Name: measuring the effects of bacteria and chemicals on the intestinal permeability of caenorhabditis elegans
Uploaded: 2019-12-03T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring the Effects of Bacteria and Chemicals on the Intestinal Permeability of Caenorhabditis elegans at JoVE.com

מחקר זה היה נתמך על ידי מכון קוריאה של מדע וטכנולוגיה מענק מחקר בתחום הציור (2E29563).

1. הכנת P. aerginosa PAO1 ו es coli OP50 תרבות
<ol><li>הכינו 500 מ ל של לוריא-ברדילי (ליברות) בינונית (שולחן 1) ואיחסן מושבה אחת של P. aerginosa לתוך המדיום. דגירה את התרבות עבור 14 עד 15 h ב 37 ° c עם מהירות לרעוד של 150 סל ד.</li>
	<li>באותה מידה להפיץ את התרבות החיידקית לצינורות צנטריפוגה 2 500 mL ו צנטריפו?...

<ol>
	<li>Bischoff, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+permeability&#8211;a+new+target+for+disease+prevention+and+therapy.">Intestinal permeability&#8211;a new target for disease prevention and therapy.</a> BMC Gastroenterology. 14 (1), 189 (2014).</li><li>Peng, L., Li, Z. R., Green, R. S., Holzman, I. R., Lin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Butyrate+enhances+the+intestinal+barrier+by+facilitating+tight+junction+assembly+via+activation+of+AMP-activated+protein+kinase+in+Caco-2+cell+monolayers.">Butyrate enhances the intestinal barrier by facilitating tight junction assembly via activation of AMP-activated protein kinase in Caco-2 cell monolayers.</a> The Journal of Nutrition. 139 (9), 1619-1625 (2009).</li><li>Ren, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+basis+for+intestinal+barrier+against+the+toxicity+of+graphene+oxide.">Developmental basis for intestinal barrier against the toxicity of graphene oxide.</a> Particle Fibre Toxicology. 15 (1), 26 (2018).</li><li>Kissoyan, K. A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+C.+elegans+microbiota+protects+against+infection+via+production+of+a+cyclic+lipopeptide+of+the+viscosin+group.">Natural C. elegans microbiota protects against infection via production of a cyclic lipopeptide of the viscosin group.</a> Current Biology. 29 (6), 1030-1037 (2019).</li><li>Gelino, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+autophagy+improves+healthspan+and+longevity+in+C.+elegans+during+dietary+restriction.">Intestinal autophagy improves healthspan and longevity in C. elegans during dietary restriction.</a> PLoS Genetics. 12 (7), 1006135 (2016).</li><li>Escorcia, W., Ruter, D. L., Nhan, J., Curran, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+lipid+abundance+and+evaluation+of+lipid+distribution+in+Caenorhabditis+elegans+by+Nile+red+and+oil+red+O+staining.">Quantification of lipid abundance and evaluation of lipid distribution in Caenorhabditis elegans by Nile red and oil red O staining.</a> Journal of Visualized Experiments. (133), e57352 (2018).</li><li>Johnson, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advantages+and+disadvantages+of+Caenorhabditis+elegans+for+aging+research.">Advantages and disadvantages of Caenorhabditis elegans for aging research.</a> Experimental Gerontology. 38 (11-12), 1329-1332 (2003).</li><li>Culetto, E., Sattelle, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+Caenorhabditis+elegans+in+understanding+the+function+and+interactions+of+human+disease+genes.">A role for Caenorhabditis elegans in understanding the function and interactions of human disease genes.</a> Human Molecular Genetics. 9 (6), 869-877 (2000).</li><li>Hubbard, E. J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+germ+line:+A+model+for+stem+cell+biology.">Caenorhabditis elegans germ line: A model for stem cell biology.</a> Developmental Dynamics. 236 (12), 3343-3357 (2007).</li><li>Park, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probiotic+Lactobacillus+fermentum+strain+JDFM216+stimulates+the+longevity+and+immune+response+of+Caenorhabditis+elegans+through+a+nuclear+hormone+receptor.">Probiotic Lactobacillus fermentum strain JDFM216 stimulates the longevity and immune response of Caenorhabditis elegans through a nuclear hormone receptor.</a> Scientific Reports. 8, 7441 (2018).</li><li>Kim, Y., Mylonakis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+immune+conditioning+with+the+probiotic+bacterium+Lactobacillus+acidophilus+strain+NCFM+enhances+gram-positive+immune+responses.">Caenorhabditis elegans immune conditioning with the probiotic bacterium Lactobacillus acidophilus strain NCFM enhances gram-positive immune responses.</a> Infection and Immunity. 80 (7), 2500-2508 (2012).</li><li>Nakagawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+and+mechanisms+of+prolongevity+induced+by+Lactobacillus+gasseri+SBT2055+in+Caenorhabditis+elegans.">Effects and mechanisms of prolongevity induced by Lactobacillus gasseri SBT2055 in Caenorhabditis elegans.</a> Aging Cell. 15 (2), 227-236 (2016).</li><li>Dinh, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cranberry+extract+standardized+for+proanthocyanidins+promotes+the+immune+response+of+Caenorhabditis+elegans+to+Vibrio+cholerae+through+the+p38+MAPK+pathway+and+HSF-1.">Cranberry extract standardized for proanthocyanidins promotes the immune response of Caenorhabditis elegans to Vibrio cholerae through the p38 MAPK pathway and HSF-1.</a> PLoS One. 9 (7), 103290 (2014).</li><li>Vayndorf, E. M., Lee, S. S., Liu, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+apple+extracts+increase+lifespan,+healthspan+and+resistance+to+stress+in+Caenorhabditis+elegans.">Whole apple extracts increase lifespan, healthspan and resistance to stress in Caenorhabditis elegans.</a> Journal of Functional Foods. 5 (3), 1236-1243 (2013).</li><li>Huycke, M. M., Abrams, V., Moore, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enterococcus+faecalis+produces+extracellular+superoxide+and+hydrogen+peroxide+that+damages+colonic+epithelial+cell+DNA.">Enterococcus faecalis produces extracellular superoxide and hydrogen peroxide that damages colonic epithelial cell DNA.</a> Carcinogenesis. 23 (3), 529-536 (2002).</li><li>Laughlin, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+key+role+of+Pseudomonas+aeruginosa+PA-I+lectin+on+experimental+gut-derived+sepsis.">The key role of Pseudomonas aeruginosa PA-I lectin on experimental gut-derived sepsis.