Name: measuring the effects of bacteria and chemicals on the intestinal permeability of caenorhabditis elegans
Uploaded: 2019-12-03T13:30:00
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Diese Studie wurde von einem Intramural Research Grant des Korea Institute of Science and Technology (2E29563) unterstützt.

1. Zubereitung von P. aeruginosa PAO1 und Escherichia coli OP50 Kultur
<ol><li>Bereiten Sie 500 ml sterilisierte Luria-Bertani (LB) medium (Tabelle 1) und impfen Sie eine einzelne Kolonie von P. aeruginosa in das Medium. Inkubieren Sie die Kultur für 14 bis 15 h bei 37 °C mit einer Schüttelgeschwindigkeit von 150 Rprossen.</li>
	<li>Gleichmäßig verteilen Sie die Bakterienkultur in zwei 500 ml Zentrifugenröhren und zentrifugieren Sie die Rohre bei 3.220 x g bei ...

<ol>
	<li>Bischoff, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+permeability&#8211;a+new+target+for+disease+prevention+and+therapy.">Intestinal permeability&#8211;a new target for disease prevention and therapy.</a> BMC Gastroenterology. 14 (1), 189 (2014).</li><li>Peng, L., Li, Z. R., Green, R. S., Holzman, I. R., Lin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Butyrate+enhances+the+intestinal+barrier+by+facilitating+tight+junction+assembly+via+activation+of+AMP-activated+protein+kinase+in+Caco-2+cell+monolayers.">Butyrate enhances the intestinal barrier by facilitating tight junction assembly via activation of AMP-activated protein kinase in Caco-2 cell monolayers.</a> The Journal of Nutrition. 139 (9), 1619-1625 (2009).</li><li>Ren, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+basis+for+intestinal+barrier+against+the+toxicity+of+graphene+oxide.">Developmental basis for intestinal barrier against the toxicity of graphene oxide.</a> Particle Fibre Toxicology. 15 (1), 26 (2018).</li><li>Kissoyan, K. A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+C.+elegans+microbiota+protects+against+infection+via+production+of+a+cyclic+lipopeptide+of+the+viscosin+group.">Natural C. elegans microbiota protects against infection via production of a cyclic lipopeptide of the viscosin group.</a> Current Biology. 29 (6), 1030-1037 (2019).</li><li>Gelino, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+autophagy+improves+healthspan+and+longevity+in+C.+elegans+during+dietary+restriction.">Intestinal autophagy improves healthspan and longevity in C. elegans during dietary restriction.</a> PLoS Genetics. 12 (7), 1006135 (2016).</li><li>Escorcia, W., Ruter, D. L., Nhan, J., Curran, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+lipid+abundance+and+evaluation+of+lipid+distribution+in+Caenorhabditis+elegans+by+Nile+red+and+oil+red+O+staining.">Quantification of lipid abundance and evaluation of lipid distribution in Caenorhabditis elegans by Nile red and oil red O staining.</a> Journal of Visualized Experiments. (133), e57352 (2018).</li><li>Johnson, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advantages+and+disadvantages+of+Caenorhabditis+elegans+for+aging+research.">Advantages and disadvantages of Caenorhabditis elegans for aging research.</a> Experimental Gerontology. 38 (11-12), 1329-1332 (2003).</li><li>Culetto, E., Sattelle, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+Caenorhabditis+elegans+in+understanding+the+function+and+interactions+of+human+disease+genes.">A role for Caenorhabditis elegans in understanding the function and interactions of human disease genes.</a> Human Molecular Genetics. 9 (6), 869-877 (2000).</li><li>Hubbard, E. J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+germ+line:+A+model+for+stem+cell+biology.">Caenorhabditis elegans germ line: A model for stem cell biology.</a> Developmental Dynamics. 236 (12), 3343-3357 (2007).</li><li>Park, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probiotic+Lactobacillus+fermentum+strain+JDFM216+stimulates+the+longevity+and+immune+response+of+Caenorhabditis+elegans+through+a+nuclear+hormone+receptor.">Probiotic Lactobacillus fermentum strain JDFM216 stimulates the longevity and immune response of Caenorhabditis elegans through a nuclear hormone receptor.</a> Scientific Reports. 8, 7441 (2018).</li><li>Kim, Y., Mylonakis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+immune+conditioning+with+the+probiotic+bacterium+Lactobacillus+acidophilus+strain+NCFM+enhances+gram-positive+immune+responses.">Caenorhabditis elegans immune conditioning with the probiotic bacterium Lactobacillus acidophilus strain NCFM enhances gram-positive immune responses.</a> Infection and Immunity. 80 (7), 2500-2508 (2012).</li><li>Nakagawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+and+mechanisms+of+prolongevity+induced+by+Lactobacillus+gasseri+SBT2055+in+Caenorhabditis+elegans.">Effects and mechanisms of prolongevity induced by Lactobacillus gasseri SBT2055 in Caenorhabditis elegans.</a> Aging Cell. 15 (2), 227-236 (2016).</li><li>Dinh, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cranberry+extract+standardized+for+proanthocyanidins+promotes+the+immune+response+of+Caenorhabditis+elegans+to+Vibrio+cholerae+through+the+p38+MAPK+pathway+and+HSF-1.">Cranberry extract standardized for proanthocyanidins promotes the immune response of Caenorhabditis elegans to Vibrio cholerae through the p38 MAPK pathway and HSF-1.</a> PLoS One. 9 (7), 103290 (2014).</li><li>Vayndorf, E. M., Lee, S. S., Liu, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+apple+extracts+increase+lifespan,+healthspan+and+resistance+to+stress+in+Caenorhabditis+elegans.">Whole apple extracts increase lifespan, healthspan and resistance to stress in Caenorhabditis elegans.</a> Journal of Functional Foods. 5 (3), 1236-1243 (2013).</li><li>Huycke, M. M., Abrams, V., Moore, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enterococcus+faecalis+produces+extracellular+superoxide+and+hydrogen+peroxide+that+damages+colonic+epithelial+cell+DNA.">Enterococcus faecalis produces extracellular superoxide and hydrogen peroxide that damages colonic epithelial cell DNA.</a> Carcinogenesis. 23 (3), 529-536 (2002).