Name: measuring the effects of bacteria and chemicals on the intestinal permeability of caenorhabditis elegans
Uploaded: 2019-12-03T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring the Effects of Bacteria and Chemicals on the Intestinal Permeability of Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Questo studio è stato sostenuto da una sovvenzione di ricerca intramurale dell'Istituto coreano di scienza e tecnologia (2E29563).

1. Preparazione di P. aeruginosa PAO1 e Escherichia coli OP50 Cultura
<ol><li>Preparare 500 mL di Luria-Bertani (LB) medio sterilizzato (Tabella 1) e inoculare una singola colonia di P. aeruginosa nel mezzo. Incubare la coltura per 14 a 15 h a 37 gradi centigradi con una velocità di agitazione di 150 giri/min.</li>
	<li>Distribuisci equamente la coltura batterica in due tubi centrifugati da 500 mL e centrifiche i tubi a 3.220 x g a 4 gradi centigradi per 30 min.</li...

<ol>
	<li>Bischoff, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+permeability&#8211;a+new+target+for+disease+prevention+and+therapy.">Intestinal permeability&#8211;a new target for disease prevention and therapy.</a> BMC Gastroenterology. 14 (1), 189 (2014).</li><li>Peng, L., Li, Z. R., Green, R. S., Holzman, I. R., Lin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Butyrate+enhances+the+intestinal+barrier+by+facilitating+tight+junction+assembly+via+activation+of+AMP-activated+protein+kinase+in+Caco-2+cell+monolayers.">Butyrate enhances the intestinal barrier by facilitating tight junction assembly via activation of AMP-activated protein kinase in Caco-2 cell monolayers.</a> The Journal of Nutrition. 139 (9), 1619-1625 (2009).</li><li>Ren, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+basis+for+intestinal+barrier+against+the+toxicity+of+graphene+oxide.">Developmental basis for intestinal barrier against the toxicity of graphene oxide.</a> Particle Fibre Toxicology. 15 (1), 26 (2018).</li><li>Kissoyan, K. A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+C.+elegans+microbiota+protects+against+infection+via+production+of+a+cyclic+lipopeptide+of+the+viscosin+group.">Natural C. elegans microbiota protects against infection via production of a cyclic lipopeptide of the viscosin group.</a> Current Biology. 29 (6), 1030-1037 (2019).</li><li>Gelino, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+autophagy+improves+healthspan+and+longevity+in+C.+elegans+during+dietary+restriction.">Intestinal autophagy improves healthspan and longevity in C. elegans during dietary restriction.</a> PLoS Genetics. 12 (7), 1006135 (2016).</li><li>Escorcia, W., Ruter, D. L., Nhan, J., Curran, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+lipid+abundance+and+evaluation+of+lipid+distribution+in+Caenorhabditis+elegans+by+Nile+red+and+oil+red+O+staining.">Quantification of lipid abundance and evaluation of lipid distribution in Caenorhabditis elegans by Nile red and oil red O staining.</a> Journal of Visualized Experiments. (133), e57352 (2018).</li><li>Johnson, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advantages+and+disadvantages+of+Caenorhabditis+elegans+for+aging+research.">Advantages and disadvantages of Caenorhabditis elegans for aging research.</a> Experimental Gerontology. 38 (11-12), 1329-1332 (2003).</li><li>Culetto, E., Sattelle, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+Caenorhabditis+elegans+in+understanding+the+function+and+interactions+of+human+disease+genes.">A role for Caenorhabditis elegans in understanding the function and interactions of human disease genes.</a> Human Molecular Genetics. 9 (6), 869-877 (2000).</li><li>Hubbard, E. J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+germ+line:+A+model+for+stem+cell+biology.">Caenorhabditis elegans germ line: A model for stem cell biology.</a> Developmental Dynamics. 236 (12), 3343-3357 (2007).</li><li>Park, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probiotic+Lactobacillus+fermentum+strain+JDFM216+stimulates+the+longevity+and+immune+response+of+Caenorhabditis+elegans+through+a+nuclear+hormone+receptor.">Probiotic Lactobacillus fermentum strain JDFM216 stimulates the longevity and immune response of Caenorhabditis elegans through a nuclear hormone receptor.