherm gezondheidsbevorderende probiotische bacteriën10,11,12 evenals dieet chemicaliën bevordering van intestinale gezondheid13,14.
Pseudomonas aeruginosa en enterococcus faecalis zijn bekende gut bacteriën die negatieve invloed op het gastro-intestinale systeem, vooral de Colon cellen van het darmkanaal15,16. Daarom, het meten van de darm permeabiliteit veroorzaakt door deze bacteriën is noodzakelijk voor de screening en de ontwikkeling van nieuwe geneesmiddelen die kunnen herstellen en de schade veroorzaakt door bacteriële ontsteking en infectie te verminderen. In dit protocol, We testten de effecten van deze intestinale bacteriën op de intestinale permeabiliteit van C. elegans.
We rapporteren ook een geoptimaliseerd protocol voor het testen van chemicaliën op de intestinale permeabiliteit van C. elegans. Voor dit doel, we gebruikten 3, 3 '-diindolylmethane (Dim) als een model chemische omdat Dim is een bioactieve metaboliet samengestelde afgeleid van indool-3-carbinol, die aanwezig is in Brassica voedsel planten, en is gemeld dat therapeutische effecten op IBD in muizen17,18. Bovendien, we onlangs ontdekt dat DIM verbetert intestinale permeabiliteit dysfunctie in zowel gekweekte menselijke intestinale cellen, alsmede het model nematode C. elegans19.
In deze studie gebruikten we drie verschillende experimentele condities. Eerst, we gemeten de effecten van de verschillende bacteriën, P. aeruginosa en E. faecalis, op intestinale permeabiliteit (Figuur 1). Ten tweede, we gemeten de effecten van levende en hitte-geïnactiveerd P. aeruginosa op intestinale permeabiliteit (Figuur 2). Ten derde, we gemeten de effecten van DIM (een model chemisch) op de intestinale permeabiliteit van C. elegans gevoed met P. aeruginosa (Figuur 3).
Het doel van deze studie was om geoptimaliseerde protocollen te ontwikkelen die de intestinale permeabiliteit van C. elegansmeten, die wordt gewijzigd door behandeling met verschillende intestinale bacteriën en met chemicaliën.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >3,3&#8217;-diindolylmethane&#160;</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >D9568</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >90&#215;15 mm Petri dishes</td>
			<td >SPL Life Sciences, South Korea</td>
			<td >10090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >60&#215;15 mm Petri dishes</td>
			<td >SPL Life Sciences, South Korea</td>
			<td >10060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bactor Agar</td>
			<td >Beckton Dickinson</td>
			<td >REF. 214010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Formaldehyde solution&#160;</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >F1635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Brain Heart Infusion (BHI)&#160;</td>
			<td >Becton Dickinson</td>
			<td >REF. 237500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Caenorhabditis elegans N2</td>
			<td >Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td ></td>
			<td>Wild type&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cholesterol</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >C3045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Costa Assay Plate, 96 Well Black With Clear Flat Bottom Non-treated, No Lid Polystyrene</td>
			<td >Corning Incorporated</td>
			<td >REF. 3631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dimethyl sulfoxide</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Enterococcus faecalis KCTC 3206</td>
			<td >Korean Collection for Type Culture</td>
			<td >KCTC NO. 3206</td>
			<td>Falcutative anaerobic</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Escherichia coli OP50</td>
			<td >Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fluorescein isothiocyanate - dextran</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >FD10S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Harmony software&#160;</td>
			<td >PerkinElmer</td>
			<td ></td>
			<td>verson 3.5</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Luria-Bertani LB medium</td>
			<td >Merck</td>
			<td >VM743185 626&#160; 1.10285.5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Magnesium sulfate heptahydrate&#160;</td>
			<td >Fisher Bioreagents</td>
			<td >BP2213-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fluoromount aqueous mounting medium</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >F4680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Operetta CLS High-Content Analysis System</td>
			<td >PerkinElmer</td>
			<td>&#160;HH16000000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Peptone</td>
			<td >Merck</td>
			<td >EMD 1.07213.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pseudomonas aeruginosa PA01</td>
			<td >Korean Collection for Type Culture</td>
			<td >KCTC NO. 1637</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium Chloride</td>
			<td >Fisher Bioreagents</td>
			<td >BP358-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Stereo Microscope</td>
			<td >Nikon, Japan</td>
			<td >SMZ800N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Yeast extract</td>
			<td >Becton Dickinson</td>
			<td >REF. 212750</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring the effects of bacteria and chemicals on the intestinal permeability of caenorhabditis elegans