</li><li>Laughlin, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+key+role+of+Pseudomonas+aeruginosa+PA-I+lectin+on+experimental+gut-derived+sepsis.">The key role of Pseudomonas aeruginosa PA-I lectin on experimental gut-derived sepsis.</a> Annals of Surgery. 232 (1), 133-142 (2000).</li><li>Huang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3,3'-Diindolylmethane+decreases+VCAM-1+expression+and+alleviates+experimental+colitis+via+a+BRCA1-dependent+antioxidant+pathway.">3,3'-Diindolylmethane decreases VCAM-1 expression and alleviates experimental colitis via a BRCA1-dependent antioxidant pathway.</a> Free Radical Biology, Medicine. 50 (2), 228-236 (2011).</li><li>Jeon, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Oral+Administration+of+3,3'-Diindolylmethane+on+Dextran+Sodium+Sulfate-Induced+Acute+Colitis+in+Mice.">Effect of Oral Administration of 3,3'-Diindolylmethane on Dextran Sodium Sulfate-Induced Acute Colitis in Mice.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 64, 7702-7709 (2016).</li><li>Kim, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3,3'-Diindolylmethane+improves+intestinal+permeability+dysfunction+in+cultured+human+intestinal+cells+and+the+model+animal+Caenorhabditis+elegans.">3,3'-Diindolylmethane improves intestinal permeability dysfunction in cultured human intestinal cells and the model animal Caenorhabditis elegans.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 67 (33), 9277-9285 (2019).</li><li>Lee, S. Y., Kang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+the+Effect+of+Chemicals+on+the+Growth+and+Reproduction+of+Caenorhabditis+elegans.">Measuring the Effect of Chemicals on the Growth and Reproduction of Caenorhabditis elegans.</a> Journal of Visualized Experiments. (128), e56437 (2017).</li><li>Schmeisser, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+ROS+signaling+rather+than+AMPK/sirtuin-mediated+energy+sensing+links+dietary+restriction+to+lifespan+extension.">Neuronal ROS signaling rather than AMPK/sirtuin-mediated energy sensing links dietary restriction to lifespan extension.</a> Molecular Metabolism. 2 (2), 92-102 (2013).</li><li>Lee, S. Y., Kim, J. Y., Jung, Y. J., Kang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxicological+evaluation+of+the+topoisomerase+inhibitor,+etoposide,+in+the+model+animal+Caenorhabditis+elegans+and+3T3-L1+normal+murine+cells.">Toxicological evaluation of the topoisomerase inhibitor, etoposide, in the model animal Caenorhabditis elegans and 3T3-L1 normal murine cells.</a> Environmental Toxicology. 32 (6), 1836-1843 (2017).</li><li>Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+Caenorhabditis+elegans+life+span+on+solid+media.">Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media.</a> Journal of Visualized Experiments. (27), e1152 (2009).</li><li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Caenorhabditis+elegans+methods:+synchronization+and+observation.">Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation.</a> Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).</li><li>Al Atya, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probiotic+potential+of+Enterococcus+faecalis+strains+isolated+from+meconium.">Probiotic potential of Enterococcus faecalis strains isolated from meconium.</a> Frontiers in Microbiology. 6, 227 (2015).</li><li>Hanchi, H., Mottawea, W., Sebei, K., Hammami, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Genus+Enterococcus:+Between+Probiotic+Potential+and+Safety+Concerns-An+Update.">The Genus Enterococcus: Between Probiotic Potential and Safety Concerns-An Update.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 1791 (2018).</li><li>Pollack, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+exotoxin+A+in+pseudomonas+disease+and+immunity.">The role of exotoxin A in pseudomonas disease and immunity.</a> Reviews of Infectious Diseases. 5, 979-984 (1983).</li><li>Vasil, M. L., Liu, P. V., Iglewski, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature-dependent+inactivating+factor+of+Pseudomonas+aeruginosa+exotoxin+A.">Temperature-dependent inactivating factor of Pseudomonas aeruginosa exotoxin A.</a> Infection and Immunity. 13 (5), 1467-1472 (1976).</li><li>Horii, T., Muramatsu, H., Monji, A., Miyagishima, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Release+of+exotoxin+A,+peptidoglycan+and+endotoxin+after+exposure+of+clinical+Pseudomonas+aeruginosa+isolates+to+carbapenems+in+vitro.">Release of exotoxin A, peptidoglycan and endotoxin after exposure of clinical Pseudomonas aeruginosa isolates to carbapenems in vitro.</a> Chemotherapy. 51 (6), 324-331 (2005).</li><li>Kirikae, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+characterization+of+endotoxins+released+from+antibiotic-treated+Pseudomonas+aeruginosa+and+Escherichia+coli.">Biological characterization of endotoxins released from antibiotic-treated Pseudomonas aeruginosa and Escherichia coli.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 42 (5), 1015-1021 (1998).</li><li>Morlon-Guyot, J., Mere, J., Bonhoure, A., Beaumelle, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+of+Pseudomonas+aeruginosa+exotoxin+A+is+dispensable+for+cell+intoxication.">Processing of Pseudomonas aeruginosa exotoxin A is dispensable for cell intoxication.</a> Infection and Immunity. 77 (7), 3090-3099 (2009).</li><li>Kim, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3,3'-diindolylmethane+attenuates+colonic+inflammation+and+tumorigenesis+in+mice.">3,3'-diindolylmethane attenuates colonic inflammation and tumorigenesis in mice.</a> Inflammatory Bowel Diseases. 15 (8), 1164-1173 (2009).</li><li>Kanmani, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probiotics+and+its+functionally+valuable+products-a+review.">Probiotics and its functionally valuable products-a review.</a> Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 53 (6), 641-658 (2013).</li><li>Nguyen, M. T., Gotz, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipoproteins+of+Gram-Positive+Bacteria:+Key+Players+in+the+Immune+Response+and+Virulence.">Lipoproteins of Gram-Positive Bacteria: Key Players in the Immune Response and Virulence.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 80 (3), 891-903 (2016).</li></ol>