</a> Annals of Surgery. 232 (1), 133-142 (2000).</li><li>Huang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3,3'-Diindolylmethane+decreases+VCAM-1+expression+and+alleviates+experimental+colitis+via+a+BRCA1-dependent+antioxidant+pathway.">3,3'-Diindolylmethane decreases VCAM-1 expression and alleviates experimental colitis via a BRCA1-dependent antioxidant pathway.</a> Free Radical Biology, Medicine. 50 (2), 228-236 (2011).</li><li>Jeon, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Oral+Administration+of+3,3'-Diindolylmethane+on+Dextran+Sodium+Sulfate-Induced+Acute+Colitis+in+Mice.">Effect of Oral Administration of 3,3'-Diindolylmethane on Dextran Sodium Sulfate-Induced Acute Colitis in Mice.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 64, 7702-7709 (2016).</li><li>Kim, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3,3'-Diindolylmethane+improves+intestinal+permeability+dysfunction+in+cultured+human+intestinal+cells+and+the+model+animal+Caenorhabditis+elegans.">3,3'-Diindolylmethane improves intestinal permeability dysfunction in cultured human intestinal cells and the model animal Caenorhabditis elegans.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 67 (33), 9277-9285 (2019).</li><li>Lee, S. Y., Kang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+the+Effect+of+Chemicals+on+the+Growth+and+Reproduction+of+Caenorhabditis+elegans.">Measuring the Effect of Chemicals on the Growth and Reproduction of Caenorhabditis elegans.</a> Journal of Visualized Experiments. (128), e56437 (2017).</li><li>Schmeisser, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+ROS+signaling+rather+than+AMPK/sirtuin-mediated+energy+sensing+links+dietary+restriction+to+lifespan+extension.">Neuronal ROS signaling rather than AMPK/sirtuin-mediated energy sensing links dietary restriction to lifespan extension.</a> Molecular Metabolism. 2 (2), 92-102 (2013).</li><li>Lee, S. Y., Kim, J. Y., Jung, Y. J., Kang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxicological+evaluation+of+the+topoisomerase+inhibitor,+etoposide,+in+the+model+animal+Caenorhabditis+elegans+and+3T3-L1+normal+murine+cells.">Toxicological evaluation of the topoisomerase inhibitor, etoposide, in the model animal Caenorhabditis elegans and 3T3-L1 normal murine cells.</a> Environmental Toxicology. 32 (6), 1836-1843 (2017).</li><li>Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+Caenorhabditis+elegans+life+span+on+solid+media.">Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media.</a> Journal of Visualized Experiments. (27), e1152 (2009).</li><li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Caenorhabditis+elegans+methods:+synchronization+and+observation.">Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation.</a> Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).</li><li>Al Atya, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probiotic+potential+of+Enterococcus+faecalis+strains+isolated+from+meconium.">Probiotic potential of Enterococcus faecalis strains isolated from meconium.</a> Frontiers in Microbiology. 6, 227 (2015).</li><li>Hanchi, H., Mottawea, W., Sebei, K., Hammami, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Genus+Enterococcus:+Between+Probiotic+Potential+and+Safety+Concerns-An+Update.">The Genus Enterococcus: Between Probiotic Potential and Safety Concerns-An Update.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 1791 (2018).</li><li>Pollack, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+exotoxin+A+in+pseudomonas+disease+and+immunity.">The role of exotoxin A in pseudomonas disease and immunity.</a> Reviews of Infectious Diseases. 5, 979-984 (1983).</li><li>Vasil, M. L., Liu, P. V., Iglewski, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature-dependent+inactivating+factor+of+Pseudomonas+aeruginosa+exotoxin+A.">Temperature-dependent inactivating factor of Pseudomonas aeruginosa exotoxin A.</a> Infection and Immunity. 13 (5), 1467-1472 (1976).</li><li>Horii, T., Muramatsu, H., Monji, A., Miyagishima, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Release+of+exotoxin+A,+peptidoglycan+and+endotoxin+after+exposure+of+clinical+Pseudomonas+aeruginosa+isolates+to+carbapenems+in+vitro.">Release of exotoxin A, peptidoglycan and endotoxin after exposure of clinical Pseudomonas aeruginosa isolates to carbapenems in vitro.</a> Chemotherapy. 51 (6), 324-331 (2005).</li><li>Kirikae, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+characterization+of+endotoxins+released+from+antibiotic-treated+Pseudomonas+aeruginosa+and+Escherichia+coli.">Biological characterization of endotoxins released from antibiotic-treated Pseudomonas aeruginosa and Escherichia coli.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 42 (5), 1015-1021 (1998).</li><li>Morlon-Guyot, J., Mere, J., Bonhoure, A., Beaumelle, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+of+Pseudomonas+aeruginosa+exotoxin+A+is+dispensable+for+cell+intoxication.">Processing of Pseudomonas aeruginosa exotoxin A is dispensable for cell intoxication.</a> Infection and Immunity. 77 (7), 3090-3099 (2009).</li><li>Kim, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3,3'-diindolylmethane+attenuates+colonic+inflammation+and+tumorigenesis+in+mice.">3,3'-diindolylmethane attenuates colonic inflammation and tumorigenesis in mice.</a> Inflammatory Bowel Diseases. 15 (8), 1164-1173 (2009).</li><li>Kanmani, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probiotics+and+its+functionally+valuable+products-a+review.">Probiotics and its functionally valuable products-a review.</a> Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 53 (6), 641-658 (2013).</li><li>Nguyen, M. T., Gotz, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipoproteins+of+Gram-Positive+Bacteria:+Key+Players+in+the+Immune+Response+and+Virulence.">Lipoproteins of Gram-Positive Bacteria: Key Players in the Immune Response and Virulence.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 80 (3), 891-903 (2016).</li></ol>

