Name: measuring the effects of bacteria and chemicals on the intestinal permeability of caenorhabditis elegans
Uploaded: 2019-12-03T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring the Effects of Bacteria and Chemicals on the Intestinal Permeability of Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Cette étude a été soutenue par une subvention de recherche intra-muros de l'Institut coréen des sciences et de la technologie (2E29563).

1. Préparation de P. aeruginosa PAO1 et Escherichia coli OP50 Culture
<ol><li>Préparer 500 ml de luria-Bertani stérilisé (LB) moyen (tableau 1) et inoculer une seule colonie de P. aeruginosa dans le milieu. Incuber la culture de 14 à 15 h à 37 oC avec une vitesse de secousse de 150 tr/min.</li>
	<li>Répartir également la culture bactérienne en deux tubes centrifugeuses de 500 ml et centrifuger les tubes à 3 220 x g à 4 oC pendant 30 min.</li>
	<li>Retirez ...

<ol>
	<li>Bischoff, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+permeability&#8211;a+new+target+for+disease+prevention+and+therapy.">Intestinal permeability&#8211;a new target for disease prevention and therapy.</a> BMC Gastroenterology. 14 (1), 189 (2014).</li><li>Peng, L., Li, Z. R., Green, R. S., Holzman, I. R., Lin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Butyrate+enhances+the+intestinal+barrier+by+facilitating+tight+junction+assembly+via+activation+of+AMP-activated+protein+kinase+in+Caco-2+cell+monolayers.">Butyrate enhances the intestinal barrier by facilitating tight junction assembly via activation of AMP-activated protein kinase in Caco-2 cell monolayers.</a> The Journal of Nutrition. 139 (9), 1619-1625 (2009).</li><li>Ren, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+basis+for+intestinal+barrier+against+the+toxicity+of+graphene+oxide.">Developmental basis for intestinal barrier against the toxicity of graphene oxide.</a> Particle Fibre Toxicology. 15 (1), 26 (2018).</li><li>Kissoyan, K. A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+C.+elegans+microbiota+protects+against+infection+via+production+of+a+cyclic+lipopeptide+of+the+viscosin+group.">Natural C. elegans microbiota protects against infection via production of a cyclic lipopeptide of the viscosin group.</a> Current Biology. 29 (6), 1030-1037 (2019).</li><li>Gelino, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+autophagy+improves+healthspan+and+longevity+in+C.+elegans+during+dietary+restriction.">Intestinal autophagy improves healthspan and longevity in C. elegans during dietary restriction.</a> PLoS Genetics. 12 (7), 1006135 (2016).</li><li>Escorcia, W., Ruter, D. L., Nhan, J., Curran, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+lipid+abundance+and+evaluation+of+lipid+distribution+in+Caenorhabditis+elegans+by+Nile+red+and+oil+red+O+staining.">Quantification of lipid abundance and evaluation of lipid distribution in Caenorhabditis elegans by Nile red and oil red O staining.</a> Journal of Visualized Experiments. (133), e57352 (2018).</li><li>Johnson, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advantages+and+disadvantages+of+Caenorhabditis+elegans+for+aging+research.">Advantages and disadvantages of Caenorhabditis elegans for aging research.</a> Experimental Gerontology. 38 (11-12), 1329-1332 (2003).</li><li>Culetto, E., Sattelle, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+Caenorhabditis+elegans+in+understanding+the+function+and+interactions+of+human+disease+genes.">A role for Caenorhabditis elegans in understanding the function and interactions of human disease genes.</a> Human Molecular Genetics. 9 (6), 869-877 (2000).</li><li>Hubbard, E. J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+germ+line:+A+model+for+stem+cell+biology.">Caenorhabditis elegans germ line: A model for stem cell biology.</a> Developmental Dynamics. 236 (12), 3343-3357 (2007).</li><li>Park, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probiotic+Lactobacillus+fermentum+strain+JDFM216+stimulates+the+longevity+and+immune+response+of+Caenorhabditis+elegans+through+a+nuclear+hormone+receptor.">Probiotic Lactobacillus fermentum strain JDFM216 stimulates the longevity and immune response of Caenorhabditis elegans through a nuclear hormone receptor.