Name: measuring the effects of bacteria and chemicals on the intestinal permeability of caenorhabditis elegans
Uploaded: 2019-12-03T13:30:00
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본 연구는 한국과학기술원 내연구보조금(2E29563)의 지원을 받았다.

1. P. aeruginosa PAO1 및 대장균 OP50 배양준비
<ol><li>멸균된 루리아-베르타니(LB)배지(표 1)의500 mL를 준비하고 P. aeruginosa의 단일 콜로니를 배지에 접종하였다. 37°C에서 14~15시간 동안 배양하고 150 rpm의 흔들림 속도로 배양한다.</li>
	<li>세균 배양을 2개의 500 mL 원심분리기 튜브에 균등하게 분배하고 30분 동안 4°C에서 3,220 x g에서 튜브를 원심분리합니다.</li>
	<li>부?...

<ol>
	<li>Bischoff, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+permeability&#8211;a+new+target+for+disease+prevention+and+therapy.">Intestinal permeability&#8211;a new target for disease prevention and therapy.</a> BMC Gastroenterology. 14 (1), 189 (2014).</li><li>Peng, L., Li, Z. R., Green, R. S., Holzman, I. R., Lin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Butyrate+enhances+the+intestinal+barrier+by+facilitating+tight+junction+assembly+via+activation+of+AMP-activated+protein+kinase+in+Caco-2+cell+monolayers.">Butyrate enhances the intestinal barrier by facilitating tight junction assembly via activation of AMP-activated protein kinase in Caco-2 cell monolayers.</a> The Journal of Nutrition. 139 (9), 1619-1625 (2009).</li><li>Ren, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+basis+for+intestinal+barrier+against+the+toxicity+of+graphene+oxide.">Developmental basis for intestinal barrier against the toxicity of graphene oxide.</a> Particle Fibre Toxicology. 15 (1), 26 (2018).</li><li>Kissoyan, K. A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+C.+elegans+microbiota+protects+against+infection+via+production+of+a+cyclic+lipopeptide+of+the+viscosin+group.">Natural C. elegans microbiota protects against infection via production of a cyclic lipopeptide of the viscosin group.</a> Current Biology. 29 (6), 1030-1037 (2019).</li><li>Gelino, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+autophagy+improves+healthspan+and+longevity+in+C.+elegans+during+dietary+restriction.">Intestinal autophagy improves healthspan and longevity in C. elegans during dietary restriction.</a> PLoS Genetics. 12 (7), 1006135 (2016).</li><li>Escorcia, W., Ruter, D. L., Nhan, J., Curran, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+lipid+abundance+and+evaluation+of+lipid+distribution+in+Caenorhabditis+elegans+by+Nile+red+and+oil+red+O+staining.">Quantification of lipid abundance and evaluation of lipid distribution in Caenorhabditis elegans by Nile red and oil red O staining.</a> Journal of Visualized Experiments. (133), e57352 (2018).</li><li>Johnson, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advantages+and+disadvantages+of+Caenorhabditis+elegans+for+aging+research.">Advantages and disadvantages of Caenorhabditis elegans for aging research.</a> Experimental Gerontology. 38 (11-12), 1329-1332 (2003).</li><li>Culetto, E., Sattelle, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+Caenorhabditis+elegans+in+understanding+the+function+and+interactions+of+human+disease+genes.">A role for Caenorhabditis elegans in understanding the function and interactions of human disease genes.</a> Human Molecular Genetics. 9 (6), 869-877 (2000).</li><li>Hubbard, E. J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+germ+line:+A+model+for+stem+cell+biology.">Caenorhabditis elegans germ line: A model for stem cell biology.</a> Developmental Dynamics. 236 (12), 3343-3357 (2007).</li><li>Park, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probiotic+Lactobacillus+fermentum+strain+JDFM216+stimulates+the+longevity+and+immune+response+of+Caenorhabditis+elegans+through+a+nuclear+hormone+receptor.">Probiotic Lactobacillus fermentum strain JDFM216 stimulates the longevity and immune response of Caenorhabditis elegans through a nuclear hormone receptor.</a> Scientific Reports. 8, 7441 (2018).</li><li>Kim, Y., Mylonakis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+immune+conditioning+with+the+probiotic+bacterium+Lactobacillus+acidophilus+strain+NCFM+enhances+gram-positive+immune+responses.">Caenorhabditis elegans immune conditioning with the probiotic bacterium Lactobacillus acidophilus strain NCFM enhances gram-positive immune responses.</a> Infection and Immunity. 80 (7), 2500-2508 (2012).</li><li>Nakagawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+and+mechanisms+of+prolongevity+induced+by+Lactobacillus+gasseri+SBT2055+in+Caenorhabditis+elegans.">Effects and mechanisms of prolongevity induced by Lactobacillus gasseri SBT2055 in Caenorhabditis elegans.</a> Aging Cell. 15 (2), 227-236 (2016).</li><li>Dinh, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cranberry+extract+standardized+for+proanthocyanidins+promotes+the+immune+response+of+Caenorhabditis+elegans+to+Vibrio+cholerae+through+the+p38+MAPK+pathway+and+HSF-1.">Cranberry extract standardized for proanthocyanidins promotes the immune response of Caenorhabditis elegans to Vibrio cholerae through the p38 MAPK pathway and HSF-1.</a> PLoS One. 9 (7), 103290 (2014).</li><li>Vayndorf, E. M., Lee, S. S., Liu, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+apple+extracts+increase+lifespan,+healthspan+and+resistance+to+stress+in+Caenorhabditis+elegans.">Whole apple extracts increase lifespan, healthspan and resistance to stress in Caenorhabditis elegans.</a> Journal of Functional Foods. 5 (3), 1236-1243 (2013).</li><li>Huycke, M. M., Abrams, V., Moore, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enterococcus+faecalis+produces+extracellular+superoxide+and+hydrogen+peroxide+that+damages+colonic+epithelial+cell+DNA.">Enterococcus faecalis produces extracellular superoxide and hydrogen peroxide that damages colonic epithelial cell DNA.</a> Carcinogenesis. 23 (3), 529-536 (2002).</li><li>Laughlin, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+key+role+of+Pseudomonas+aeruginosa+PA-I+lectin+on+experimental+gut-derived+sepsis.">The key role of Pseudomonas aeruginosa PA-I lectin on experimental gut-derived sepsis.