על ידי ניצול השיטה החדשה הזאת לקביעת חדירות הבטן ב -C. אלגיה, המשלבת מיקרוסקופית קרינה אוטומטית וניתוח דימוי כמותי, ניתן לקבוע את ההבדלים הנגרמים על-ידי מיקרואורגניזמים או כימיקלים בvivo, במיוחד במעיים של מעיים. פרוטוקול זה שימושי עבור חקירות המעיים והחלים על משימות רבות, כגון מיני ...

חדירות המעי נחשב אחד המחסומים העיקריים הקשורים המעי microbiota וחסינות רירית והוא צפוי להיות מושפע על ידי מספר גורמים, כגון שינויים microbiota בטן, ליקוי אפיתל, או שינוי שכבת ריר1. העיתונים האחרונים דיווחו על פרוטוקולים יעילים כדי למדוד את חדירות המעי של תאי מעיים אנושיים על ידי ניתוח שיעורי השטף הזריחה על פני שכבת התא מעיים2, אבל מחקרים פחות להציג הליך מתאים למדידת חדירות הבטן ב nematodes, במיוחד ב -C. אלגיה, על ידי שימוש בצביעת fitc-dextran.
קיימים שני פרוטוקולים מייצגים למדידת חדירות הבטן ב -C. אלגיה באמצעות הנילוס האדום3 ואריאולאוצין דינתרן (או שיטת הדרדס)4,5. בפרוטוקול זה, השתמשנו FITC-dextran (משקל מולקולרי ממוצע 10,000), אשר יש משקל מולקולרי הרבה יותר גבוה מאשר הנילוס אדום (MW = 318.37) ו-dioglaucine דינתרן (MW = 792.85). Fitc-dextran דומה יותר הנילוס האדום או erioglaucine ניתרן חומרי מזינים macromolecular בפועל כגון פחמימות, אשר נספגים דרך שכבת המעי. ניתן להעריך בקלות את חדירות המעיים של מערכת המזון המומנת של המעי הקיסרי . עם זאת, בתוך שיטת הדרדס, ניתוח כמותי של חדירות המעי קשה עקב חוסר סטנדרטיזציה ויש להעריך ידנית4,5. במקרה של הסדר האדום של הנילוס, אדום הנילוס כתמי גם טיפות שומנים בתאים, אשר עלול להפריע להגדרה המדויקת של חדירות הבטן בג6. הפרוטוקולים הנוכחיים מאפשרים ניתוח כמותי מהיר ומדויק של חדירות המעיים ב -C. אלגיה המטופלת בחיידקים וכימיקלים שונים תוך הימנעות מהכתמים שומנים בלתי ספציפיים.
ג. אלגיה הוא מודל אופייני בתחומים ביולוגיים בשל מחירו הסביר, מניפולציה קלה, בעיות מוגבלות בבעלי חיים, ותוחלת חיי קצר, המועילה לניסויים מהירים7. בפרט, לאחר הוצאת הגנום c. אלגיה , כמעט 40% מהגנים בגנום c. אלגיה הינם אורתוולוגי לגנים הגורמים למחלות אנושיות8. יתר על כן, הגוף השקוף מאפשר התבוננות בתוך האורגניזם, אשר יתרון עבור מחקר אירועים סלולריים ליישומים הפלואורסצנטית בביולוגיה התא, למשל, תא גזע מכתים עם DAPI או אימונוהיסטוכימיה9. ג. אלאנים משמשים לעתים קרובות כבעל חיים ניסיוני כדי ללמוד את האינטראקציה בין מיקרוביוטה הבטן לבין הפונדקאי; בנוסף, C. אלגיהns משמש למסך בריאות לקידום חיידקים פרוביוטיקה10,11,12 , כמו גם כימיקלים תזונתיים לקידוםבריאותהמעיים 13,14.
פסאודומונס aeruginosa ובידור faecalis הם חיידקים ידועים הבטן כי לרעה להשפיע על מערכת העיכול, במיוחד את התאים האפיתל חוקן של בדרכי המעיים15,16. לכן, מדידת חדירות הבטן המופעל על ידי חיידקים אלה הוא הכרחי להקרנה ופיתוח של תרופות חדשות שיכולות להתאושש ולהפחית את הנזק שנגרם על ידי דלקת בקטריאלי וזיהום. בפרוטוקול זה בדקנו את ההשפעות של חיידקי המעי האלה על חדירות המעיים של הג.
כמו כן אנו מדווחים על פרוטוקול אופטימלי לבדיקת כימיקלים על חדירות המעיים של הג. למטרה זו, השתמשנו 3, 3 '-diindolylmethane תאן (DIM) כמו מודל כימי משום עמום הוא מתחם אקטיביים מטבוליט נגזר של אינדול-3-carbinol, אשר קיים בצמחי מזון הבהקרוסי, ו דווח כי יש השפעות טיפוליות על ibd בעכברים17,18. בנוסף, גילינו לאחרונה כי DIM משפר את התפקוד הלקוי של חדירות המעי בתאי מעיים אנושיים, כמו גם את מודל נמטודות C. אלגיה19.
במחקר זה, השתמשנו בשלושה תנאים ניסיוניים שונים. ראשית, מדדנו את ההשפעות של החיידקים השונים, P. aerginosa ו -E. faecalis, על חדירות מעיים (איור 1). שנית, מדדנו את ההשפעות של P. aeruginosa בשידור חי וחום על חדירות המעי (איור 2). שלישית, מדדנו את ההשפעות של הדים (מודל כימי) על חדירות המעיים של ס. ל. פ . (איור 3).