</a> Scientific Reports. 8, 7441 (2018).</li><li>Kim, Y., Mylonakis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+immune+conditioning+with+the+probiotic+bacterium+Lactobacillus+acidophilus+strain+NCFM+enhances+gram-positive+immune+responses.">Caenorhabditis elegans immune conditioning with the probiotic bacterium Lactobacillus acidophilus strain NCFM enhances gram-positive immune responses.</a> Infection and Immunity. 80 (7), 2500-2508 (2012).</li><li>Nakagawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+and+mechanisms+of+prolongevity+induced+by+Lactobacillus+gasseri+SBT2055+in+Caenorhabditis+elegans.">Effects and mechanisms of prolongevity induced by Lactobacillus gasseri SBT2055 in Caenorhabditis elegans.</a> Aging Cell. 15 (2), 227-236 (2016).</li><li>Dinh, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cranberry+extract+standardized+for+proanthocyanidins+promotes+the+immune+response+of+Caenorhabditis+elegans+to+Vibrio+cholerae+through+the+p38+MAPK+pathway+and+HSF-1.">Cranberry extract standardized for proanthocyanidins promotes the immune response of Caenorhabditis elegans to Vibrio cholerae through the p38 MAPK pathway and HSF-1.</a> PLoS One. 9 (7), 103290 (2014).</li><li>Vayndorf, E. M., Lee, S. S., Liu, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+apple+extracts+increase+lifespan,+healthspan+and+resistance+to+stress+in+Caenorhabditis+elegans.">Whole apple extracts increase lifespan, healthspan and resistance to stress in Caenorhabditis elegans.</a> Journal of Functional Foods. 5 (3), 1236-1243 (2013).</li><li>Huycke, M. M., Abrams, V., Moore, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enterococcus+faecalis+produces+extracellular+superoxide+and+hydrogen+peroxide+that+damages+colonic+epithelial+cell+DNA.">Enterococcus faecalis produces extracellular superoxide and hydrogen peroxide that damages colonic epithelial cell DNA.</a> Carcinogenesis. 23 (3), 529-536 (2002).</li><li>Laughlin, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+key+role+of+Pseudomonas+aeruginosa+PA-I+lectin+on+experimental+gut-derived+sepsis.">The key role of Pseudomonas aeruginosa PA-I lectin on experimental gut-derived sepsis.</a> Annals of Surgery. 232 (1), 133-142 (2000).</li><li>Huang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3,3'-Diindolylmethane+decreases+VCAM-1+expression+and+alleviates+experimental+colitis+via+a+BRCA1-dependent+antioxidant+pathway.">3,3'-Diindolylmethane decreases VCAM-1 expression and alleviates experimental colitis via a BRCA1-dependent antioxidant pathway.</a> Free Radical Biology, Medicine. 50 (2), 228-236 (2011).</li><li>Jeon, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Oral+Administration+of+3,3'-Diindolylmethane+on+Dextran+Sodium+Sulfate-Induced+Acute+Colitis+in+Mice.">Effect of Oral Administration of 3,3'-Diindolylmethane on Dextran Sodium Sulfate-Induced Acute Colitis in Mice.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 64, 7702-7709 (2016).</li><li>Kim, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3,3'-Diindolylmethane+improves+intestinal+permeability+dysfunction+in+cultured+human+intestinal+cells+and+the+model+animal+Caenorhabditis+elegans.">3,3'-Diindolylmethane improves intestinal permeability dysfunction in cultured human intestinal cells and the model animal Caenorhabditis elegans.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 67 (33), 9277-9285 (2019).</li><li>Lee, S. Y., Kang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+the+Effect+of+Chemicals+on+the+Growth+and+Reproduction+of+Caenorhabditis+elegans.">Measuring the Effect of Chemicals on the Growth and Reproduction of Caenorhabditis elegans.</a> Journal of Visualized Experiments. (128), e56437 (2017).</li><li>Schmeisser, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+ROS+signaling+rather+than+AMPK/sirtuin-mediated+energy+sensing+links+dietary+restriction+to+lifespan+extension.">Neuronal ROS signaling rather than AMPK/sirtuin-mediated energy sensing links dietary restriction to lifespan extension.