In levende organismen is intestinale hyperpermeabiliteit een ernstig symptoom dat leidt tot veel ontstekings darmziekten (Ibd's). Caenorhabditis elegans is een diermodel van nonzoogdieren dat op grote schaal wordt gebruikt als een testsysteem vanwege de korte levensduur, transparantie, kosteneffectiviteit en gebrek aan ethische problemen met dieren. In deze studie, een methode werd ontwikkeld om te onderzoeken van de effecten van verschillende bacteriën en 3, 3 '-diindolylmethane (DIM) op de intestinale permeabiliteit van C. elegans met een hoge doorvoer beeldanalyse systeem. De wormen werden geïnfecteerd met verschillende darmbacteriën of met Dim behandeld voor 48 h en gevoed met fluoresceïne isothiocyanaat (FITC)-dextran 's nachts. Vervolgens werd de intestinale permeabiliteit onderzocht door de fluorescentie beelden en de intensiteit van de fluorescentie in de worm lichamen te vergelijken. Deze methode kan ook het potentieel hebben om te identificeren van probiotische en pathogene darmbacteriën die invloed hebben op de intestinale permeabiliteit in het diermodel en is effectief voor het onderzoeken van de effecten van schadelijke of gezondheidsbevorderende chemicaliën op intestinale permeabiliteit en intestinale gezondheid. Dit protocol heeft echter ook een aantal aanzienlijke beperkingen op het genetisch niveau, vooral om te bepalen welke genen worden gewijzigd om ziekte te beheersen, omdat deze methode meestal wordt gebruikt voor fenotypische bepaling. Bovendien is deze methode beperkt tot het bepalen van precies welke pathogene ondergronden ontstekingen veroorzaken of de doorlaatbaarheid van de darmen van de wormen verhogen tijdens infectie. Daarom, verdere diepgaande studies, met inbegrip van onderzoek van het moleculaire genetische mechanisme met behulp van mutant bacteriën en nematoden evenals chemische component analyse van bacteriën, zijn vereist voor het volledig evalueren van de functie van bacteriën en chemicaliën bij het bepalen van de intestinale permeabiliteit.

Na incubatie met P. aeruginosa PAO1 vertoonden C. elegans een significante toename van de FITC-dextran-fluorescentie in het worm lichaam in vergelijking met de fluorescentie die werd getoond na incubatie met de andere twee bacteriestammen (Figuur 1). De fluorescentie intensiteiten van wormen gevoed met e. coli OP50, P. aeruginosa PAO1 en e. faecalis KCTC3206 waren respectievelijk 100,0 ± 6,6, 369,7 ± 38,9 en 105,6 ± 10,6%. De gegevens benadrukk...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring the Effects of Bacteria and Chemicals on the Intestinal Permeability of Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Measuring the Effects of Bacteria and Chemicals on the Intestinal Permeability of Caenorhabditis elegans

Dit protocol beschrijft hoe de intestinale permeabiliteit van Caenorhabditis elegansmeten. Deze methode is nuttig voor fundamenteel biologisch onderzoek naar intestinale gezondheid in verband met de interactie tussen darmbacteriën en hun gastheer en voor screening om te identificeren van probiotische en chemische agentia te genezen van lekkende gut syndroom en inflammatoire darmziekten.

Meten van de effecten van bacteriën en chemicaliën op de intestinale permeabiliteit van Caenorhabditis elegans

In living organisms, intestinal hyperpermeability is a serious symptom that leads to many inflammatory bowel diseases (IBDs). Caenorhabditis elegans is a ...