מטרת מחקר זה היתה לפתח פרוטוקולים ממוטבים המודדים את חדירות המעיים של ה -C. אלגיה, אשר משתנה על ידי טיפול עם חיידקים מעיים שונים, כמו גם עם כימיקלים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >3,3&#8217;-diindolylmethane&#160;</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >D9568</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >90&#215;15 mm Petri dishes</td>
			<td >SPL Life Sciences, South Korea</td>
			<td >10090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >60&#215;15 mm Petri dishes</td>
			<td >SPL Life Sciences, South Korea</td>
			<td >10060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bactor Agar</td>
			<td >Beckton Dickinson</td>
			<td >REF. 214010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Formaldehyde solution&#160;</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >F1635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Brain Heart Infusion (BHI)&#160;</td>
			<td >Becton Dickinson</td>
			<td >REF. 237500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Caenorhabditis elegans N2</td>
			<td >Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td ></td>
			<td>Wild type&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cholesterol</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >C3045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Costa Assay Plate, 96 Well Black With Clear Flat Bottom Non-treated, No Lid Polystyrene</td>
			<td >Corning Incorporated</td>
			<td >REF. 3631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dimethyl sulfoxide</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Enterococcus faecalis KCTC 3206</td>
			<td >Korean Collection for Type Culture</td>
			<td >KCTC NO. 3206</td>
			<td>Falcutative anaerobic</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Escherichia coli OP50</td>
			<td >Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fluorescein isothiocyanate - dextran</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >FD10S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Harmony software&#160;</td>
			<td >PerkinElmer</td>
			<td ></td>
			<td>verson 3.5</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Luria-Bertani LB medium</td>
			<td >Merck</td>
			<td >VM743185 626&#160; 1.10285.5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Magnesium sulfate heptahydrate&#160;</td>
			<td >Fisher Bioreagents</td>
			<td >BP2213-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fluoromount aqueous mounting medium</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >F4680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Operetta CLS High-Content Analysis System</td>
			<td >PerkinElmer</td>
			<td>&#160;HH16000000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Peptone</td>
			<td >Merck</td>
			<td >EMD 1.07213.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pseudomonas aeruginosa PA01</td>
			<td >Korean Collection for Type Culture</td>
			<td >KCTC NO. 1637</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium Chloride</td>
			<td >Fisher Bioreagents</td>
			<td >BP358-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Stereo Microscope</td>
			<td >Nikon, Japan</td>
			<td >SMZ800N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Yeast extract</td>
			<td >Becton Dickinson</td>
			<td >REF. 212750</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring the effects of bacteria and chemicals on the intestinal permeability of caenorhabditis elegans