</a> Molecular Metabolism. 2 (2), 92-102 (2013).</li><li>Lee, S. Y., Kim, J. Y., Jung, Y. J., Kang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxicological+evaluation+of+the+topoisomerase+inhibitor,+etoposide,+in+the+model+animal+Caenorhabditis+elegans+and+3T3-L1+normal+murine+cells.">Toxicological evaluation of the topoisomerase inhibitor, etoposide, in the model animal Caenorhabditis elegans and 3T3-L1 normal murine cells.</a> Environmental Toxicology. 32 (6), 1836-1843 (2017).</li><li>Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+Caenorhabditis+elegans+life+span+on+solid+media.">Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media.</a> Journal of Visualized Experiments. (27), e1152 (2009).</li><li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Caenorhabditis+elegans+methods:+synchronization+and+observation.">Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation.</a> Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).</li><li>Al Atya, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probiotic+potential+of+Enterococcus+faecalis+strains+isolated+from+meconium.">Probiotic potential of Enterococcus faecalis strains isolated from meconium.</a> Frontiers in Microbiology. 6, 227 (2015).</li><li>Hanchi, H., Mottawea, W., Sebei, K., Hammami, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Genus+Enterococcus:+Between+Probiotic+Potential+and+Safety+Concerns-An+Update.">The Genus Enterococcus: Between Probiotic Potential and Safety Concerns-An Update.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 1791 (2018).</li><li>Pollack, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+exotoxin+A+in+pseudomonas+disease+and+immunity.">The role of exotoxin A in pseudomonas disease and immunity.</a> Reviews of Infectious Diseases. 5, 979-984 (1983).</li><li>Vasil, M. L., Liu, P. V., Iglewski, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature-dependent+inactivating+factor+of+Pseudomonas+aeruginosa+exotoxin+A.">Temperature-dependent inactivating factor of Pseudomonas aeruginosa exotoxin A.</a> Infection and Immunity. 13 (5), 1467-1472 (1976).</li><li>Horii, T., Muramatsu, H., Monji, A., Miyagishima, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Release+of+exotoxin+A,+peptidoglycan+and+endotoxin+after+exposure+of+clinical+Pseudomonas+aeruginosa+isolates+to+carbapenems+in+vitro.">Release of exotoxin A, peptidoglycan and endotoxin after exposure of clinical Pseudomonas aeruginosa isolates to carbapenems in vitro.</a> Chemotherapy. 51 (6), 324-331 (2005).</li><li>Kirikae, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+characterization+of+endotoxins+released+from+antibiotic-treated+Pseudomonas+aeruginosa+and+Escherichia+coli.">Biological characterization of endotoxins released from antibiotic-treated Pseudomonas aeruginosa and Escherichia coli.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 42 (5), 1015-1021 (1998).</li><li>Morlon-Guyot, J., Mere, J., Bonhoure, A., Beaumelle, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+of+Pseudomonas+aeruginosa+exotoxin+A+is+dispensable+for+cell+intoxication.">Processing of Pseudomonas aeruginosa exotoxin A is dispensable for cell intoxication.</a> Infection and Immunity. 77 (7), 3090-3099 (2009).</li><li>Kim, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3,3'-diindolylmethane+attenuates+colonic+inflammation+and+tumorigenesis+in+mice.">3,3'-diindolylmethane attenuates colonic inflammation and tumorigenesis in mice.</a> Inflammatory Bowel Diseases. 15 (8), 1164-1173 (2009).</li><li>Kanmani, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probiotics+and+its+functionally+valuable+products-a+review.">Probiotics and its functionally valuable products-a review.</a> Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 53 (6), 641-658 (2013).</li><li>Nguyen, M. T., Gotz, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipoproteins+of+Gram-Positive+Bacteria:+Key+Players+in+the+Immune+Response+and+Virulence.">Lipoproteins of Gram-Positive Bacteria: Key Players in the Immune Response and Virulence.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 80 (3), 891-903 (2016).</li></ol>