</a> Annals of Surgery. 232 (1), 133-142 (2000).</li><li>Huang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3,3'-Diindolylmethane+decreases+VCAM-1+expression+and+alleviates+experimental+colitis+via+a+BRCA1-dependent+antioxidant+pathway.">3,3'-Diindolylmethane decreases VCAM-1 expression and alleviates experimental colitis via a BRCA1-dependent antioxidant pathway.</a> Free Radical Biology, Medicine. 50 (2), 228-236 (2011).</li><li>Jeon, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Oral+Administration+of+3,3'-Diindolylmethane+on+Dextran+Sodium+Sulfate-Induced+Acute+Colitis+in+Mice.">Effect of Oral Administration of 3,3'-Diindolylmethane on Dextran Sodium Sulfate-Induced Acute Colitis in Mice.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 64, 7702-7709 (2016).</li><li>Kim, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3,3'-Diindolylmethane+improves+intestinal+permeability+dysfunction+in+cultured+human+intestinal+cells+and+the+model+animal+Caenorhabditis+elegans.">3,3'-Diindolylmethane improves intestinal permeability dysfunction in cultured human intestinal cells and the model animal Caenorhabditis elegans.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 67 (33), 9277-9285 (2019).</li><li>Lee, S. Y., Kang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+the+Effect+of+Chemicals+on+the+Growth+and+Reproduction+of+Caenorhabditis+elegans.">Measuring the Effect of Chemicals on the Growth and Reproduction of Caenorhabditis elegans.</a> Journal of Visualized Experiments. (128), e56437 (2017).</li><li>Schmeisser, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+ROS+signaling+rather+than+AMPK/sirtuin-mediated+energy+sensing+links+dietary+restriction+to+lifespan+extension.">Neuronal ROS signaling rather than AMPK/sirtuin-mediated energy sensing links dietary restriction to lifespan extension.</a> Molecular Metabolism. 2 (2), 92-102 (2013).</li><li>Lee, S. Y., Kim, J. Y., Jung, Y. J., Kang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxicological+evaluation+of+the+topoisomerase+inhibitor,+etoposide,+in+the+model+animal+Caenorhabditis+elegans+and+3T3-L1+normal+murine+cells.">Toxicological evaluation of the topoisomerase inhibitor, etoposide, in the model animal Caenorhabditis elegans and 3T3-L1 normal murine cells.</a> Environmental Toxicology. 32 (6), 1836-1843 (2017).</li><li>Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+Caenorhabditis+elegans+life+span+on+solid+media.">Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media.</a> Journal of Visualized Experiments. (27), e1152 (2009).</li><li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Caenorhabditis+elegans+methods:+synchronization+and+observation.">Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation.</a> Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).</li><li>Al Atya, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probiotic+potential+of+Enterococcus+faecalis+strains+isolated+from+meconium.">Probiotic potential of Enterococcus faecalis strains isolated from meconium.</a> Frontiers in Microbiology. 6, 227 (2015).</li><li>Hanchi, H., Mottawea, W., Sebei, K., Hammami, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Genus+Enterococcus:+Between+Probiotic+Potential+and+Safety+Concerns-An+Update.">The Genus Enterococcus: Between Probiotic Potential and Safety Concerns-An Update.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 1791 (2018).</li><li>Pollack, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+exotoxin+A+in+pseudomonas+disease+and+immunity.">The role of exotoxin A in pseudomonas disease and immunity.</a> Reviews of Infectious Diseases. 5, 979-984 (1983).</li><li>Vasil, M. L., Liu, P. V., Iglewski, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature-dependent+inactivating+factor+of+Pseudomonas+aeruginosa+exotoxin+A.">Temperature-dependent inactivating factor of Pseudomonas aeruginosa exotoxin A.</a> Infection and Immunity. 13 (5), 1467-1472 (1976).</li><li>Horii, T., Muramatsu, H., Monji, A., Miyagishima, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Release+of+exotoxin+A,+peptidoglycan+and+endotoxin+after+exposure+of+clinical+Pseudomonas+aeruginosa+isolates+to+carbapenems+in+vitro.">Release of exotoxin A, peptidoglycan and endotoxin after exposure of clinical Pseudomonas aeruginosa isolates to carbapenems in vitro.</a> Chemotherapy. 51 (6), 324-331 (2005).</li><li>Kirikae, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+characterization+of+endotoxins+released+from+antibiotic-treated+Pseudomonas+aeruginosa+and+Escherichia+coli.">Biological characterization of endotoxins released from antibiotic-treated Pseudomonas aeruginosa and Escherichia coli.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 42 (5), 1015-1021 (1998).</li><li>Morlon-Guyot, J., Mere, J., Bonhoure, A., Beaumelle, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+of+Pseudomonas+aeruginosa+exotoxin+A+is+dispensable+for+cell+intoxication.">Processing of Pseudomonas aeruginosa exotoxin A is dispensable for cell intoxication.</a> Infection and Immunity. 77 (7), 3090-3099 (2009).</li><li>Kim, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3,3'-diindolylmethane+attenuates+colonic+inflammation+and+tumorigenesis+in+mice.">3,3'-diindolylmethane attenuates colonic inflammation and tumorigenesis in mice.</a> Inflammatory Bowel Diseases. 15 (8), 1164-1173 (2009).</li><li>Kanmani, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probiotics+and+its+functionally+valuable+products-a+review.">Probiotics and its functionally valuable products-a review.</a> Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 53 (6), 641-658 (2013).</li><li>Nguyen, M. T., Gotz, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipoproteins+of+Gram-Positive+Bacteria:+Key+Players+in+the+Immune+Response+and+Virulence.">Lipoproteins of Gram-Positive Bacteria: Key Players in the Immune Response and Virulence.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 80 (3), 891-903 (2016).</li></ol>