באורגניזמים חיים, היפרסטרוביליות מעיים היא סימפטום רציני המוביל למחלות מעיים דלקתיות רבות (IBDs). האלגיה היא מודל בעלי חיים שאינו מדיה , המשמש רבות כמערכת שיטת שיטה, בשל תוחלת החיים הקצרה, השקיפות, העלות והאפקטיביות, והיעדר בעיות באתיקה בעלי ממון. במחקר זה, פותחה שיטה כדי לחקור את ההשפעות של חיידקים שונים 3, 3 '-diindolylmethane תאן (עמום) על חדירות המעיים של C. אלגיה עם מערכת ניתוח תמונה בתפוקה גבוהה. התולעים נדבקו בחיידקים שונים או מטופלים עם DIM עבור 48 h וניזון עם fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran לילה. לאחר מכן נבדק חדירות המעי על ידי השוואת הדימויים הפלואורסצנטית ועוצמת הקרינה הפלואורסצנטית בתוך גופי התולעת. שיטה זו עשויה להיות גם הפוטנציאל לזהות פרוביוטיקה וחיידקים מעיים פתוגניים המשפיעים על חדירות המעי במודל החי והוא יעיל לבדיקת ההשפעות של מזיקים או בריאות לקידום הכימיקלים על חדירות המעי ובריאות המעיים. עם זאת, פרוטוקול זה יש גם כמה מגבלות משמעותיות ברמה הגנטית, במיוחד לקביעת אילו גנים משתנים לשלוט במחלות, כי שיטה זו משמשת בעיקר להגדרה פנוטימית. בנוסף, שיטה זו מוגבלת לקביעת בדיוק איזה מצעים פתוגניים לגרום לדלקת או להגדיל את החדירות של המעיים של התולעים במהלך הזיהום. לכן, מחקרים מעמיקים יותר, כולל חקירה של המנגנון הגנטי המולקולרי באמצעות חיידקים מוטציה, נמטודות, כמו גם ניתוח מרכיב כימי של חיידקים, נדרשים להעריך באופן מלא את התפקוד של חיידקים וכימיקלים בקביעת חדירות המעי.