En utilisant cette nouvelle méthode pour déterminer la perméabilité intestinale chez C. elegans, qui combine la microscopie automatisée de fluorescence et l'analyse quantitative d'image, les différences causées par les micro-organismes ou les produits chimiques intestinaux peuvent être déterminées in vivo, spécifiquement dans l'intestin de C. elegans. Ce protocole est utile pour les études de perméabilité intestinale et applicable à de nombreuses tâches, telles que la détermination des ...

La perméabilité intestinale est considérée comme l'un des principaux obstacles liés au microbiote intestinal et à l'immunité muqueuse et est susceptible d'être affectée par plusieurs facteurs, tels que les modifications du microbiote intestinal, l'affaiblissement épithélial ou les altérations de la couche de muqueuse1. Des articles récents ont rapporté des protocoles efficaces pour mesurer la perméabilité intestinale des cellules intestinales humaines cultivées en analysant les taux de flux de fluorescence à travers la couche de cellules intestinales2, mais moins d'articles de recherche présentent une procédure appropriée pour mesurer la perméabilité intestinale dans les nématodes, en particulier chez C. elegans, en utilisant la coloration FITC-dextran.
Il existe deux protocoles représentatifs pour mesurer la perméabilité intestinale chez C. elegans à l'aide du rouge du Nil3 et de l'erioglaucine disodium (ou de l'assème schtroumpf)4,5. Dans ce protocole, nous avons utilisé FITC-dextran (poids moléculaire moyen 10 000), qui a un poids moléculaire beaucoup plus élevé que le rouge nil (MW 318,37) et le disodium erioglaucine (MW 792,85). FITC-dextran est plus semblable que le rouge du Nil ou les colorants disodium erioglaucine aux nutriments macromoléculaires réels tels que les hydrates de carbone, qui sont absorbés par la couche intestinale. La perméabilité intestinale de C. elegans nourris avec de l'erioglaucine disodium (colorant bleu Schtroumpf) peut être facilement évaluée sans microscopie de fluorescence. Cependant, dans l'analyse schtroumpf, l'analyse quantitative de la perméabilité intestinale est difficile en raison de l'absence de normalisation et doit être évaluée manuellement4,5. Dans le cas de l'assidu rouge du Nil, le rouge du Nil tache également des gouttelettes lipidiques dans les cellules, ce qui peut interférer avec la détermination exacte de la perméabilité intestinale chez C. elegans6. Les protocoles actuels permettent une analyse quantitative rapide et précise de la perméabilité intestinale chez C. elegans traités avec diverses bactéries intestinales et produits chimiques tout en évitant la coloration lipidique non spécifique.
C. elegans est un modèle typique dans les domaines biologiques en raison de son prix abordable, manipulation facile, questions limitées d'éthique animale, et la durée de vie courte, ce qui est bénéfique pour l'expérimentation rapide7. En particulier, après la publication de l'ensemble du génome de C. elegans, près de 40 % des gènes du génome de C. elegans se sont avérés orthologues pour les gènes qui causent des maladies humaines8. En outre, le corps transparent permet l'observation à l'intérieur de l'organisme, ce qui est avantageux pour la recherche d'événements cellulaires et pour les applications de fluorescence en biologie cellulaire, par exemple, la coloration des cellules souches avec DAPI ou immunohistochimie9. C. elegans est souvent utilisé comme animal expérimental pour étudier l'interaction entre le microbiote intestinal et l'hôte; en outre, C. elegans est utilisé pour dépister les bactéries probiotiques favorisant la santé10,11,12 ainsi que des produits chimiques alimentaires favorisant la santé intestinale13,14.
Pseudomonas aeruginosa et Enterococcus faecalis sont des bactéries intestinales bien connues qui affectent négativement le système gastro-intestinal, en particulier les cellules épithéliales du côlon du tractus intestinal15,16. Par conséquent, la mesure de la perméabilité intestinale déclenchée par ces bactéries est nécessaire pour le dépistage et le développement de nouveaux médicaments qui peuvent récupérer et réduire les dommages causés par l'inflammation bactérienne et l'infection. Dans ce protocole, nous avons testé les effets de ces bactéries intestinales sur la perméabilité intestinale de C. elegans.