Durch die Verwendung dieser neuen Methode zur Bestimmung der Darmpermeabilität in C. elegans, die automatisierte Fluoreszenzmikroskopie und quantitative Bildanalyse kombiniert, können die Unterschiede, die durch Darmmikroorganismen oder Chemikalien verursacht werden, in vivo bestimmt werden, insbesondere im Darm von C. elegans. Dieses Protokoll ist nützlich für Darmdurchlässigkeitsuntersuchungen und gilt für viele Aufgaben, wie die Bestimmung der reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) unter Stressbedin...

Darmdurchlässigkeit gilt als eine der Hauptbarrieren im Zusammenhang mit der Darmmikrobiota und Schleimhautimmunität und wird wahrscheinlich von mehreren Faktoren beeinflusst werden, wie Darm-Mikrobiota-Modifikationen, Epithel-Inbußen, oder Schleimschicht-Änderungen1. Jüngste Arbeiten haben über wirksame Protokolle zur Messung der Darmdurchlässigkeit kultivierter menschlicher Darmzellen berichtet, indem die Fluoreszenzflussraten in der Darmzellschicht2analysiert werden, aber weniger Forschungsarbeiten stellen ein geeignetes Verfahren zur Messung der Darmdurchlässigkeit in Nematoden, insbesondere in C. elegans,durch Verwendung von FITC-dextran Färbung dar.
Es gibt zwei repräsentative Protokolle zur Messung der Darmdurchlässigkeit in C. elegans mit Nilrot3 und Erioglindinatrium (oder dem Schlumpftest)4,5. In diesem Protokoll verwendeten wir FITC-Dextran (durchschnittliches Molekulargewicht 10.000), das ein viel höheres Molekulargewicht hat als Nilrot (MW = 318,37) und Erioglindinatrium (MW = 792,85). FITC-Dextran ähnelt eher als Nilrot- oder Erioglin-Dinatriumfarbstoffe tatsächlichen makromolekularen Nährstoffen wie Kohlenhydraten, die durch die Darmschicht absorbiert werden. Die Darmdurchlässigkeit von C. elegans, die mit Erioglindinatrium (blauer Schlumpffarbstoff) gefüttert werden, kann ohne Fluoreszenzmikroskopie einfach ausgewertet werden. Im Schlumpftest ist die quantitative Analyse der Darmdurchlässigkeit jedoch aufgrund fehlender Standardisierung schwierig und sollte manuell bewertet werden4,5. Im Falle des Nilrot-Assays färbt Nilrot auch Lipidtröpfchen in Zellen, die die genaue Bestimmung der Darmdurchlässigkeit in C. elegans6stören können. Die vorliegenden Protokolle ermöglichen eine schnelle und präzise quantitative Analyse der Darmdurchlässigkeit bei C. elegans, die mit verschiedenen Darmbakterien und Chemikalien behandelt werden, und vermeiden dabei unspezifische Lipidfärbungen.
C. elegans ist ein typisches Modell in biologischen Bereichen aufgrund seines erschwinglichen Preises, einfacher Manipulation, begrenzter tierethischer Fragen und kurzer Lebensdauer, was für schnelle Experimente von Vorteil ist7. Insbesondere nach der Veröffentlichung des gesamten C. elegans Genoms wurden fast 40% der Gene im C. elegans Genom als orthologous für Gene gefunden, die menschliche Krankheiten verursachen8. Darüber hinaus ermöglicht der transparente Körper die Beobachtung im Inneren des Organismus, was für die Erforschung zellulärer Ereignisse und für Fluoreszenzanwendungen in der Zellbiologie von Vorteil ist, z.B. Stammzellfärbung mit DAPI oder Immunhistochemie9. C. elegans wird oft als Versuchstier verwendet, um die Wechselwirkung zwischen der Darmmikrobiota und dem Wirt zu untersuchen; darüber hinaus, C. elegans wird verwendet, um gesundheitsfördernde probiotische Bakterien zu überprüfen10,11,12 sowie diätetische Chemikalien zur Förderung der Darmgesundheit13,14.
Pseudomonas aeruginosa und Enterococcus faecalis sind bekannte Darmbakterien, die das Magen-Darm-System negativ beeinflussen, insbesondere die Kolonepithelzellen des Darmtraktes15,16. Daher ist die Messung der Darmdurchlässigkeit, die von diesen Bakterien ausgelöst wird, für das Screening und die Entwicklung neuer Medikamente notwendig, die sich erholen und die Schäden reduzieren können, die durch bakterielle Entzündungen und Infektionen verursacht werden. In diesem Protokoll haben wir die Auswirkungen dieser Darmbakterien auf die Darmdurchlässigkeit von C. elegansgetestet.
Wir berichten auch über ein optimiertes Protokoll zur Prüfung von Chemikalien auf die Darmdurchlässigkeit von C. elegans. Zu diesem Zweck verwendeten wir 3,3'-Diindolylmethane (DIM) als Modellchemikalie, da DIM eine bioaktive Metabolitverbindung ist, die aus Indol-3-Carbinol gewonnen wird, das in Brassica-Lebensmittelpflanzen vorhanden ist und nachweislich therapeutische Wirkungen auf IBD bei Mäusen17,18hat. Darüber hinaus entdeckten wir vor kurzem, dass DIM die Darmdurchlässigkeitsfunktionsstörung sowohl in kultivierten menschlichen Darmzellen als auch im Modell Nematode C. elegans19verbessert.