자동 형광 현미경 및 정량적 이미지 분석을 결합한 C. elegans의 창자 투과성을 결정하는 이 새로운 방법을 활용하여 장내 미생물 이나 화학 물질에 의한 차이를 생체 내에서, 특히 C. elegans 장에서 결정할 수 있습니다. 이 프로토콜은 장 투과성 조사에 유용하며 편리하고 쉬운 조작으로 인해 스트레스 조건 및 형태 학적 검사에서 반응성 산소 종 (ROS) 측정과 같은 많은 작업에 적용 할 수 ...

장 투과성은 장내 미생물 및 점막 면역과 관련된 주요 장벽 중 하나로 간주되며 장내 미생물 변형, 상피 손상 또는 점액 층 변경과 같은 여러 요인에 의해 영향을 받을 가능성이1. 최근 논문은 장 세포 층2에걸쳐 형광 플럭스 비율을 분석하여 배양 인간 장의 장 투과성을 측정하는 효과적인 프로토콜을보고, 하지만 적은 연구 논문은 선충에서 창자 투과도를 측정하기위한 적절한 절차를 제시, 특히 C. elegans에서,FITC-dextran 염색을 사용하여.
나일 레드3 및 에리오글라우신 디소듐(또는 스머프 분석)을 사용하여 C. 예쁜꼬마선충의 장 투과성을 측정하기 위한 두 가지 대표적인 프로토콜이있다 4,5. 이 프로토콜에서는 나일 레드(MW = 318.37) 및 에리오글라우신 디소듐(MW = 792.85)보다 훨씬 높은 분자량을 가지는 FITC-dextran(평균 분자량 10,000)을 사용했습니다. FITC-dextran은 나일 강색 또는 에리오글라우신 디소듐 염료보다 장층을 통해 흡수되는 탄수화물과 같은 실제 다량 분자 영양소와 더 유사합니다. 에리오글라우신 디소듐(blue Smurf 염료)을 공급받은 C. 예쁜꼬마선충의 장 투과성은 형광 현미경 검사법 없이 쉽게 평가할 수 있습니다. 그러나, 스머프 분석법에서는, 장 투과성의 정량적 분석은 표준화의 부족으로 인해 어렵고 수동으로 평가되어야한다4,5. 나일 붉은 분석의 경우, 나일 레드는 또한 C. elegans6에서창자 투과성의 정확한 결정을 방해할 수 있는 세포에 있는 지질 방울을 얼룩지게 합니다. 본 프로토콜은 비특이적 지질 염색을 피하면서 다양한 장내 세균및 화학물질로 처리된 C. elegans의 장 투과성의 신속하고 정확한 정량적 분석을 가능하게 합니다.
C. 예쁜꼬마선충은 저렴한 가격, 쉬운 조작, 제한된 동물 윤리 문제 및 짧은 수명으로 인해 생물학적 분야에서 전형적인 모델로, 빠른 실험에 도움이 되는7. 특히, 전체 C. elegans 게놈이 발표된 후, C. elegans 게놈에 있는 유전자의 거의 40%는 인간 질병을 일으키는 원인이 되는 유전자에 정형고인 것으로 나타났습니다8. 더욱이, 투명한 체체는 세포 체내 관찰을 가능하게 하며, 이는 세포 체적 사건을 연구하고 세포 생물학에서 형광 적용, 예를 들어, DAPI 또는 면역 조직화학으로 염색하는 줄기 세포 에 유리하다9. C. 예쁜꼬마선충은 종종 장내 미생물과 숙주 간의 상호작용을 연구하기 위해 실험동물로 사용된다. 또한, C. elegans는 장건강을증진시키는 식이 화학물질뿐만 아니라 건강 증진 프로바이오틱박테리아10,11,12를 선별하는데 사용된다.
슈도모나스 녹농균 및 장내 대변은 위장시스템, 특히 장의 대장상피세포(15,16)에부정적인 영향을 미치는 잘 알려진 장내 세균이다. 따라서, 이러한 박테리아에 의해 유발된 장 투과성을 측정하는 것은 세균염증 및 감염으로 인한 손상을 회복및 감소시킬 수 있는 신약의 스크리닝 및 개발에 필요하다. 이 프로토콜에서는 C. elegans의장 투과성에 대한 이러한 장 내 세균의 영향을 테스트했습니다.
우리는 또한 C. elegans의장 투과성에 화학 물질을 테스트하기위한 최적화 된 프로토콜을보고합니다. 이를 위해, 우리는 3,3'-디인돌릴메탄(DIM)을 모델 화학물질로 사용했는데, DIM은 브라시카 식품 식물에 존재하는 인돌-3-카르비놀에서 유래한 생리활성 대사산물 화합물이기 때문에, 마우스17,18에서IBD에 치료 효과가 있는 것으로 보고되었다. 또한, 우리는 최근 DIM이 배양된 인간 장 세포뿐만 아니라 모델 선충 C. elegans19모두에서 장 투과성 기능 장애를 개선한다는 것을 발견했습니다.
이 연구에서는 세 가지 다른 실험 조건을 사용했습니다. 먼저, 우리는 다른 박테리아의 효과를 측정, P. aeruginosa 및 E. 대변, 장 투과성에(그림 1). 둘째, 우리는 장 투과성에 대한 살아있는 및 열 불활성화 P. aeruginosa의 효과를 측정했습니다(그림 2). 셋째, 우리는 Dim (모델 화학 물질)이 P. aeruginosa로 공급된 C. 예쁜꼬마선충의 장 투과성에 미치는 영향을 측정했습니다(그림3).
이 연구의 목적은 화학 물질뿐만 아니라 다양한 장내 박테리아로 치료에 의해 변경되는 C. elegans의장 투과성을 측정하는 최적화 된 프로토콜을 개발하는 것이었습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >3,3&#8217;-diindolylmethane&#160;</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >D9568</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >90&#215;15 mm Petri dishes</td>
			<td >SPL Life Sciences, South Korea</td>
			<td >10090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >60&#215;15 mm Petri dishes</td>
			<td >SPL Life Sciences, South Korea</td>
			<td >10060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bactor Agar</td>