לאחר הדגירה עם P. aeruginosa PAO1, ג. אלגיה הראה עלייה משמעותית בזריחה fitc-dextran בגוף התולעת לעומת הזריחה המוצגת לאחר הדגירה עם שני זנים חיידקיים אחרים (איור 1). עוצמות הזריחה של תולעים הניזונים עם E. coli OP50, P. aeruginosa PAO1, ו -e. faecalis KCTC3206 היו 100.0 ± 6.6, 369.7 ± 38.9, ו 105.6 ± 10.6%, ב...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring the Effects of Bacteria and Chemicals on the Intestinal Permeability of Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Measuring the Effects of Bacteria and Chemicals on the Intestinal Permeability of Caenorhabditis elegans

פרוטוקול זה מתאר כיצד למדוד חדירות המעי של האלגיה. שיטה זו מועילה למחקרים ביולוגיים בסיסיים על בריאות המעיים הקשורים לאינטראקציה בין בקטריה מעיים למארחים שלהם ולהקרנה כדי לזהות פרוביוטיקה וחומרים כימיים כדי לרפא תסמונת המעיים הדולף ומחלות המעי דלקתיות.

מדידת ההשפעות של חיידקים וכימיקלים על חדירות המעי של האלמרנים

In living organisms, intestinal hyperpermeability is a serious symptom that leads to many inflammatory bowel diseases (IBDs). Caenorhabditis elegans is a ...