In dieser Studie haben wir drei verschiedene experimentelle Bedingungen verwendet. Zuerst haben wir die Auswirkungen der verschiedenen Bakterien, P. aeruginosa und E. faecalis, auf die Darmdurchlässigkeit gemessen (Abbildung 1). Zweitens haben wir die Auswirkungen von lebender und hitzeinaktivierter P. aeruginosa auf die Darmdurchlässigkeit gemessen (Abbildung 2). Drittens haben wir die Auswirkungen von DIM (einer Modellchemikalie) auf die Darmdurchlässigkeit von C. elegans gemessen, die mit P. aeruginosa gefüttert werden (Abbildung 3).
Ziel dieser Studie war es, optimierte Protokolle zu entwickeln, die die Darmdurchlässigkeit von C. elegansmessen, die durch die Behandlung mit verschiedenen Darmbakterien sowie mit Chemikalien verändert wird.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >3,3&#8217;-diindolylmethane&#160;</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >D9568</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >90&#215;15 mm Petri dishes</td>
			<td >SPL Life Sciences, South Korea</td>
			<td >10090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >60&#215;15 mm Petri dishes</td>
			<td >SPL Life Sciences, South Korea</td>
			<td >10060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bactor Agar</td>
			<td >Beckton Dickinson</td>
			<td >REF. 214010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Formaldehyde solution&#160;</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >F1635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Brain Heart Infusion (BHI)&#160;</td>
			<td >Becton Dickinson</td>
			<td >REF. 237500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Caenorhabditis elegans N2</td>
			<td >Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td ></td>
			<td>Wild type&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cholesterol</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >C3045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Costa Assay Plate, 96 Well Black With Clear Flat Bottom Non-treated, No Lid Polystyrene</td>
			<td >Corning Incorporated</td>
			<td >REF. 3631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dimethyl sulfoxide</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Enterococcus faecalis KCTC 3206</td>
			<td >Korean Collection for Type Culture</td>
			<td >KCTC NO. 3206</td>
			<td>Falcutative anaerobic</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Escherichia coli OP50</td>
			<td >Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fluorescein isothiocyanate - dextran</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >FD10S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Harmony software&#160;</td>
			<td >PerkinElmer</td>
			<td ></td>
			<td>verson 3.5</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Luria-Bertani LB medium</td>
			<td >Merck</td>
			<td >VM743185 626&#160; 1.10285.5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Magnesium sulfate heptahydrate&#160;</td>
			<td >Fisher Bioreagents</td>
			<td >BP2213-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fluoromount aqueous mounting medium</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >F4680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Operetta CLS High-Content Analysis System</td>
			<td >PerkinElmer</td>
			<td>&#160;HH16000000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Peptone</td>
			<td >Merck</td>
			<td >EMD 1.07213.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pseudomonas aeruginosa PA01</td>
			<td >Korean Collection for Type Culture</td>
			<td >KCTC NO. 1637</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium Chloride</td>
			<td >Fisher Bioreagents</td>
			<td >BP358-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Stereo Microscope</td>
			<td >Nikon, Japan</td>
			<td >SMZ800N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Yeast extract</td>
			<td >Becton Dickinson</td>
			<td >REF. 212750</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring the effects of bacteria and chemicals on the intestinal permeability of caenorhabditis elegans