			<td >Beckton Dickinson</td>
			<td >REF. 214010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Formaldehyde solution&#160;</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >F1635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Brain Heart Infusion (BHI)&#160;</td>
			<td >Becton Dickinson</td>
			<td >REF. 237500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Caenorhabditis elegans N2</td>
			<td >Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td ></td>
			<td>Wild type&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cholesterol</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >C3045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Costa Assay Plate, 96 Well Black With Clear Flat Bottom Non-treated, No Lid Polystyrene</td>
			<td >Corning Incorporated</td>
			<td >REF. 3631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dimethyl sulfoxide</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Enterococcus faecalis KCTC 3206</td>
			<td >Korean Collection for Type Culture</td>
			<td >KCTC NO. 3206</td>
			<td>Falcutative anaerobic</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Escherichia coli OP50</td>
			<td >Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fluorescein isothiocyanate - dextran</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >FD10S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Harmony software&#160;</td>
			<td >PerkinElmer</td>
			<td ></td>
			<td>verson 3.5</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Luria-Bertani LB medium</td>
			<td >Merck</td>
			<td >VM743185 626&#160; 1.10285.5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Magnesium sulfate heptahydrate&#160;</td>
			<td >Fisher Bioreagents</td>
			<td >BP2213-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fluoromount aqueous mounting medium</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >F4680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Operetta CLS High-Content Analysis System</td>
			<td >PerkinElmer</td>
			<td>&#160;HH16000000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Peptone</td>
			<td >Merck</td>
			<td >EMD 1.07213.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pseudomonas aeruginosa PA01</td>
			<td >Korean Collection for Type Culture</td>
			<td >KCTC NO. 1637</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium Chloride</td>
			<td >Fisher Bioreagents</td>
			<td >BP358-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Stereo Microscope</td>
			<td >Nikon, Japan</td>
			<td >SMZ800N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Yeast extract</td>
			<td >Becton Dickinson</td>
			<td >REF. 212750</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring the effects of bacteria and chemicals on the intestinal permeability of caenorhabditis elegans