Deze methode zal nuttig zijn voor fundamentele biologische studies met betrekking tot de interactie tussen darmmicrobiota en darmgezondheid. Bovendien, Dit protocol kan worden gebruikt voor screening potentiële probiotica en nutraceuticals om darmgezondheidsproblemen te genezen, zoals lekkende darm syndroom en inflammatoire darmziekten. Dit protocol maakt gebruik van een beeldvormingssysteem met hoge doorvoer om een snelle en nauwkeurige kwantitatieve analyse van de darmdoorlaatbaarheid in C.elegans die met verschillende bacteriën en chemicaliën worden behandeld, mogelijk te maken.We raden een wetenschapper die niet bekend is met deze techniek aan om het aantal monsters te beperken om verkeerd labelen en andere fouten te voorkomen. Deze procedure bestaat uit vele stappen die visuele demonstratie vereisen, zoals het overbrengen van wormen naar 96-putplaten en het gebruik van de Operetta-machine, evenals de Harmony-software. Begin met de voorbereiding van 500 milliliter steriel LB medium.Inenting een enkele kolonie van P.aeruginosa in het medium, en incubeer de cultuur voor 14 tot 15 uur bij 37 graden Celsius tijdens het schudden op 150 rpm. De volgende dag, gelijkmatig verdelen van de bacteriële cultuur in twee 500-milliliter buizen, en centrifugeren ze op 3, 220 keer g en vier graden Celsius gedurende 30 minuten. Verwijder de supernatant, waardoor 25 milliliter in elke buis, voor een totaal resterende volume van 50 milliliter, dan resuspend de bacteriële pellet.Bewaar de bacteriële cultuur op vier graden Celsius tot klaar voor gebruik. Om de effecten van bacteriën op de darmombaarheid van C.elegans te testen, verwijder de culturen uit de koelkast en grondig vortex hen. Voeg in totaal 800 microliters toe aan elke verse NGM-plaat en laat de platen 's nachts drogen in een 20-graden Celsius-incubator.Ter voorbereiding van DIM platen, voeg 50 milliliter NGM agar medium in een fles DIM met NGM bouillon, en meng grondig. Giet vervolgens 20 milliliter van het medium in elke petrischaal van 90 bij 15 millimeter. Bereid DMSO-platen door 20 milliliter DMSO-medium toe te voegen aan elk petrischaaltje en laat de platen minstens drie uur op kamertemperatuur om te stollen.Verspreid 800 microliters van vortexed E.coli of P.aeruginosa cultuur op elke verse NGM plaat, en laat de platen te drogen in een 20-graden Celsius incubator 's nachts. Was de leeftijdsgesynchroniseerde L4-larven met S-buffer en breng ongeveer 500 wormen over naar de NGM-platen met verschillende bacteriën en chemicaliën. Dan, incubeer de platen op 20 graden Celsius voor 48 uur.Bereid de FITC-dextran-aangevulde platen door het mengen van twee milliliter van warmte-geïnactiveerde E.coli met vier milligram FITC-dextran. Voeg 100 microliter van het mengsel toe aan elk van de 20 verse NGM agar-borden en laat de platen een uur drogen op een schone labbank. Na 48 uur behandeling was je de wormen met S-buffer, breng je ze over naar FITC-dextran-supplemented plates en naar NGM-platen zonder FITC-dextran, en broed ze 's nachts uit.De volgende dag, was de wormen met S-buffer, en laat ze kruipen in de verse NGM agar plaat voor een uur. Voeg 50 microliter van 4% formaldehyde toe aan elke put van een zwarte, 96-well, platte bodem plaat, en breng ongeveer 50 wormen in elke put. Na een tot twee minuten, verwijder alle formaldehyde, en voeg 100 microliter van montage medium in elke put.Formaldehyde is een giftige chemische stof en moet met zorg worden behandeld. Als u fluorescerende beelden wilt vastleggen, drukt u op het pictogram Deksel openen in de beeldsoftware en plaatst u de plaat in de machine. Klik op Instellen, selecteer het plaattype en voeg de kanalen brightfield en EGFP toe.Als u de indeling wilt aanpassen, gaat u naar de indelingsselectie en selecteert u Bijhouden. Stel de eerste foto in op één micrometer, het aantal vlakken op 10 en de afstand tot één micrometer. Selecteer een van de behandelingsputten en één opnameveld en druk op Test in de sectie Experiment uitvoeren.Als de afbeeldingen bevredigend zijn, gaat u terug naar de sectie Setup en drukt u op het pictogram Opnieuw instellen. Selecteer vervolgens alle doelputten en een geschikt aantal van de opnamevelden. Ga naar Experiment uitvoeren, voer de naam van de plaat in en druk op Start.Als u de fluorescentieintensiteit wilt meten, gaat u naar de sectie Beeldanalyse, voert u de afbeelding in en zoekt u de cel door het EGFP-kanaal en de methode B.Pas de parameters aan op basis van de routebeschrijving van het manuscript en kies het gemiddelde als uitvoer. Druk op het pictogram Toepassen om de instelling op te slaan. Verkrijg een warmtekaart en een gegevenstabel door naar de sectie Evaluatie te gaan en de uitleesparameter aan te passen en start vervolgens de evaluatie.C.elegans vertoonden een aanzienlijke toename van FITC-dextran fluorescentie na incubatie met P.aeruginosa in vergelijking met de andere twee bacteriestammen, wat aangeeft dat P.aeruginosa meer vitale schade aan de epitheliale darmbarrière en verhoogde darmdoorlatendheid veroorzaakte. Levende en warmte-geïnactiveerde P.aeruginosa veroorzaakten zeer verschillende effecten op de darmpermeabiliteit in C.elegans. Bij warmte-inactivatie geven zowel de fluorescentiebeelden als de statistische gegevens aan dat P.aeruginosa geen toxiciteit voor aaltjes heeft veroorzaakt.Een 48-uurs co-behandeling met DIM verminderde de FITC-dextrante fluorescentie intensiteit in de darmen van wormen blootgesteld aan P.aeruginosa, waaruit blijkt dat DIM kan worden beschouwd als een goed natuurlijk product om darmpermeabiliteit disfunctie veroorzaakt door bacteriële infecties te genezen. Het is belangrijk om te onthouden dat tijdens de voorbereiding van de FITC-dextran-gecoate platen, moet u de blootstelling aan licht te minimaliseren als gevolg van de lichtgevoeligheid van FITC-dextran. Deze techniek kan worden gebruikt om de pathogene en probiotische effecten van darmbacteriën en hun actieve componenten te bepalen door het testen van de bacteriën, evenals hun chemische samenstelling.