</a> Scientific Reports. 8, 7441 (2018).</li><li>Kim, Y., Mylonakis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+immune+conditioning+with+the+probiotic+bacterium+Lactobacillus+acidophilus+strain+NCFM+enhances+gram-positive+immune+responses.">Caenorhabditis elegans immune conditioning with the probiotic bacterium Lactobacillus acidophilus strain NCFM enhances gram-positive immune responses.</a> Infection and Immunity. 80 (7), 2500-2508 (2012).</li><li>Nakagawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+and+mechanisms+of+prolongevity+induced+by+Lactobacillus+gasseri+SBT2055+in+Caenorhabditis+elegans.">Effects and mechanisms of prolongevity induced by Lactobacillus gasseri SBT2055 in Caenorhabditis elegans.</a> Aging Cell. 15 (2), 227-236 (2016).</li><li>Dinh, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cranberry+extract+standardized+for+proanthocyanidins+promotes+the+immune+response+of+Caenorhabditis+elegans+to+Vibrio+cholerae+through+the+p38+MAPK+pathway+and+HSF-1.">Cranberry extract standardized for proanthocyanidins promotes the immune response of Caenorhabditis elegans to Vibrio cholerae through the p38 MAPK pathway and HSF-1.</a> PLoS One. 9 (7), 103290 (2014).</li><li>Vayndorf, E. M., Lee, S. S., Liu, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+apple+extracts+increase+lifespan,+healthspan+and+resistance+to+stress+in+Caenorhabditis+elegans.">Whole apple extracts increase lifespan, healthspan and resistance to stress in Caenorhabditis elegans.</a> Journal of Functional Foods. 5 (3), 1236-1243 (2013).</li><li>Huycke, M. M., Abrams, V., Moore, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enterococcus+faecalis+produces+extracellular+superoxide+and+hydrogen+peroxide+that+damages+colonic+epithelial+cell+DNA.">Enterococcus faecalis produces extracellular superoxide and hydrogen peroxide that damages colonic epithelial cell DNA.</a> Carcinogenesis. 23 (3), 529-536 (2002).</li><li>Laughlin, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+key+role+of+Pseudomonas+aeruginosa+PA-I+lectin+on+experimental+gut-derived+sepsis.">The key role of Pseudomonas aeruginosa PA-I lectin on experimental gut-derived sepsis.</a> Annals of Surgery. 232 (1), 133-142 (2000).</li><li>Huang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3,3'-Diindolylmethane+decreases+VCAM-1+expression+and+alleviates+experimental+colitis+via+a+BRCA1-dependent+antioxidant+pathway.">3,3'-Diindolylmethane decreases VCAM-1 expression and alleviates experimental colitis via a BRCA1-dependent antioxidant pathway.</a> Free Radical Biology, Medicine. 50 (2), 228-236 (2011).</li><li>Jeon, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Oral+Administration+of+3,3'-Diindolylmethane+on+Dextran+Sodium+Sulfate-Induced+Acute+Colitis+in+Mice.">Effect of Oral Administration of 3,3'-Diindolylmethane on Dextran Sodium Sulfate-Induced Acute Colitis in Mice.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 64, 7702-7709 (2016).</li><li>Kim, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3,3'-Diindolylmethane+improves+intestinal+permeability+dysfunction+in+cultured+human+intestinal+cells+and+the+model+animal+Caenorhabditis+elegans.">3,3'-Diindolylmethane improves intestinal permeability dysfunction in cultured human intestinal cells and the model animal Caenorhabditis elegans.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 67 (33), 9277-9285 (2019).</li><li>Lee, S. Y., Kang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+the+Effect+of+Chemicals+on+the+Growth+and+Reproduction+of+Caenorhabditis+elegans.">Measuring the Effect of Chemicals on the Growth and Reproduction of Caenorhabditis elegans.</a> Journal of Visualized Experiments. (128), e56437 (2017).</li><li>Schmeisser, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+ROS+signaling+rather+than+AMPK/sirtuin-mediated+energy+sensing+links+dietary+restriction+to+lifespan+extension.">Neuronal ROS signaling rather than AMPK/sirtuin-mediated energy sensing links dietary restriction to lifespan extension.