In lebenden Organismen ist die Darmhyperpermeabilität ein ernstes Symptom, das zu vielen entzündlichen Darmerkrankungen (IBDs) führt. Caenorhabditis elegans ist ein nichtmammalisches Tiermodell, das aufgrund seiner kurzen Lebensdauer, Transparenz, Kostenwirksamkeit und des Mangels an tierethischen Fragen weithin als Assay-System verwendet wird. In dieser Studie wurde eine Methode entwickelt, um die Auswirkungen verschiedener Bakterien und 3,3'-Diindolylmethane (DIM) auf die Darmdurchlässigkeit von C. elegans mit einem Hochdurchsatz-Bildanalysesystem zu untersuchen. Die Würmer wurden mit verschiedenen Darmbakterien infiziert oder 48 h lang mit DIM kobehandelt und über Nacht mit Fluoresceinisothiocyanat (FITC)-Dextran gefüttert. Anschließend wurde die Darmdurchlässigkeit durch Vergleich der Fluoreszenzbilder und der Fluoreszenzintensität in den Schneckenkörpern untersucht. Diese Methode kann auch das Potenzial haben, probiotische und pathogene Darmbakterien zu identifizieren, die Diedarmdurchlässigkeit im Tiermodell beeinflussen und ist wirksam für die Untersuchung der Auswirkungen von schädlichen oder gesundheitsfördernden Chemikalien auf die Darmdurchlässigkeit und Darmgesundheit. Dieses Protokoll hat jedoch auch einige erhebliche Einschränkungen auf genetischer Ebene, insbesondere zur Bestimmung, welche Gene zur Kontrolle von Krankheiten verändert werden, da diese Methode hauptsächlich zur phänotytypischen Bestimmung verwendet wird. Darüber hinaus beschränkt sich diese Methode darauf, genau zu bestimmen, welche pathogenen Substrate Entzündungen verursachen oder die Durchlässigkeit des Darms der Würmer während der Infektion erhöhen. Daher sind weitere eingehende Studien, einschließlich der Untersuchung des molekulargenetischen Mechanismus mit mutierten Bakterien und Nematoden sowie der chemischen Komponentenanalyse von Bakterien, erforderlich, um die Funktion von Bakterien und Chemikalien bei der Bestimmung der Darmdurchlässigkeit vollständig zu bewerten.