שיטה זו תהיה מועילה עבור מחקרים ביולוגיים בסיסיים הקשורים לאינטראקציה בין מיקרוביוטה מעיים ובריאות המעיים. בנוסף, פרוטוקול זה עשוי לשמש לסינון פרוביוטיקה פוטנציאלית ו nutraceuticals כדי לרפא בעיות בריאות המעי, כגון תסמונת המעי הדולף ומחלות מעי דלקתיות. פרוטוקול זה משתמש במערכת הדמיה בתפוקה גבוהה כדי לאפשר ניתוח כמותי מהיר ומדויק של חנונות מעיים ב C.elegans שטופלו בחיידקים וכימיקלים שונים.אנו ממליצים למדען שאינם מכירים טכניקה זו להגביל את מספר הדגימות על מנת למנוע הטעיה וטעויות אחרות. הליך זה מורכב מצעדים רבים הדורשים הדגמה חזותית, כגון העברת תולעים לצלחות 96 בארות ושימוש במכונת אופרטה, כמו גם תוכנת הרמוניה. התחל על ידי הכנת 500 מיליליטר של בינוני LB סטרילי.לחסן מושבה אחת של P.aeruginosa לתוך המדיום, ולהדקר את התרבות במשך 14 עד 15 שעות ב 37 מעלות צלזיוס תוך רועד ב 150 סל"ד. למחרת, להפיץ באופן שווה את התרבות החיידקית לשני צינורות 500 מיליליטר, צנטריפוגה אותם ב 3, 220 פעמים גרם וארבע מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. הסר את supernatant, משאיר 25 מיליליטר בכל צינור, עבור נפח שנותר הכולל של 50 מיליליטר, ולאחר מכן resuspend גלולה חיידקית.לאחסן את תרבות החיידקים בארבע מעלות צלזיוס עד מוכן לשימוש. כדי לבדוק את ההשפעות של חיידקים על חנופת המעיים של C.elegans, להסיר את התרבויות מהמקרר, ביסודיות מערבולת אותם. הוסיפו בסך הכל 800 מיקרוליטרים לכל צלחת NGM טרייה, ואפשרו לצלחות להתייבש באינקובטור של 20 מעלות צלזיוס במהלך הלילה.להכנת צלחות דים, הוסיפו 50 מיליליטר של אגר בינוני NGM לבקבוק דים המכיל מרק NGM, ומערבבים היטב. לאחר מכן, יוצקים 20 מיליליטר של המדיום לתוך כל צלחת פטרי 90 על 15 מילימטר. הכינו צלחות DMSO על ידי הוספת 20 מיליליטר של DMSO המכילים מדיום NGM לכל צלחת פטרי, ולהשאיר את הצלחות בטמפרטורת החדר לפחות שלוש שעות כדי לחזק.מורחים 800 מיקרוליטרים של מערבולת E.coli או P.aeruginosa תרבות על כל צלחת NGM טרי, ולאפשר את הצלחות להתייבש באינקובטור 20 מעלות צלזיוס לילה. שטפו את זחלי L4 המסונכרנים לגיל עם S-buffer, והעברו כ-500 תולעים לצלחות ה-NGM המכילות חיידקים וכימיקלים שונים. לאחר מכן, הדגירה את הצלחות ב 20 מעלות צלזיוס במשך 48 שעות.הכן את צלחות FITC-dextran בתוספת על ידי ערבוב שני מיליליטר של E.coli מושבת בחום עם ארבעה מיליגרם של FITC-dextran. מוסיפים 100 מיקרוליטרים של התערובת לכל אחד מ-20 צלחות אגר NGM טריות, ומאפשרים לצלחות להתייבש במשך שעה על ספסל מעבדה נקי. לאחר 48 שעות של טיפול, לשטוף את התולעים עם S-buffer, להעביר אותם צלחות בתוספת FITC-dextran ו NGM צלחות ללא FITC-dextran, ו דגירה הצלחות לילה.למחרת, לשטוף את התולעים עם S-buffer, ולאפשר להם לזחול בצלחת אגר NGM טרי במשך שעה אחת. הוסיפו 50 מיקרוליטרים של 4% פורמלדהיד לכל באר של צלחת שחורה, בעלת 96 בארות, עם תחתית שטוחה, והעברו כ-50 תולעים לכל באר. לאחר 1-2 דקות, להסיר את כל פורמלדהיד, ולהוסיף 100 microliters של מדיום הרכבה לתוך כל באר.פורמלדהיד הוא כימיקל רעיל ויש לטפל בו בזהירות. כדי ללכוד תמונות פלואורסצנטיות, לחץ על סמל מכסה פתוח בתוכנת ההדמיה והכנס את הלוח למכונה. לחץ על התקנה, בחר את סוג הלוח והוסף את ערוצי השדה הבהיר וה- EGFP.כדי להתאים את הפריסה, עבור אל הבחירה פריסה ובחר עקוב. הגדר את התמונה הראשונה במיקרומטר אחד, את מספר המטוסים ל- 10 ואת המרחק למיקרומטר אחד. בחר אחת מ בארות הטיפול ושדה לכידה אחד והקש Test במקטע הפעל ניסוי.אם התמונות משביעות רצון, חזור למקטע התקנה ולחץ על סמל איפוס. לאחר מכן, בחר את כל בארות היעד ומספר מתאים של שדות לכידה. עבור אל הפעל ניסוי, הזן את שם הלוח והקש התחל.כדי למדוד את עוצמת הפלואורסצנטיות, עבור אל המקטע ניתוח תמונה, הזן את התמונה ולמצוא את התא על-ידי בחירת ערוץ EGFP ושיטה B.Adjust הפרמטרים בהתאם לכיווני כתב היד ובחר את הממוצע כפלט. לחץ על סמל החל כדי לשמור את ההתקנה. השג מפת חום וטבלת נתונים על-ידי מעבר למקטע הערכה והתאמת פרמטר הקריאה ולאחר מכן התחל את ההערכה.C.elegans הראה עלייה משמעותית פלואורסצנטיות FITC-dextran לאחר הדגירה עם P.aeruginosa לעומת שני זנים חיידקיים אחרים, המציין כי P.aeruginosa גרם נזק חיוני יותר מחסום המעי האפיתל וחדירות מעיים מוגברת. P.aeruginosa חי ומושבת חום עורר השפעות שונות מאוד על חודרות המעי ב C.elegans. עם איון החום, הן תמונות הפלואורסצנטיות והן הנתונים הסטטיסטיים מצביעים על כך ש- P.aeruginosa לא עורר רעילות כלשהי לנמטודות.טיפול שותף של 48 שעות עם דים הפחית באופן משמעותי את עוצמת הפלואורסצנטיות FITC-dextran בתוך המעיים של תולעים שנחשפו P.aeruginosa, אשר מדגים כי דים יכול להיחשב מוצר טבעי טוב לרפא תפקוד לקוי של המעיים הנגרמת על ידי זיהומים חיידקיים. חשוב לזכור כי במהלך הכנת צלחות FITC-dextran מצופה, אתה צריך למזער את החשיפה לאור בגלל רגישות האור של FITC-dextran. טכניקה זו יכולה לשמש כדי לקבוע את ההשפעות הפתוגניים ופרוביוטיים של חיידקי מעיים ואת הרכיבים הפעילים שלהם על ידי בדיקת החיידקים, כמו גם את ההרכב הכימי שלהם.