Nous rapportons également un protocole optimisé pour tester des produits chimiques sur la perméabilité intestinale de C. elegans. À cette fin, nous avons utilisé 3,3'-diindolylméthane (DIM) comme un produit chimique modèle parce que DIM est un composé de métabolite bioactif dérivé de l'indole-3-carbinol, qui est présent dans les usines alimentaires Debrasica, et a été rapporté pour avoir des effets thérapeutiques sur les MII chez les souris17,18. En outre, nous avons récemment découvert que DIM améliore le dysfonctionnement de perméabilité intestinale dans les deux cellules intestinales humaines cultivées ainsi que le modèle nématode C. elegans19.
Dans cette étude, nous avons utilisé trois conditions expérimentales différentes. Tout d'abord, nous avons mesuré les effets des différentes bactéries, P. aeruginosa et E. faecalis, sur la perméabilité intestinale (Figure 1). Deuxièmement, nous avons mesuré les effets de P. aeruginosa vivant et inactivé par la chaleur sur la perméabilité intestinale (Figure 2). Troisièmement, nous avons mesuré les effets du DIM (un modèle chimique) sur la perméabilité intestinale de C. elegans nourris avec P. aeruginosa (Figure 3).
L'objectif de cette étude était de développer des protocoles optimisés qui mesurent la perméabilité intestinale de C. elegans, qui est modifié par le traitement avec diverses bactéries intestinales ainsi qu'avec des produits chimiques.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >3,3&#8217;-diindolylmethane&#160;</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >D9568</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >90&#215;15 mm Petri dishes</td>
			<td >SPL Life Sciences, South Korea</td>
			<td >10090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >60&#215;15 mm Petri dishes</td>
			<td >SPL Life Sciences, South Korea</td>
			<td >10060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bactor Agar</td>
			<td >Beckton Dickinson</td>
			<td >REF. 214010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Formaldehyde solution&#160;</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >F1635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Brain Heart Infusion (BHI)&#160;</td>
			<td >Becton Dickinson</td>
			<td >REF. 237500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Caenorhabditis elegans N2</td>
			<td >Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td ></td>
			<td>Wild type&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cholesterol</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >C3045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Costa Assay Plate, 96 Well Black With Clear Flat Bottom Non-treated, No Lid Polystyrene</td>
			<td >Corning Incorporated</td>
			<td >REF. 3631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dimethyl sulfoxide</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Enterococcus faecalis KCTC 3206</td>
			<td >Korean Collection for Type Culture</td>
			<td >KCTC NO. 3206</td>
			<td>Falcutative anaerobic</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Escherichia coli OP50</td>
			<td >Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fluorescein isothiocyanate - dextran</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >FD10S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Harmony software&#160;</td>
			<td >PerkinElmer</td>
			<td ></td>
			<td>verson 3.5</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Luria-Bertani LB medium</td>
			<td >Merck</td>
			<td >VM743185 626&#160; 1.10285.5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Magnesium sulfate heptahydrate&#160;</td>
			<td >Fisher Bioreagents</td>
			<td >BP2213-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fluoromount aqueous mounting medium</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >F4680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Operetta CLS High-Content Analysis System</td>
			<td >PerkinElmer</td>
			<td>&#160;HH16000000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Peptone</td>
			<td >Merck</td>
			<td >EMD 1.07213.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pseudomonas aeruginosa PA01</td>
			<td >Korean Collection for Type Culture</td>
			<td >KCTC NO. 1637</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium Chloride</td>
			<td >Fisher Bioreagents</td>
			<td >BP358-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Stereo Microscope</td>
			<td >Nikon, Japan</td>
			<td >SMZ800N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Yeast extract</td>
			<td >Becton Dickinson</td>
			<td >REF. 212750</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring the effects of bacteria and chemicals on the intestinal permeability of caenorhabditis elegans