살아있는 유기체에서 장 과다 투과성은 많은 염증성 장 질환 (IBDs)으로 이어지는 심각한 증상입니다. Caenorhabditis 예쁜꼬마선충은 짧은 수명, 투명성, 비용 효율성 및 동물 윤리 문제의 부족으로 인해 분석 시스템으로 널리 사용되는 비 포유류 동물 모델입니다. 이 연구에서는, 높은 처리량의 심상 분석 시스템을 가진 C. 예쁜꼬마선충의 장 투과성에 다른 박테리아 및 3,3'-diindolylmethane (DIM)의 효력을 조사하기 위하여 개발된 방법. 벌레는 다른 창자 박테리아에 감염되거나 48 시간 동안 DIM으로 공동 처리되었고 플루오레세인 이소티오차네이트 (FITC)-덱스렌을 하룻밤 동안 공급하였다. 이어서, 장 투과성은 웜 체 내부의 형광 이미지와 형광 강도를 비교하여 조사되었다. 이 방법은 또한 동물 모델에서 장 침투성에 영향을 미치는 probiotic 및 병원 성 장 내 박테리아를 식별 하는 잠재력을 가질 수 있습니다 및 장 투과성 및 장 건강에 유해 하거나 건강 증진 화학 물질의 효과 검사에 대 한 효과적. 그러나, 이 프로토콜은 또한 유전 수준에 있는 몇몇 상당한 제한이 있습니다, 특히 이 방법은 주로 현상형 결정에 사용되기 때문에, 질병을 통제하기 위하여 변경되는 유전자를 결정하기위한. 또한,이 방법은 감염 시 염증을 일으키거나 벌레의 침투성을 증가시키는 병원성 기질이 정확히 무엇인지 결정하는 데 국한됩니다. 따라서, 박테리아의 화학 성분 분석 뿐만 아니라 돌연변이 박테리아와 선충을 이용한 분자 유전 적 메커니즘의 조사를 포함하여 추가심도 연구가 필요하며, 장 투과성을 결정하는 박테리아와 화학 물질의 기능을 완전히 평가할 필요가 있다.