Research

JoVE Journal

Medicine

Measuring the Effects of Bacteria and Chemicals on the Intestinal Permeability of Caenorhabditis elegans

Measuring the Strength of Mice

מדידת עוצמת העכברים

Kondziela7 devised the inverted screen test and published it in 1964. It is a test of muscle strength using all four limbs. Most normal mice easily score ...

Measuring Frailty in HIV-infected Individuals. Identification of Frail Patients is the First Step to Amelioration and Reversal of Frailty

מדידת חולשה באנשים נגועים ב-HIV. זיהוי של חולים חלושים הוא הצעד הראשון להטבה והיפוך של חולשה

A simple, validated protocol consisting of a battery of tests is available to identify elderly patients with frailty syndrome. This syndrome of decreased ...

Non-invasive Assessment of the Efficacy of New Therapeutics for Intestinal Pathologies Using Serial Endoscopic Imaging of Live Mice

הערכה לא פולשנית של היעילות של ניו Therapeutics למעי פתולוגיות שימוש הדמיה אנדוסקופי סידורי של עכברים חיים

Animal models of inflammatory bowel disease (IBD) and colorectal cancer (CRC) have provided significant insight into the cell intrinsic and extrinsic ...

Ex Vivo Intestinal Sacs to Assess Mucosal Permeability in Models of Gastrointestinal Disease

Ex Vivo Intestinal Sacs to Assess Mucosal Permeability in Models of Gastrointestinal Disease

Sacs Ex Vivo המעיים להעריך חדירות ריריות מודלים של מחלות במערכת העיכול

The epithelial barrier is the first innate defense of the gastrointestinal tract and selectively regulates transport from the lumen to the underlying ...

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

זרחן-31 ספקטרוסקופיה תהודה מגנטית: כלי למדידת<em&gt; In vivo</em&gt; קיבולת זרחון חמצוני מיטוכונדריאלי של שריר שלד אדם

Skeletal muscle mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) capacity, which is critically important in health and disease, can be measured in vivo ...

Analyzing Beneficial Effects of Nutritional Supplements on Intestinal Epithelial Barrier Functions During Experimental Colitis

ניתוח מועיל אפקטים של תוספי תזונה על פונקציות מעיים אפיתל מכשול במהלך ניסיוני קוליטיס

Inflammatory bowel diseases (IBD), including Crohn&#39;s disease and ulcerative colitis, are chronic relapsing disorders of the intestines. They cause ...

Measuring the Effect of Chemicals on the Growth and Reproduction of Caenorhabditis elegans

Measuring the Effect of Chemicals on the Growth and Reproduction of Caenorhabditis elegans

מדידת אפקט של כימיקלים על גדילה, רבייה של Caenorhabditis elegans

Toxicological evaluation is crucial for understanding the effects of chemicals on living organisms in basic and applied biological science fields. A ...

A Murine Model of Fetal Exposure to Maternal Inflammation to Study the Effects of Acute Chorioamnionitis on Newborn Intestinal Development

מודל מורין של חשיפה עוברית לדלקת אימהית כדי ללמוד את ההשפעות של Chorioamnionitis חריפה על התפתחות מעיים שזה עתה נולד

Chorioamnionitis is a common precipitant of preterm birth and is associated with many of the morbidities of prematurity, including necrotizing ...

Isolation of Murine Intestinal Mesenchyme Resulting in a High Yield of Telocytes

בידוד של מזנכימה במעי מורין וכתוצאה מכך תשואה גבוהה של טלוציטים

The murine small intestine, or colon mesenchyme, is highly heterogenous, containing distinct cell types including blood and lymphatic endothelium, nerves, ...

Assessing Strength Exercise Volume and Its Impact on Insulin Sensitivity in Obesity

Randomized Controlled Trial to Study the Acute Effects of Strength Exercise on Insulin Sensitivity in Obese Adults

Exploring the Impact of Reduced Resistance Exercise Volume on Metabolic Health (Video) | JoVE

ניסוי אקראי ומבוקר לחקר ההשפעות החריפות של תרגילי כוח על רגישות לאינסולין בקרב מבוגרים שמנים

An acute session of strength exercise (SE) ameliorates insulin sensitivity (IS) for several hours; however, the effects of SE volume (i.e., number of ...