Chez les organismes vivants, l'hyperperméabilité intestinale est un symptôme grave qui conduit à de nombreuses maladies inflammatoires de l'intestin (MII). Caenorhabditis elegans est un modèle animal non-mammalien qui est largement utilisé comme un système d'analyse en raison de sa courte durée de vie, la transparence, la rentabilité, et le manque de questions d'éthique animale. Dans cette étude, une méthode a été développée pour étudier les effets de différentes bactéries et 3,3'-diindolylmethane (DIM) sur la perméabilité intestinale de C. elegans avec un système d'analyse d'image à haut débit. Les vers ont été infectés par différentes bactéries intestinales ou cotraités avec DIM pendant 48 h et nourris avec de la fluorescéine isothiocyanate (FITC)-dextran pendant la nuit. Ensuite, la perméabilité intestinale a été examinée en comparant les images de fluorescence et l'intensité de fluorescence à l'intérieur des corps de ver. Cette méthode peut également avoir le potentiel d'identifier les bactéries intestinales probiotiques et pathogènes qui affectent la perméabilité intestinale dans le modèle animal et est efficace pour examiner les effets des produits chimiques nocifs ou favorisant la santé sur la perméabilité intestinale et la santé intestinale. Cependant, ce protocole a également quelques limitations considérables au niveau génétique, particulièrement pour déterminer quels gènes sont modifiés pour commander la maladie, parce que cette méthode est principalement employée pour la détermination phénotypique. En outre, cette méthode se limite à déterminer exactement quels substrats pathogènes causent l'inflammation ou augmentent la perméabilité des intestins des vers pendant l'infection. Par conséquent, d'autres études approfondies, y compris l'étude du mécanisme génétique moléculaire à l'aide de bactéries mutantes et de nématodes ainsi que l'analyse des composants chimiques des bactéries, sont nécessaires pour évaluer pleinement la fonction des bactéries et des produits chimiques dans la détermination de la perméabilité intestinale.