P. aeruginosa PAO1을 가진 배양 후에, C. 예쁜꼬마선충은 다른 2개의 세균성 긴장으로 배양 후에 도시된 형광에 비해 웜 바디에 있는 FITC-dextran 형광에 있는 유의한 증가를 보여주었습니다(그림 1). 대장균 OP50, P. aeruginosa PAO1 및 E. faecalis KCTC3206을 공급한 벌레의 형광 강도는 각각 100.0±6. 369.7±38.9, 및 105.6±10.6%였다. 데이터는 P. aeruginosa가 상피...

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Measuring the Effects of Bacteria and Chemicals on the Intestinal Permeability of Caenorhabditis elegans

이 프로토콜은 예쁜꼬마선충의장 투과성을 측정하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 장 내 박테리아와 숙주 간의 상호 작용과 관련된 장 건강에 대한 기본 생물학적 연구와 새는 장 증후군 및 염증성 장 질환을 치료하는 프로바이오틱 및 화학 약제 식별 스크리닝에 유용합니다.

케노하브디티스 예쁜꼬마선충의 장 내 침투성에 대한 박테리아와 화학물질의 영향 측정

In living organisms, intestinal hyperpermeability is a serious symptom that leads to many inflammatory bowel diseases (IBDs). Caenorhabditis elegans is a ...