Nach der Inkubation mit P. aeruginosa PAO1 zeigten C. elegans eine signifikante Zunahme der FITC-Dextran-Fluoreszenz im Wurmkörper im Vergleich zur fluoreszenz, die nach der Inkubation mit den beiden anderen Bakterienstämmen gezeigt wurde (Abbildung 1). Die Fluoreszenzintensitäten von Würmern, die mit E. coli OP50, P. aeruginosa PAO1 und E. faecalis KCTC3206 gefüttert wurden, betrugen 100,0 x 6,6, 369,7 x 38,9 bzw. 105,6 x 10,6 %. Die Daten b...

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Measuring the Effects of Bacteria and Chemicals on the Intestinal Permeability of Caenorhabditis elegans

Dieses Protokoll beschreibt, wie die Darmdurchlässigkeit von Caenorhabditis elegansgemessen wird. Diese Methode ist hilfreich für die biologische Grundlagenforschung zur Darmgesundheit im Zusammenhang mit der Wechselwirkung zwischen Darmbakterien und ihrem Wirt und für das Screening, um probiotische und chemische Wirkstoffe zu identifizieren, um leckartigedarme Syndrome und entzündliche Darmerkrankungen zu heilen.

Messung der Auswirkungen von Bakterien und Chemikalien auf die Darmdurchlässigkeit von Caenorhabditis elegans

In living organisms, intestinal hyperpermeability is a serious symptom that leads to many inflammatory bowel diseases (IBDs). Caenorhabditis elegans is a ...