</a> Molecular Metabolism. 2 (2), 92-102 (2013).</li><li>Lee, S. Y., Kim, J. Y., Jung, Y. J., Kang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxicological+evaluation+of+the+topoisomerase+inhibitor,+etoposide,+in+the+model+animal+Caenorhabditis+elegans+and+3T3-L1+normal+murine+cells.">Toxicological evaluation of the topoisomerase inhibitor, etoposide, in the model animal Caenorhabditis elegans and 3T3-L1 normal murine cells.</a> Environmental Toxicology. 32 (6), 1836-1843 (2017).</li><li>Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+Caenorhabditis+elegans+life+span+on+solid+media.">Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media.</a> Journal of Visualized Experiments. (27), e1152 (2009).</li><li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Caenorhabditis+elegans+methods:+synchronization+and+observation.">Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation.</a> Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).</li><li>Al Atya, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probiotic+potential+of+Enterococcus+faecalis+strains+isolated+from+meconium.">Probiotic potential of Enterococcus faecalis strains isolated from meconium.</a> Frontiers in Microbiology. 6, 227 (2015).</li><li>Hanchi, H., Mottawea, W., Sebei, K., Hammami, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Genus+Enterococcus:+Between+Probiotic+Potential+and+Safety+Concerns-An+Update.">The Genus Enterococcus: Between Probiotic Potential and Safety Concerns-An Update.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 1791 (2018).</li><li>Pollack, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+exotoxin+A+in+pseudomonas+disease+and+immunity.">The role of exotoxin A in pseudomonas disease and immunity.</a> Reviews of Infectious Diseases. 5, 979-984 (1983).</li><li>Vasil, M. L., Liu, P. V., Iglewski, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature-dependent+inactivating+factor+of+Pseudomonas+aeruginosa+exotoxin+A.">Temperature-dependent inactivating factor of Pseudomonas aeruginosa exotoxin A.</a> Infection and Immunity. 13 (5), 1467-1472 (1976).</li><li>Horii, T., Muramatsu, H., Monji, A., Miyagishima, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Release+of+exotoxin+A,+peptidoglycan+and+endotoxin+after+exposure+of+clinical+Pseudomonas+aeruginosa+isolates+to+carbapenems+in+vitro.">Release of exotoxin A, peptidoglycan and endotoxin after exposure of clinical Pseudomonas aeruginosa isolates to carbapenems in vitro.</a> Chemotherapy. 51 (6), 324-331 (2005).</li><li>Kirikae, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+characterization+of+endotoxins+released+from+antibiotic-treated+Pseudomonas+aeruginosa+and+Escherichia+coli.">Biological characterization of endotoxins released from antibiotic-treated Pseudomonas aeruginosa and Escherichia coli.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 42 (5), 1015-1021 (1998).</li><li>Morlon-Guyot, J., Mere, J., Bonhoure, A., Beaumelle, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+of+Pseudomonas+aeruginosa+exotoxin+A+is+dispensable+for+cell+intoxication.">Processing of Pseudomonas aeruginosa exotoxin A is dispensable for cell intoxication.</a> Infection and Immunity. 77 (7), 3090-3099 (2009).</li><li>Kim, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3,3'-diindolylmethane+attenuates+colonic+inflammation+and+tumorigenesis+in+mice.">3,3'-diindolylmethane attenuates colonic inflammation and tumorigenesis in mice.</a> Inflammatory Bowel Diseases. 15 (8), 1164-1173 (2009).</li><li>Kanmani, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probiotics+and+its+functionally+valuable+products-a+review.">Probiotics and its functionally valuable products-a review.</a> Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 53 (6), 641-658 (2013).</li><li>Nguyen, M. T., Gotz, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipoproteins+of+Gram-Positive+Bacteria:+Key+Players+in+the+Immune+Response+and+Virulence.">Lipoproteins of Gram-Positive Bacteria: Key Players in the Immune Response and Virulence.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 80 (3), 891-903 (2016).</li></ol>