이 방법은 장 내 미생물과 창자 건강 사이 상호 작용과 관련 있는 기본적인 생물학 연구 결과에 도움이 될 것입니다. 또한,이 프로토콜은 잠재적 인 프로바이오틱스와 영양학을 선별하여 새는 장 증후군 및 염증성 장 질환과 같은 장 건강 문제를 치료하는 데 사용될 수 있습니다. 이 프로토콜은 고처리량 이미징 시스템을 사용하여 다양한 박테리아와 화학 물질로 치료된 C.elegans의 장 투과성에 대한 신속하고 정밀한 정량적 분석을 가능하게 합니다.이 기술에 익숙하지 않은 과학자는 라벨이 잘못 된 다른 실수를 피하기 위해 샘플 수를 제한하는 것이 좋습니다. 이 절차는 웜을 96웰 플레이트로 옮기고 오페레타 머신을 사용하는 것과 하모니 소프트웨어와 같은 시각적 데모가 필요한 많은 단계로 구성됩니다. 멸균 LB 배지의 500 밀리리터를 준비하여 시작합니다.P.aeruginosa의 단일 식민지를 매체에 접종하고 150 rpm에서 흔들면서 섭씨 37도에서 14 ~ 15 시간 동안 문화를 배양합니다. 다음 날, 균 문화를 500 밀리리터 튜브 두 개로 고르게 분배하고, 원심분리기는 3, 220배, 섭씨 4도에서 30분간 분배합니다. 수퍼나탄을 제거하고 각 튜브에 25밀리리터를 남기고, 남은 총 부피 50밀리리터를 한 다음 세균성 펠릿을 다시 분리합니다.사용 준비가 될 때까지 세균 문화를 섭씨 4도에 저장합니다. C.elegans의 장 투과성에 대한 박테리아의 효과를 테스트하려면 냉장고에서 배양을 제거하고 철저히 소용돌이합니다. 신선한 NGM 플레이트에 총 800마이크로리터를 추가하고 밤새 섭씨 20도의 인큐베이터에서 플레이트를 건조시다.DIM 플레이트를 준비하려면 NGM 화약 50밀리리터를 NGM 국물을 함유한 DIM 병에 넣고 철저히 섞습니다. 그런 다음 매질의 20 밀리리터를 90-15mm 페트리 접시에 붓습니다. 각 페트리 접시에 NGM 배지가 함유된 DMSO 20 밀리리터를 첨가하여 DMSO 플레이트를 준비하고, 플레이트를 3시간 이상 실온에 두어 고화시십시오.800 마이크로리터의 소용돌이E.coli 또는 P.aeruginosa 배양기를 각각의 신선한 NGM 플레이트에 퍼뜨리고, 플레이트가 하룻밤 사이에 섭씨 20도에서 건조할 수 있도록 합니다. 노화 동기화 된 L4 애벌레를 S 버퍼로 씻고 약 500 개의 벌레를 다른 박테리아와 화학 물질을 포함하는 NGM 플레이트로 이송하십시오. 그런 다음 48 시간 동안 섭씨 20도에서 플레이트를 배양하십시오.FITC-dextran-보충 플레이트는 FITC-dextran 4밀리그램의 열 비활성화 된 E.coli 2 밀리리터를 혼합하여 준비하십시오. 20개의 신선한 NGM 한천 접시에 혼합물 100마이크로리터를 추가하고 깨끗한 실험실 벤치에서 1시간 동안 플레이트를 건조시다. 48시간의 치료 후, 웜을 S 버퍼로 세척하고 FITC-dextran 보충 플레이트로 옮기고 FITC-dextran없이 NGM 플레이트로 옮기고 하룻밤 동안 플레이트를 배양하십시오.다음 날, S 버퍼로 벌레를 씻고 신선한 NGM 한천 접시에서 1 시간 동안 크롤링 할 수 있습니다. 검은 색, 96 웰, 평평한 바닥 플레이트의 각 우물에 4 %의 포름 알데히드의 50 마이크로 리터를 추가하고 각 우물에 약 50 개의 벌레를 전달합니다. 1-2분 후 포름알데히드를 모두 제거하고 각 웰에 100마이크로리터의 장착 매체를 추가합니다.포름알데히드는 독성 화학 물질이며 주의하여 처리해야합니다. 형광 이미지를 캡처하려면 이미징 소프트웨어 내에서 열린 뚜껑 아이콘을 누르고 플레이트를 컴퓨터에 삽입합니다. 설정을 클릭하고 플레이트 유형을 선택하고 밝은 필드 및 EGFP 채널을 추가합니다.레이아웃을 조정하려면 레이아웃 선택으로 이동하여 트랙을 선택합니다. 첫 번째 그림을 하나의 마이크로미터, 비행기 수에서 10으로 설정하고 1 마이크로미터까지의 거리를 설정합니다. 치료 우물 중 하나와 하나의 캡처 필드를 선택하고 실행 실험 섹션에서 테스트를 누릅니다.이미지가 만족스럽으면 설정 섹션으로 돌아가 리셋 아이콘을 누릅니다. 그런 다음 모든 대상 우물과 적절한 수의 캡처 필드를 선택합니다. 실험 실행으로 이동하여 플레이트 이름을 입력하고 시작을 누릅니다.형광 강도를 측정하려면 이미지 분석 섹션으로 이동하여 이미지를 입력하고 EGFP 채널 및 방법 B.를 선택하여 셀을 찾아 원고 방향에 따라 매개 변수를 조정하고 평균을 출력으로 선택합니다. 적용 아이콘을 눌러 설정을 저장합니다. 평가 섹션으로 이동하여 열 맵과 데이터 테이블을 얻고 판독 매개 변수를 조정한 다음 평가를 시작합니다.C.elegans는 P.aeruginosa와 함께 잠복 후 FITC-dextran 형광이 다른 두 개의 세균균과 비교하여 상당한 증가를 보였으며, 이는 P.aeruginosa가 상피 장 장벽에 더 큰 활력을 손상시키고 장 투과성을 증가시켰음을 나타냅니다. 라이브 및 열 비활성화 P.aeruginosa 는 C.elegans에서 장 투과성에 매우 다른 효과를 트리거. 열 불활성화 시, 형광 영상과 통계 데이터는 P.aeruginosa선미에 어떤 독성을 트리거하지 않았다는 것을 나타냅니다.DIM을 가진 48 시간 공동 처리는 P.aeruginosa에 드러낸 벌레의 창자 안쪽에 FITC-dextran 형광 강도를 현저하게 감소시켰습니다, 이는 DIM이 세균성 감염으로 인한 장 투과성 장애를 치료하는 좋은 천연 제품으로 간주될 수 있다는 것을 보여줍니다. FITC-dextran 코팅 플레이트를 준비하는 동안 FITC-dextran의 빛 감도 때문에 광 노출을 최소화해야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 이 기술은 박테리아를 테스트 하 여 장 박테리아와 그들의 활성 구성 요소의 병원 성 및 probiotic 효과 결정 하는 데 사용할 수 있습니다., 뿐만 아니라 그들의 화학 구성.