Après l'incubation avec P. aeruginosa PAO1, C. elegans a montré une augmentation significative de la fluorescence FITC-dextran dans le corps de ver comparée à la fluorescence montrée après l'incubation avec les deux autres souches bactériennes (figure 1). Les intensités de fluorescence des vers nourris avec E. coli OP50, P. aeruginosa PAO1 et E. faecalis KCTC3206 étaient respectivement de 100,0 à 6,6, 369,7 et 105,6 à 10,6 %. Les donné...

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Measuring the Effects of Bacteria and Chemicals on the Intestinal Permeability of Caenorhabditis elegans

Ce protocole décrit comment mesurer la perméabilité intestinale de Caenorhabditis elegans. Cette méthode est utile pour la recherche biologique fondamentale sur la santé intestinale liée à l'interaction entre les bactéries intestinales et leur hôte et pour le dépistage pour identifier les agents probiotiques et chimiques pour guérir le syndrome de l'intestin qui fuit et les maladies inflammatoires de l'intestin.

Mesurer les effets des bactéries et des produits chimiques sur la perméabilité intestinale de Caenorhabditis elegans

In living organisms, intestinal hyperpermeability is a serious symptom that leads to many inflammatory bowel diseases (IBDs). Caenorhabditis elegans is a ...

Cette méthode sera utile pour les études biologiques de base liées à l’interaction entre le microbiote intestinal et la santé intestinale. En outre, ce protocole peut être utilisé pour le dépistage des probiotiques potentiels et nutraceutiques pour guérir les problèmes de santé intestinale, tels que le syndrome intestinal qui fuit et les maladies inflammatoires de l’intestin. Ce protocole utilise un système d’imagerie à haut débit pour permettre une analyse quantitative rapide et précise de la perméabilité intestinale chez C.elegans traité avec diverses bactéries et produits chimiques.Nous recommandons qu’un scientifique qui n’est pas familier avec cette technique limite le nombre d’échantillons afin d’éviter les erreurs d’beling et d’autres erreurs. Cette procédure se compose de nombreuses étapes qui nécessitent une démonstration visuelle, comme le transfert de vers à des plaques de 96 puits et l’utilisation de la machine Operetta, ainsi que le logiciel Harmony. Commencez par préparer 500 millilitres de LB stérile moyen.Inoculer une seule colonie de P.aeruginosa dans le milieu, et incuber la culture pendant 14 à 15 heures à 37 degrés Celsius tout en secouant à 150 rpm. Le lendemain, répartir uniformément la culture bactérienne en deux tubes de 500 millilitres et les centrifuger à 3 220 fois g et quatre degrés Celsius pendant 30 minutes. Retirer le supernatant, en laissant 25 millilitres dans chaque tube, pour un volume total restant de 50 millilitres, puis résuspendez la pastille bactérienne.Conserver la culture bactérienne à quatre degrés Celsius jusqu’à ce qu’elle soit prête à l’emploi. Pour tester les effets des bactéries sur la perméabilité intestinale de C.elegans, retirez les cultures du réfrigérateur et vortexez-les complètement. Ajouter un total de 800 microlitres à chaque plaque de NGM fraîche et laisser sécher les plaques dans un incubateur de 20 degrés Celsius pendant la nuit.Pour préparer les assiettes DIM, ajouter 50 millilitres d’agar NGM moyen dans une bouteille de DIM contenant du bouillon NGM, et bien mélanger. Verser ensuite 20 millilitres de milieu dans chaque boîte de Pétri de 90 x 15 millimètres. Préparer les assiettes DMSO en ajoutant 20 millilitres de DMSO contenant du NGM moyen à chaque boîte de Pétri, et laisser les assiettes à température ambiante pendant au moins trois heures pour se solidifier.Étendre 800 microlitres d’E.coli vortex ou de culture P.aeruginosa sur chaque plaque NGM fraîche, et laisser sécher les plaques dans un incubateur de 20 degrés Celsius pendant la nuit. Lavez les larves L4 synchronisées par âge avec le tampon S et transférez environ 500 vers dans les plaques NGM contenant différentes bactéries et produits chimiques. Puis, incuber les plaques à 20 degrés Celsius pendant 48 heures.Préparer les plaques complétées par fitc-dextran en mélangeant deux millilitres d’E.coli inactivé par la chaleur avec quatre milligrammes de FITC-dextran. Ajouter 100 microlitres du mélange à chacune des 20 assiettes fraîches d’agar NGM et laisser sécher les assiettes pendant une heure sur un banc de laboratoire propre. Après 48 heures de traitement, lavez les vers avec du tampon S, transférez-les dans des assiettes complétées par fitc-dextran et dans des plaques NGM sans FITC-dextran, et incubez les plaques pendant la nuit.Le lendemain, lavez les vers avec du tampon S et laissez-les ramper dans la plaque d’agar NGM fraîche pendant une heure. Ajouter 50 microlitres de formaldéhyde de 4 % à chaque puits d’une plaque noire à fond plat de 96 puits et transférer environ 50 vers dans chaque puits. Après une à deux minutes, retirer tout le formaldéhyde et ajouter 100 microlitres de milieu de montage dans chaque puits.Le formaldéhyde est un produit chimique toxique et doit être manipulé avec soin. Pour capturer des images fluorescentes, appuyez sur l’icône Open Lid dans le logiciel d’imagerie et insérez la plaque dans la machine. Cliquez sur Configuration, sélectionnez le type de plaque et ajoutez les canaux brightfield et EGFP.Pour ajuster la mise en page, passez à la sélection Mise en page et sélectionnez Piste. Réglez la première image à un micromètre, le nombre d’avions à 10, et la distance à un micromètre. Sélectionnez l’un des puits de traitement et un champ de capture, et appuyez sur Test dans la section Exécuter l’expérience.Si les images sont satisfaisantes, retournez à la section Configuration et appuyez sur l’icône Réinitialisation. Ensuite, sélectionnez tous les puits cibles et un nombre approprié de champs de capture. Allez exécuter l’expérience, entrez le nom de la plaque et appuyez sur Démarrer.Pour mesurer l’intensité de fluorescence, rendez-vous à la section Analyse d’image, entrez l’image et trouvez la cellule en choisissant le canal EGFP et la méthode B.Ajustez les paramètres en fonction des instructions manuscrites, et choisissez la moyenne comme sortie. Appuyez sur l’icône Appliquer pour enregistrer la configuration. Obtenez une carte thermique et une table de données en vous rendre à la section Évaluation et ajustez le paramètre de lecture, puis commencez l’évaluation.C.elegans a montré une augmentation significative de la fluorescence fitc-dextran après incubation avec P.aeruginosa comparé aux deux autres souches bactériennes, indiquant que P.aeruginosa a causé des dommages plus vitaux à la barrière épithéliale d’intestin et à la perméabilité intestinale accrue. P.aeruginosa vivant et inactivé par la chaleur a déclenché des effets très différents sur la perméabilité intestinale chez C.elegans. Lors de l’inactivation thermique, les images de fluorescence et les données statistiques indiquent que P.aeruginosa n’a pas déclenché de toxicité pour les nématodes.Un co-traitement de 48 heures avec DIM a diminué de manière significative l’intensité de fluorescence fitc-dextran à l’intérieur des intestins des vers exposés à P.aeruginosa, ce qui démontre que dim peut être considéré comme un bon produit naturel pour guérir le dysfonctionnement de perméabilité intestinale causée par des infections bactériennes. Il est important de se rappeler que lors de la préparation des plaques enduites de FITC-dextran, vous devez minimiser l’exposition à la lumière en raison de la sensibilité à la lumière du FITC-dextran. Cette technique peut être utilisée pour déterminer les effets pathogènes et probiotiques des bactéries intestinales et de leurs composants actifs en testant les bactéries, ainsi que leur composition chimique.