Utilizzando questo nuovo metodo per determinare la permeabilità intestinale in C. elegans, che combina la microscopia a fluorescenza automatizzata e l'analisi quantitativa delle immagini, le differenze causate da microrganismi intestinali o sostanze chimiche possono essere determinate in vivo, in particolare nell'intestino di C. elegans. Questo protocollo è utile per le indagini sulla permeabilità intestinale e applicabile a molti compiti, come la determinazione reattiva delle specie di ossigeno (ROS...

La permeabilità intestinale è considerata come una delle principali barriere legate al microbiota intestinale e all'immunità mucosale ed è probabile che sia influenzata da diversi fattori, come le modifiche del microbiota intestinale, la compromissione epiteliale o le alterazioni dello strato di muco1. Recenti documenti hanno riportato protocolli efficaci per misurare la permeabilità intestinale delle cellule intestinali umane coltivate analizzando i tassi di flusso di fluorescenza attraverso lo strato di cellule intestinali2, ma meno documenti di ricerca presentano una procedura adatta per misurare la permeabilità intestinale nei nematodi, in particolare in C. elegans, utilizzando la colorazione FITC-dextran.
Ci sono due protocolli rappresentativi per misurare la permeabilità intestinale in C. elegans utilizzando il rosso Nilo3 e il disodio erioglaucine (o il saggio del Puffo)4,5. In questo protocollo, abbiamo usato FITC-dextran (peso molecolare medio 10.000), che ha un peso molecolare molto più elevato rispetto al Nilo rosso (MW - 318,37) e al disodico di erioglaucine (MW - 792,85). FITC-dextran è più simile di rosso del Nilo o coloranti disodio erioglaucina ai nutrienti macromolecolari effettivi come i carboidrati, che vengono assorbiti attraverso lo strato intestinale. La permeabilità intestinale di C. elegans alimentati con erioglaucine disodium (colorante Puffo blu) può essere facilmente valutata senza microscopia a fluorescenza. Tuttavia, nel saggio Puffo, l'analisi quantitativa della permeabilità intestinale è difficile a causa della mancanza di standardizzazione e dovrebbe essere valutata manualmente4,5. Nel caso del saggio rosso del Nilo, il rosso del Nilo macchia anche le goccioline lipidiche nelle cellule, che possono interferire con l'esatta determinazione della permeabilità intestinale in C. elegans6. I protocolli attuali consentono un'analisi quantitativa rapida e precisa della permeabilità intestinale in C. elegans trattati con vari batteri intestinali e sostanze chimiche evitando la colorazione lipidica non specifica.
C. elegans è un modello tipico nei campi biologici grazie al suo prezzo accessibile, alla facilità di manipolazione, alle limitate questioni etiche degli animali e alla breve durata della vita, che è vantaggioso per una rapida sperimentazione7. In particolare, dopo la pubblicazione dell'intero genoma di C. elegans, quasi il 40% dei geni nel genoma di C. elegans è risultato ortologo dei geni che causano malattie umane8. Inoltre, il corpo trasparente consente l'osservazione all'interno dell'organismo, che è vantaggioso per la ricerca di eventi cellulari e per le applicazioni di fluorescenza nella biologia cellulare, ad esempio, colorazione delle cellule staminali con DAPI o immunohistochimica9. C. elegans è spesso usato come animale sperimentale per studiare l'interazione tra il microbiota intestinale e l'ospite; inoltre, C. elegans viene utilizzato per lo screening dei batteri probiotici che promuovono la salute10,11,12 così come sostanze chimiche dietetiche promuovere la salute intestinale13,14.
Pseudomonas aeruginosa e Enterococcus faecalis sono batteri intestinali ben noti che influenzano negativamente il sistema gastrointestinale, in particolare le cellule epiteliali coloniche del tratto intestinale15,16. Pertanto, misurare la permeabilità intestinale innescata da questi batteri è necessario per lo screening e lo sviluppo di nuovi farmaci che possono recuperare e ridurre i danni causati da infiammazione batterica e infezione. In questo protocollo, abbiamo testato gli effetti di questi batteri intestinali sulla permeabilità intestinale di C. elegans.
Riportiamo anche un protocollo ottimizzato per testare sostanze chimiche sulla permeabilità intestinale di C. elegans. A questo scopo, abbiamo usato 3,3'-diindolylmethane (DIM) come prodotto chimico modello perché DIM è un composto di metabolita bioattivo derivato da indole-3-carbinolo, che è presente nelle piante alimentari Brassica, ed è stato segnalato per avere effetti terapeutici sull'IBD nei topi17,18. Inoltre, recentemente abbiamo scoperto che DIM migliora la disfunzione della permeabilità intestinale in entrambe le cellule intestinali umane coltivate, così come il modello nematode C. elegans19.
In questo studio, abbiamo usato tre diverse condizioni sperimentali. In primo luogo, abbiamo misurato gli effetti dei diversi batteri, P. aeruginosa ed E. faecalis, sulla permeabilità intestinale (Figura 1). In secondo luogo, abbiamo misurato gli effetti di P. aeruginosa vivo e inattivato dal calore sulla permeabilità intestinale (Figura 2). In terzo luogo, abbiamo misurato gli effetti del DIM (un modello chimico) sulla permeabilità intestinale di C. elegans alimentati con P. aeruginosa (Figura 3).
L'obiettivo di questo studio era quello di sviluppare protocolli ottimizzati che misurano la permeabilità intestinale di C. elegans, che viene modificata dal trattamento con vari batteri intestinali e con sostanze chimiche.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >3,3&#8217;-diindolylmethane&#160;</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >D9568</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >90&#215;15 mm Petri dishes</td>
			<td >SPL Life Sciences, South Korea</td>
			<td >10090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >60&#215;15 mm Petri dishes</td>
			<td >SPL Life Sciences, South Korea</td>
			<td >10060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bactor Agar</td>
			<td >Beckton Dickinson</td>
			<td >REF. 214010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Formaldehyde solution&#160;</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >F1635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Brain Heart Infusion (BHI)&#160;</td>
			<td >Becton Dickinson</td>
			<td >REF. 237500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Caenorhabditis elegans N2</td>
			<td >Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td ></td>
			<td>Wild type&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cholesterol</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >C3045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Costa Assay Plate, 96 Well Black With Clear Flat Bottom Non-treated, No Lid Polystyrene</td>
			<td >Corning Incorporated</td>
			<td >REF. 3631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dimethyl sulfoxide</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Enterococcus faecalis KCTC 3206</td>
			<td >Korean Collection for Type Culture</td>
			<td >KCTC NO. 3206</td>
			<td>Falcutative anaerobic</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Escherichia coli OP50</td>
			<td >Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fluorescein isothiocyanate - dextran</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >FD10S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Harmony software&#160;</td>
			<td >PerkinElmer</td>
			<td ></td>
			<td>verson 3.5</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Luria-Bertani LB medium</td>
			<td >Merck</td>
			<td >VM743185 626&#160; 1.10285.5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Magnesium sulfate heptahydrate&#160;</td>
			<td >Fisher Bioreagents</td>
			<td >BP2213-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fluoromount aqueous mounting medium</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >F4680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Operetta CLS High-Content Analysis System</td>
			<td >PerkinElmer</td>
			<td>&#160;HH16000000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Peptone</td>
			<td >Merck</td>
			<td >EMD 1.07213.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pseudomonas aeruginosa PA01</td>
			<td >Korean Collection for Type Culture</td>
			<td >KCTC NO. 1637</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium Chloride</td>
			<td >Fisher Bioreagents</td>
			<td >BP358-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Stereo Microscope</td>
			<td >Nikon, Japan</td>
			<td >SMZ800N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Yeast extract</td>
			<td >Becton Dickinson</td>
			<td >REF. 212750</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring the effects of bacteria and chemicals on the intestinal permeability of caenorhabditis elegans