Diese Methode wird hilfreich für grundlegende biologische Studien im Zusammenhang mit der Interaktion zwischen Darmmikrobiota und Darmgesundheit sein. Darüber hinaus kann dieses Protokoll für das Screening potenzieller Probiotika und Nutraceuticals verwendet werden, um Darmgesundheitsprobleme zu heilen, wie lecky Darmsyndrom und entzündliche Darmerkrankungen. Dieses Protokoll verwendet ein Bildgebungssystem mit hohem Durchsatz, um eine schnelle und präzise quantitative Analyse der Darmdurchlässigkeit bei C.elegans zu ermöglichen, die mit verschiedenen Bakterien und Chemikalien behandelt werden.Wir empfehlen einem Wissenschaftler, der mit dieser Technik nicht vertraut ist, die Anzahl der Proben zu begrenzen, um Fehletikettierungen und andere Fehler zu vermeiden. Dieses Verfahren besteht aus vielen Schritten, die eine visuelle Demonstration erfordern, wie z. B. das Übertragen von Würmern auf 96-Well-Platten und die Verwendung der Operettenmaschine sowie der Harmony-Software. Beginnen Sie mit der Zubereitung von 500 Millilitern sterilem LB-Medium.Impfen Sie eine einzelne Kolonie von P.aeruginosa in das Medium, und bebrüten Die Kultur für 14 bis 15 Stunden bei 37 Grad Celsius, während sie bei 150 U/min schütteln. Am nächsten Tag die Bakterienkultur gleichmäßig in zwei 500-Milliliter-Röhren verteilen und 30 Minuten lang bei 3, 220 mal g und vier Grad Celsius zentrifugieren. Entfernen Sie den Überstand, so dass 25 Milliliter in jeder Röhre, für ein gesamtes verbleibendes Volumen von 50 Milliliter, dann das bakterielle Pellet wieder aussetzen.Bewahren Sie die Bakterienkultur bei vier Grad Celsius auf, bis sie einsatzbereit ist. Um die Auswirkungen von Bakterien auf die Darmdurchlässigkeit von C.elegans zu testen, entfernen Sie die Kulturen aus dem Kühlschrank und wirbeln Sie sie gründlich aus. Fügen Sie insgesamt 800 Mikroliter zu jeder frischen NGM-Platte hinzu und lassen Sie die Platten in einem 20-Grad-Grad-Celsius-Inkubator über Nacht trocknen.Um DIM-Platten zuzubereiten, 50 Milliliter NGM Agarmedium in eine Flasche DIM mit NGM-Brühe geben und gründlich mischen. Dann 20 Milliliter des Mediums in jede 90 mal 15 Millimeter Petrischale gießen. Bereiten Sie DMSO-Platten vor, indem Sie 20 Milliliter DMSO mit NGM-Medium zu jeder Petrischale hinzufügen, und lassen Sie die Platten mindestens drei Stunden bei Raumtemperatur, um sie zu erstarren.800 Mikroliter wirbelnder E.coli- oder P.aeruginosa-Kultur auf jede frische NGM-Platte verteilen und die Platten über Nacht in einem 20-Grad-Grad-Celsius-Inkubator trocknen lassen. Waschen Sie die alterssynchronisierten L4-Larven mit S-Puffer und übertragen Sie etwa 500 Würmer auf die NGM-Platten, die verschiedene Bakterien und Chemikalien enthalten. Dann inkubieren Sie die Platten bei 20 Grad Celsius für 48 Stunden.Bereiten Sie die FITC-dextran-ergänzten Platten vor, indem Sie zwei Milliliter hitzeinaktiviertes E.coli mit vier Milligramm FITC-Dextran mischen. Fügen Sie 100 Mikroliter der Mischung zu jeder der 20 frischen NGM AgarPlatten hinzu und lassen Sie die Platten für eine Stunde auf einer sauberen Laborbank trocknen. Nach 48 Stunden Behandlung die Würmer mit S-Puffer waschen, auf FITC-dextran-ergänzte Platten und auf NGM-Platten ohne FITC-Dextran übertragen und die Platten über Nacht inkubieren.Am nächsten Tag die Würmer mit S-Puffer waschen und eine Stunde lang in der frischen NGM-Agarplatte kriechen lassen. Fügen Sie 50 Mikroliter 4%Formaldehyd in jeden Brunnen einer schwarzen, 96-Well-Flachbodenplatte hinzu und übertragen Sie etwa 50 Würmer in jeden Brunnen. Nach ein bis zwei Minuten das gesamte Formaldehyd entfernen und 100 Mikroliter Montagemedium in jeden Brunnen geben.Formaldehyd ist eine giftige Chemikalie und sollte mit Vorsicht behandelt werden. Um fluoreszierende Bilder zu erfassen, drücken Sie das Symbol Deckel öffnen in der Bildverarbeitungssoftware, und legen Sie die Platte in die Maschine ein. Klicken Sie auf Setup, wählen Sie den Plattentyp aus, und fügen Sie die Hellfeld- und EGFP-Kanäle hinzu.Um das Layout anzupassen, wechseln Sie zur Layoutauswahl, und wählen Sie Spur aus. Legen Sie das erste Bild auf ein Mikrometer, die Anzahl der Ebenen auf 10 und den Abstand auf ein Mikrometer fest. Wählen Sie eine der Behandlungsbohrungen und ein Aufnahmefeld aus, und drücken Sie test en the Run Experiment section.Wenn die Bilder zufriedenstellend sind, kehren Sie zum Abschnitt Setup zurück, und drücken Sie das Symbol Zurücksetzen. Wählen Sie dann alle Zielbrunnen und eine geeignete Anzahl von Erfassungsfeldern aus. Gehen Sie zu Experiment ausführen, geben Sie den Plattennamen ein, und drücken Sie Start.Um die Fluoreszenzintensität zu messen, gehen Sie zum Abschnitt Bildanalyse, geben Sie das Bild ein und finden Sie die Zelle, indem Sie den EGFP-Kanal und die Methode B wählen. Passen Sie die Parameter entsprechend den Manuskriptrichtungen an, und wählen Sie den Mittelwert als Ausgabe aus. Drücken Sie das Symbol Anwenden, um das Setup zu speichern. Rufen Sie eine Heatmap und eine Datentabelle ab, indem Sie zum Abschnitt Auswertung gehen, den Ausleseparameter anpassen und dann die Auswertung starten.C.elegans zeigte eine signifikante Zunahme der FITC-Dextran-Fluoreszenz nach der Inkubation mit P.aeruginosa im Vergleich zu den beiden anderen Bakterienstämmen, was darauf hindeutet, dass P.aeruginosa mehr lebenswichtige Schäden an der epitheliaalen Darmbarriere und erhöhte Darmdurchlässigkeit verursachte. Live und hitzeinaktivierte P.aeruginosa löste sehr unterschiedliche Auswirkungen auf die Darmdurchlässigkeit bei C.elegans aus. Bei der Inaktivierung der Hitze deuten sowohl die Fluoreszenzbilder als auch die statistischen Daten darauf hin, dass P.aeruginosa keine Toxizität für Nematoden auslöste.Eine 48-stündige Ko-Behandlung mit DIM verringerte signifikant die FITC-Dextran-Fluoreszenzintensität im Darm von Würmern, die P.aeruginosa ausgesetzt sind, was zeigt, dass DIM als ein gutes Natürliches Produkt zur Heilung von Darmdurchlässigkeitsfunktionsstörungen angesehen werden kann, die durch bakterielle Infektionen verursacht werden. Es ist wichtig, sich daran zu erinnern, dass Sie bei der Herstellung der FITC-dextran-beschichteten Platten die Lichteinstrahlung aufgrund der Lichtempfindlichkeit von FITC-dextran minimieren müssen. Diese Technik kann verwendet werden, um die pathogene und probiotische Wirkung von Darmbakterien und ihre aktiven Komponenten durch die Prüfung der Bakterien zu bestimmen, sowie ihre chemische Zusammensetzung.