Research

JoVE Journal

Medicine

Measuring the Effects of Bacteria and Chemicals on the Intestinal Permeability of Caenorhabditis elegans

Measuring the Strength of Mice

Mesure de la Force de souris

Kondziela7 devised the inverted screen test and published it in 1964. It is a test of muscle strength using all four limbs. Most normal mice easily score ...

Recherche

Médecine

Measuring Frailty in HIV-infected Individuals. Identification of Frail Patients is the First Step to Amelioration and Reversal of Frailty

Mesure de la fragilité chez les individus infectés par le VIH. L&#39;identification des patients fragiles est le premier pas vers l&#39;amélioration et l&#39;inversion de la fragilité

A simple, validated protocol consisting of a battery of tests is available to identify elderly patients with frailty syndrome. This syndrome of decreased ...

Non-invasive Assessment of the Efficacy of New Therapeutics for Intestinal Pathologies Using Serial Endoscopic Imaging of Live Mice

Évaluation non invasive de l&#39;efficacité de nouveaux traitements pour les pathologies intestinales en utilisant l&#39;imagerie endoscopique de série de souris vivantes

Animal models of inflammatory bowel disease (IBD) and colorectal cancer (CRC) have provided significant insight into the cell intrinsic and extrinsic ...

Ex Vivo Intestinal Sacs to Assess Mucosal Permeability in Models of Gastrointestinal Disease

Ex Vivo Intestinal Sacs to Assess Mucosal Permeability in Models of Gastrointestinal Disease

Ex Vivo intestinale Sacs pour évaluer la perméabilité de la muqueuse dans les modèles de maladies gastro-intestinales

The epithelial barrier is the first innate defense of the gastrointestinal tract and selectively regulates transport from the lumen to the underlying ...

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

Phosphore-31 Spectroscopie par résonance magnétique: un outil de mesure<em&gt; In Vivo</em&gt; Capacité mitochondrial phosphorylation oxydative dans le muscle squelettique humain

Skeletal muscle mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) capacity, which is critically important in health and disease, can be measured in vivo ...

Analyzing Beneficial Effects of Nutritional Supplements on Intestinal Epithelial Barrier Functions During Experimental Colitis

Analyse Effets bénéfiques des suppléments nutritionnels sur les fonctions épithéliales intestinales barrière Pendant Experimental Colite

Inflammatory bowel diseases (IBD), including Crohn&#39;s disease and ulcerative colitis, are chronic relapsing disorders of the intestines. They cause ...

Measuring the Effect of Chemicals on the Growth and Reproduction of Caenorhabditis elegans

Measuring the Effect of Chemicals on the Growth and Reproduction of Caenorhabditis elegans

Mesurer l’effet des produits chimiques sur la croissance et la Reproduction de Caenorhabditis elegans

Toxicological evaluation is crucial for understanding the effects of chemicals on living organisms in basic and applied biological science fields. A ...

A Murine Model of Fetal Exposure to Maternal Inflammation to Study the Effects of Acute Chorioamnionitis on Newborn Intestinal Development

Un modèle murin d’exposition foetale à l’inflammation maternelle pour étudier les effets de la chorioamnionite aiguë sur le développement intestinal nouveau-né

Chorioamnionitis is a common precipitant of preterm birth and is associated with many of the morbidities of prematurity, including necrotizing ...

Isolation of Murine Intestinal Mesenchyme Resulting in a High Yield of Telocytes

Isolement du mésenchyme intestinal murin entraînant un rendement élevé en télocytes

The murine small intestine, or colon mesenchyme, is highly heterogenous, containing distinct cell types including blood and lymphatic endothelium, nerves, ...

Assessing Strength Exercise Volume and Its Impact on Insulin Sensitivity in Obesity

Randomized Controlled Trial to Study the Acute Effects of Strength Exercise on Insulin Sensitivity in Obese Adults

Exploring the Impact of Reduced Resistance Exercise Volume on Metabolic Health (Video) | JoVE

Essai contrôlé randomisé pour étudier les effets aigus de l’exercice de force sur la sensibilité à l’insuline chez les adultes obèses

An acute session of strength exercise (SE) ameliorates insulin sensitivity (IS) for several hours; however, the effects of SE volume (i.e., number of ...