Negli organismi viventi, l'iperpermescopibilità intestinale è un sintomo grave che porta a molte malattie infiammatorie intestinali (IBD). Caenorhabditis elegans è un modello animale non mammaliano che è ampiamente utilizzato come sistema di analisi a causa della sua breve durata di vita, trasparenza, convenienza e mancanza di questioni etiche degli animali. In questo studio, è stato sviluppato un metodo per studiare gli effetti di diversi batteri e 3,3'-diindolylmethane (DIM) sulla permeabilità intestinale di C. elegans con un sistema di analisi delle immagini ad alto contenuto di velocità. I vermi sono stati infettati da diversi batteri intestinali o cotrattati con DIM per 48 h e alimentati con fluoresceinisocianate (FITC)-dextran durante la notte. Quindi, la permeabilità intestinale è stata esaminata confrontando le immagini di fluorescenza e l'intensità della fluorescenza all'interno dei corpi del verme. Questo metodo può anche avere il potenziale per identificare i batteri intestinali probiotici e patogeni che influenzano la permeabilità intestinale nel modello animale ed è efficace per esaminare gli effetti di sostanze chimiche dannose o che promuovono la salute sulla permeabilità intestinale e salute intestinale. Tuttavia, questo protocollo ha anche alcune notevoli limitazioni a livello genetico, soprattutto per determinare quali geni vengono modificati per controllare la malattia, perché questo metodo è utilizzato principalmente per la determinazione fenotipica. Inoltre, questo metodo si limita a determinare esattamente quali substrati patogeni causano infiammazione o aumentano la permeabilità dell'intestino dei vermi durante l'infezione. Pertanto, ulteriori studi approfonditi, tra cui lo studio del meccanismo genetico molecolare utilizzando batteri mutanti e nematodi, nonché l'analisi dei componenti chimici dei batteri, sono necessari per valutare completamente la funzione dei batteri e sostanze chimiche nel determinare la permeabilità intestinale.