Research

JoVE Journal

Medicine

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Kondziela7 devised the inverted screen test and published it in 1964. It is a test of muscle strength using all four limbs. Most normal mice easily score ...

Forschung

Medizin

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Messen Frailty in HIV-infizierten Personen. Bezeichnung des gebrechlichen Patienten ist der erste Schritt zur Besserung und Umkehr der Frailty

A simple, validated protocol consisting of a battery of tests is available to identify elderly patients with frailty syndrome. This syndrome of decreased ...

Non-invasive Assessment of the Efficacy of New Therapeutics for Intestinal Pathologies Using Serial Endoscopic Imaging of Live Mice

Nicht-invasive Beurteilung der Wirksamkeit neuer Therapeutika für Darmpathologien Verwenden der seriellen endoskopische Bildgebung von lebenden Mäusen

Animal models of inflammatory bowel disease (IBD) and colorectal cancer (CRC) have provided significant insight into the cell intrinsic and extrinsic ...

Ex Vivo Intestinal Sacs to Assess Mucosal Permeability in Models of Gastrointestinal Disease

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Ex vivo-Darm-Sacs zu beurteilen Durchlässigkeit der Schleimhaut in Modelle von Magen-Darm-Krankheit

The epithelial barrier is the first innate defense of the gastrointestinal tract and selectively regulates transport from the lumen to the underlying ...

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

Phosphor-31 Magnet-Resonanz-Spektroskopie: Ein Werkzeug zur Messung<em&gt; In Vivo</em&gt; Mitochondrial Oxidative Phosphorylierung Kapazität im menschlichen Skelettmuskel

Skeletal muscle mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) capacity, which is critically important in health and disease, can be measured in vivo ...

Analyzing Beneficial Effects of Nutritional Supplements on Intestinal Epithelial Barrier Functions During Experimental Colitis

Analyse wohltuende Wirkung von Nahrungsergänzungsmitteln auf Darmepithel Barrierefunktionen Während Experimental ulcerosa

Inflammatory bowel diseases (IBD), including Crohn&#39;s disease and ulcerative colitis, are chronic relapsing disorders of the intestines. They cause ...

Measuring the Effect of Chemicals on the Growth and Reproduction of Caenorhabditis elegans

Measuring the Effect of Chemicals on the Growth and Reproduction of Caenorhabditis elegans

Messung der Wirkung von Chemikalien auf das Wachstum und die Vermehrung von Caenorhabditis elegans

Toxicological evaluation is crucial for understanding the effects of chemicals on living organisms in basic and applied biological science fields. A ...

A Murine Model of Fetal Exposure to Maternal Inflammation to Study the Effects of Acute Chorioamnionitis on Newborn Intestinal Development

Ein murines Modell der fetalen Exposition gegenüber mütterlicher Entzündung, um die Auswirkungen der akuten Chorioamnionitis auf die Darmentwicklung von Neugeborenen zu untersuchen

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Assessing Strength Exercise Volume and Its Impact on Insulin Sensitivity in Obesity

Randomized Controlled Trial to Study the Acute Effects of Strength Exercise on Insulin Sensitivity in Obese Adults

Exploring the Impact of Reduced Resistance Exercise Volume on Metabolic Health (Video) | JoVE

Randomisierte kontrollierte Studie zur Untersuchung der akuten Auswirkungen von Krafttraining auf die Insulinsensitivität bei adipösen Erwachsenen

An acute session of strength exercise (SE) ameliorates insulin sensitivity (IS) for several hours; however, the effects of SE volume (i.e., number of ...