Research

JoVE Journal

Medicine

Measuring the Effects of Bacteria and Chemicals on the Intestinal Permeability of Caenorhabditis elegans

Measuring the Strength of Mice

Het meten van de sterkte van Muizen

Kondziela7 devised the inverted screen test and published it in 1964. It is a test of muscle strength using all four limbs. Most normal mice easily score ...

Measuring Frailty in HIV-infected Individuals. Identification of Frail Patients is the First Step to Amelioration and Reversal of Frailty

Meten Frailty bij HIV-geïnfecteerde individuen. Identificatie van Frail patiënten is de eerste stap naar Verbetering en omkering van Frailty

A simple, validated protocol consisting of a battery of tests is available to identify elderly patients with frailty syndrome. This syndrome of decreased ...

Non-invasive Assessment of the Efficacy of New Therapeutics for Intestinal Pathologies Using Serial Endoscopic Imaging of Live Mice

Niet-invasieve evaluatie van de werkzaamheid van nieuwe therapieën voor Intestinale Pathologieën gebruik van een serieel Endoscopische Imaging van levende muizen

Animal models of inflammatory bowel disease (IBD) and colorectal cancer (CRC) have provided significant insight into the cell intrinsic and extrinsic ...

Ex Vivo Intestinal Sacs to Assess Mucosal Permeability in Models of Gastrointestinal Disease

Ex Vivo Intestinal Sacs to Assess Mucosal Permeability in Models of Gastrointestinal Disease

Ex Vivo Intestinale Sacs mucosale permeabiliteit beoordelen Modellen van gastro-intestinale aandoeningen

The epithelial barrier is the first innate defense of the gastrointestinal tract and selectively regulates transport from the lumen to the underlying ...

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

Fosfor-31 magnetische resonantie spectroscopie: een instrument voor het meten<em&gt; In Vivo</em&gt; Mitochondrial Oxydatieve Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

Skeletal muscle mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) capacity, which is critically important in health and disease, can be measured in vivo ...

Analyzing Beneficial Effects of Nutritional Supplements on Intestinal Epithelial Barrier Functions During Experimental Colitis

Het analyseren van gunstige effecten van voedingssupplementen op darmepitheel Barrier Functies tijdens de Experimental Colitis

Inflammatory bowel diseases (IBD), including Crohn&#39;s disease and ulcerative colitis, are chronic relapsing disorders of the intestines. They cause ...

Measuring the Effect of Chemicals on the Growth and Reproduction of Caenorhabditis elegans

Measuring the Effect of Chemicals on the Growth and Reproduction of Caenorhabditis elegans

Meten van het Effect van chemische stoffen op de groei en voortplanting van Caenorhabditis elegans

Toxicological evaluation is crucial for understanding the effects of chemicals on living organisms in basic and applied biological science fields. A ...

A Murine Model of Fetal Exposure to Maternal Inflammation to Study the Effects of Acute Chorioamnionitis on Newborn Intestinal Development

Een murien model van foetale blootstelling aan maternale ontsteking om de effecten van acute chorioamnionitis op de ontwikkeling van pasgeborenen te bestuderen

Chorioamnionitis is a common precipitant of preterm birth and is associated with many of the morbidities of prematurity, including necrotizing ...

Isolation of Murine Intestinal Mesenchyme Resulting in a High Yield of Telocytes

Isolatie van muizendarmmesenchym resulterend in een hoge opbrengst van telocyten

The murine small intestine, or colon mesenchyme, is highly heterogenous, containing distinct cell types including blood and lymphatic endothelium, nerves, ...

Assessing Strength Exercise Volume and Its Impact on Insulin Sensitivity in Obesity

Randomized Controlled Trial to Study the Acute Effects of Strength Exercise on Insulin Sensitivity in Obese Adults

Exploring the Impact of Reduced Resistance Exercise Volume on Metabolic Health (Video) | JoVE

Gerandomiseerde gecontroleerde studie om de acute effecten van krachttraining op insulinegevoeligheid bij zwaarlijvige volwassenen te bestuderen

An acute session of strength exercise (SE) ameliorates insulin sensitivity (IS) for several hours; however, the effects of SE volume (i.e., number of ...