Dopo l'incubazione con P. aeruginosa PAO1, C. elegans ha mostrato un aumento significativo della fluorescenza FITC-dextran nel corpo del verme rispetto alla fluorescenza mostrata dopo l'incubazione con gli altri due ceppi batterici (Figura 1). Le intensità di fluorescenza dei vermi alimentati con E. coli OP50, P. aeruginosa PAO1 e E. faecalis KCTC3206 erano rispettivamente 100.0 6.6, 369,7 x 38,9, e 105,6 - 10,6%. I dati sottolineano che P. a...

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Measuring the Effects of Bacteria and Chemicals on the Intestinal Permeability of Caenorhabditis elegans

Questo protocollo descrive come misurare la permeabilità intestinale di Caenorhabditis elegans. Questo metodo è utile per la ricerca biologica di base sulla salute intestinale relativa all'interazione tra i batteri intestinali e il loro ospite e per lo screening per identificare gli agenti probiotici e chimici per curare la sindrome dell'intestino che perde e le malattie infiammatorie intestinali.

Misurazione degli effetti di batteri e sostanze chimiche sulla permeabilità intestinale della caenorhabditis elegans

In living organisms, intestinal hyperpermeability is a serious symptom that leads to many inflammatory bowel diseases (IBDs). Caenorhabditis elegans is a ...