Research

JoVE Journal

Medicine

Measuring the Effects of Bacteria and Chemicals on the Intestinal Permeability of Caenorhabditis elegans

Measuring the Strength of Mice

쥐의 강도를 측정

Kondziela7 devised the inverted screen test and published it in 1964. It is a test of muscle strength using all four limbs. Most normal mice easily score ...

연구

의학

Measuring Frailty in HIV-infected Individuals. Identification of Frail Patients is the First Step to Amelioration and Reversal of Frailty

HIV에 감염된 개인의 연약함을 측정합니다. 허약 환자의 식별 개량과 연약함 환입하는 첫 번째 단계입니다

A simple, validated protocol consisting of a battery of tests is available to identify elderly patients with frailty syndrome. This syndrome of decreased ...

Non-invasive Assessment of the Efficacy of New Therapeutics for Intestinal Pathologies Using Serial Endoscopic Imaging of Live Mice

라이브 마우스의 직렬 내시경 이미징을 사용하여 소장 병변에 대한 새로운 치료제의 효능의 비 침습적 평가

Animal models of inflammatory bowel disease (IBD) and colorectal cancer (CRC) have provided significant insight into the cell intrinsic and extrinsic ...

Ex Vivo Intestinal Sacs to Assess Mucosal Permeability in Models of Gastrointestinal Disease

Ex Vivo Intestinal Sacs to Assess Mucosal Permeability in Models of Gastrointestinal Disease

예 생체 내 창자 주머 니나는 위장 질환 모델에서 점막 투과성을 평가하는

The epithelial barrier is the first innate defense of the gastrointestinal tract and selectively regulates transport from the lumen to the underlying ...

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

인-31 자기 공명 분광학 : 측정을위한 도구<em&gt; 생체</em인간의 골격 근육에&gt; 미토콘드리아 산화 적 인산화 능력

Skeletal muscle mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) capacity, which is critically important in health and disease, can be measured in vivo ...

Analyzing Beneficial Effects of Nutritional Supplements on Intestinal Epithelial Barrier Functions During Experimental Colitis

실험 성 대장염 동안 장내 상피 장벽 기능에 영양 보조 식품의 유익한 효과 분석

Inflammatory bowel diseases (IBD), including Crohn&#39;s disease and ulcerative colitis, are chronic relapsing disorders of the intestines. They cause ...

Measuring the Effect of Chemicals on the Growth and Reproduction of Caenorhabditis elegans

Measuring the Effect of Chemicals on the Growth and Reproduction of Caenorhabditis elegans

성장과 재생산 꼬마 선 충 의 화학 물질의 효과 측정

Toxicological evaluation is crucial for understanding the effects of chemicals on living organisms in basic and applied biological science fields. A ...

A Murine Model of Fetal Exposure to Maternal Inflammation to Study the Effects of Acute Chorioamnionitis on Newborn Intestinal Development

신생아 장 발달에 급성 chorioamnionitis의 효력을 연구하기 위하여 모성 염증에 태아 노출의 Murine 모형

Chorioamnionitis is a common precipitant of preterm birth and is associated with many of the morbidities of prematurity, including necrotizing ...

Isolation of Murine Intestinal Mesenchyme Resulting in a High Yield of Telocytes

쥐 장 중간엽의 분리로 텔로세포의 높은 수율

The murine small intestine, or colon mesenchyme, is highly heterogenous, containing distinct cell types including blood and lymphatic endothelium, nerves, ...

Assessing Strength Exercise Volume and Its Impact on Insulin Sensitivity in Obesity

Randomized Controlled Trial to Study the Acute Effects of Strength Exercise on Insulin Sensitivity in Obese Adults

Exploring the Impact of Reduced Resistance Exercise Volume on Metabolic Health (Video) | JoVE

비만 성인의 인슐린 감수성에 대한 근력 운동의 급성 효과를 연구하기 위한 무작위 대조 시험

An acute session of strength exercise (SE) ameliorates insulin sensitivity (IS) for several hours; however, the effects of SE volume (i.e., number of ...