Questo metodo sarà utile per studi biologici di base relativi all'interazione tra microbiota intestinale e salute intestinale. Inoltre, questo protocollo può essere utilizzato per lo screening di potenziali probiotici e nutraceutici per curare i problemi di salute intestinale, come la sindrome intestinale che perde e le malattie infiammatorie intestinali. Questo protocollo utilizza un sistema di imaging ad alta produttività per consentire un'analisi quantitativa rapida e precisa della permeabilità intestinale nei C.elegans trattati con vari batteri e sostanze chimiche.Si consiglia a uno scienziato che non ha familiarità con questa tecnica di limita il numero di campioni al fine di evitare errori di etichettatura e altri errori. Questa procedura consiste in molti passaggi che richiedono una dimostrazione visiva, come il trasferimento di worm su piastre da 96 pozzi e l'utilizzo della macchina Operetta, nonché del software Harmony. Inizia preparando 500 millilitri di mezzo LB sterile.Inoculare una singola colonia di P.aeruginosa nel mezzo e incubare la coltura per 14-15 ore a 37 gradi Celsius mentre si trema a 150 giri/min. Il giorno dopo, distribuire uniformemente la coltura batterica in due tubi da 500 millilitri e centrifugarli a 3, 220 volte g e quattro gradi Celsius per 30 minuti. Rimuovere il supernatante, lasciando 25 millilitri in ogni tubo, per un volume totale rimanente di 50 millilitri, quindi rimescolare il pellet batterico.Conservare la coltura batterica a quattro gradi Celsius fino a quando non è pronto per l'uso. Per testare gli effetti dei batteri sulla permeabilità intestinale dei C.elegans, rimuovere le colture dal frigorifero e vortice a fondo. Aggiungere un totale di 800 microlitri a ogni piastra NGM fresca e lasciare asciugare le piastre in un incubatore Celsius di 20 gradi durante la notte.Per preparare piatti DIM, aggiungere 50 millilitri di mezzo agar NGM in una bottiglia di DIM contenente brodo NGM e mescolare accuratamente. Quindi, versare 20 millilitri del mezzo in ogni piastra di Petri da 90 per 15 millimetri. Preparare le piastre DMSO aggiungendo 20 millilitri di DMSO contenenti mezzo NGM a ogni piastra di Petri e lasciare le piastre a temperatura ambiente per almeno tre ore per solidificarsi.Stendere 800 microlitri di coltura vortice di E.coli o P.aeruginosa su ogni piastra NGM fresca e lasciare asciugare le piastre in un incubatore Celsius di 20 gradi durante la notte. Lavare le larve L4 sincronizzate con l'età con S-buffer e trasferire circa 500 vermi sulle piastre NGM contenenti diversi batteri e sostanze chimiche. Quindi, incubare le piastre a 20 gradi Celsius per 48 ore.Preparare le piastre integrate da FITC-dextran mescolando due millilitri di E.coli inattivato dal calore con quattro milligrammi di FITC-dextran. Aggiungere 100 microlitri della miscela a ciascuna delle 20 piastre di agar NGM fresche e lasciare asciugare le piastre per un'ora su un banco da laboratorio pulito. Dopo 48 ore di trattamento, lavare i vermi con S-buffer, trasferirli su piastre integrate in FITC-dextran e su piastre NGM senza FITC-dextran e incubare le piastre durante la notte.Il giorno dopo, lavare i vermi con S-buffer e consentire loro di strisciare nella piastra di agar NGM fresca per un'ora. Aggiungere 50 microlitri di formaldeide al 4% a ciascun pozzo di una piastra nera a 96 poggia-piatta e trasferire circa 50 vermi in ogni pozzo. Dopo uno o due minuti, rimuovere tutta la formaldeide e aggiungere 100 microlitri di mezzo di montaggio in ogni pozzo.La formaldeide è una sostanza chimica tossica e deve essere maneggiata con cura. Per acquisire immagini fluorescenti, premere l'icona Apri coperchio all'interno del software di imaging e inserire la piastra nella macchina. Fate clic su Imposta (Setup), selezionate il tipo di piastra e aggiungete i canali brightfield ed EGFP.Per regolare il layout, passare alla selezione Layout e selezionare Traccia. Impostare la prima immagine a un micrometro, il numero di piani su 10 e la distanza da un micrometro. Selezionare uno dei pozzi di trattamento e un campo di acquisizione e premere Test nella sezione Esegui esperimento.Se le immagini sono soddisfacenti, tornare alla sezione Setup e premere l'icona Reimposta. Quindi, seleziona tutti i pozzi di destinazione e un numero adatto di campi di acquisizione. Passare a Esegui esperimento, immettere il nome della piastra e premere Start.Per misurare l'intensità della fluorescenza, passare alla sezione Analisi immagine, inserire l'immagine e trovare la cella scegliendo il canale EGFP e il metodo B.Regolare i parametri in base alle direzioni del manoscritto e scegliere la media come output. Premere l'icona Applica per salvare la configurazione. Ottenere una mappa termica e una tabella dati andando alla sezione Valutazione e regolare il parametro di lettura, quindi avviare la valutazione.I C.elegans hanno mostrato un aumento significativo della fluorescenza FITC-dextran dopo l'incubazione con P.aeruginosa rispetto agli altri due ceppi batterici, indicando che P.aeruginosa ha causato danni più vitali alla barriera intestinale epiteliale e una maggiore permeabilità intestinale. La P.aeruginosa viva e inattivata dal calore ha innescato effetti molto diversi sulla permeabilità intestinale nei C.elegans. Al momento dell'inattivazione termica, sia le immagini a fluorescenza che i dati statistici indicano che P.aeruginosa non ha innescato alcuna tossicità per i nematodi.Un co-trattamento di 48 ore con DIM ha diminuito significativamente l'intensità di fluorescenza FITC-dextran all'interno delle viscere dei vermi esposti a P.aeruginosa, il che dimostra che DIM può essere considerato un buon prodotto naturale per curare la disfunzione della permeabilità intestinale causata da infezioni batteriche. È importante ricordare che durante la preparazione delle piastre rivestite in FITC-dextran, è necessario ridurre al minimo l'esposizione alla luce a causa della sensibilità alla luce di FITC-dextran. Questa tecnica può essere utilizzata per determinare gli effetti patogeni e probiotici dei batteri intestinali e dei loro componenti attivi testando i batteri, così come la loro composizione chimica.

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Medicine

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