Name: measuring the effects of bacteria and chemicals on the intestinal permeability of caenorhabditis elegans
Uploaded: 2019-12-03T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring the Effects of Bacteria and Chemicals on the Intestinal Permeability of Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Denne studien ble støttet av en Korea Institute of Science and Technology intramural forskningsstipend (2E29563).

1. utarbeidelse av P. aeruginosa PAO1 og Escherichia coli OP50 kultur
<ol><li>Forbered 500 mL sterilisert Luria-Bertani (LB) medium (tabell 1) og vaksinere en enkelt koloni av P. aeruginosa inn i mediet. Ruge kulturen i 14 til 15 timer ved 37 ° c med en risting hastighet på 150 RPM.</li>
	<li>Fordel jevnt den bakterielle kulturen i 2 500 mL sentrifugerør og sentrifuger rørene ved 3 220 x g ved 4 ° c i 30 min.</li>
	<li>Fjern supernatanten til volumet er 50 mL (e...

<ol>
	<li>Bischoff, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+permeability&#8211;a+new+target+for+disease+prevention+and+therapy.">Intestinal permeability&#8211;a new target for disease prevention and therapy.</a> BMC Gastroenterology. 14 (1), 189 (2014).</li><li>Peng, L., Li, Z. R., Green, R. S., Holzman, I. R., Lin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Butyrate+enhances+the+intestinal+barrier+by+facilitating+tight+junction+assembly+via+activation+of+AMP-activated+protein+kinase+in+Caco-2+cell+monolayers.">Butyrate enhances the intestinal barrier by facilitating tight junction assembly via activation of AMP-activated protein kinase in Caco-2 cell monolayers.</a> The Journal of Nutrition. 139 (9), 1619-1625 (2009).</li><li>Ren, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+basis+for+intestinal+barrier+against+the+toxicity+of+graphene+oxide.">Developmental basis for intestinal barrier against the toxicity of graphene oxide.</a> Particle Fibre Toxicology. 15 (1), 26 (2018).</li><li>Kissoyan, K. A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+C.+elegans+microbiota+protects+against+infection+via+production+of+a+cyclic+lipopeptide+of+the+viscosin+group.">Natural C. elegans microbiota protects against infection via production of a cyclic lipopeptide of the viscosin group.</a> Current Biology. 29 (6), 1030-1037 (2019).</li><li>Gelino, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+autophagy+improves+healthspan+and+longevity+in+C.+elegans+during+dietary+restriction.">Intestinal autophagy improves healthspan and longevity in C. elegans during dietary restriction.</a> PLoS Genetics. 12 (7), 1006135 (2016).</li><li>Escorcia, W., Ruter, D. L., Nhan, J., Curran, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+lipid+abundance+and+evaluation+of+lipid+distribution+in+Caenorhabditis+elegans+by+Nile+red+and+oil+red+O+staining.">Quantification of lipid abundance and evaluation of lipid distribution in Caenorhabditis elegans by Nile red and oil red O staining.</a> Journal of Visualized Experiments. (133), e57352 (2018).</li><li>Johnson, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advantages+and+disadvantages+of+Caenorhabditis+elegans+for+aging+research.">Advantages and disadvantages of Caenorhabditis elegans for aging research.</a> Experimental Gerontology. 38 (11-12), 1329-1332 (2003).</li><li>Culetto, E., Sattelle, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+Caenorhabditis+elegans+in+understanding+the+function+and+interactions+of+human+disease+genes.">A role for Caenorhabditis elegans in understanding the function and interactions of human disease genes.</a> Human Molecular Genetics. 9 (6), 869-877 (2000).</li><li>Hubbard, E. J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+germ+line:+A+model+for+stem+cell+biology.">Caenorhabditis elegans germ line: A model for stem cell biology.</a> Developmental Dynamics. 236 (12), 3343-3357 (2007).</li><li>Park, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probiotic+Lactobacillus+fermentum+strain+JDFM216+stimulates+the+longevity+and+immune+response+of+Caenorhabditis+elegans+through+a+nuclear+hormone+receptor.">Probiotic Lactobacillus fermentum strain JDFM216 stimulates the longevity and immune response of Caenorhabditis elegans through a nuclear hormone receptor.</a> Scientific Reports. 8, 7441 (2018).</li><li>Kim, Y., Mylonakis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+immune+conditioning+with+the+probiotic+bacterium+Lactobacillus+acidophilus+strain+NCFM+enhances+gram-positive+immune+responses.">Caenorhabditis elegans immune conditioning with the probiotic bacterium Lactobacillus acidophilus strain NCFM enhances gram-positive immune responses.</a> Infection and Immunity. 80 (7), 2500-2508 (2012).</li><li>Nakagawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+and+mechanisms+of+prolongevity+induced+by+Lactobacillus+gasseri+SBT2055+in+Caenorhabditis+elegans.">Effects and mechanisms of prolongevity induced by Lactobacillus gasseri SBT2055 in Caenorhabditis elegans.</a> Aging Cell. 15 (2), 227-236 (2016).</li><li>Dinh, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cranberry+extract+standardized+for+proanthocyanidins+promotes+the+immune+response+of+Caenorhabditis+elegans+to+Vibrio+cholerae+through+the+p38+MAPK+pathway+and+HSF-1.">Cranberry extract standardized for proanthocyanidins promotes the immune response of Caenorhabditis elegans to Vibrio cholerae through the p38 MAPK pathway and HSF-1.</a> PLoS One. 9 (7), 103290 (2014).</li><li>Vayndorf, E. M., Lee, S. S., Liu, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+apple+extracts+increase+lifespan,+healthspan+and+resistance+to+stress+in+Caenorhabditis+elegans.">Whole apple extracts increase lifespan, healthspan and resistance to stress in Caenorhabditis elegans.</a> Journal of Functional Foods. 5 (3), 1236-1243 (2013).</li><li>Huycke, M. M., Abrams, V., Moore, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enterococcus+faecalis+produces+extracellular+superoxide+and+hydrogen+peroxide+that+damages+colonic+epithelial+cell+DNA.">Enterococcus faecalis produces extracellular superoxide and hydrogen peroxide that damages colonic epithelial cell DNA.</a> Carcinogenesis. 23 (3), 529-536 (2002).</li><li>Laughlin, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+key+role+of+Pseudomonas+aeruginosa+PA-I+lectin+on+experimental+gut-derived+sepsis.">The key role of Pseudomonas aeruginosa PA-I lectin on experimental gut-derived sepsis.</a> Annals of Surgery. 232 (1), 133-142 (2000).</li><li>Huang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3,3'-Diindolylmethane+decreases+VCAM-1+expression+and+alleviates+experimental+colitis+via+a+BRCA1-dependent+antioxidant+pathway.">3,3'-Diindolylmethane decreases VCAM-1 expression and alleviates experimental colitis via a BRCA1-dependent antioxidant pathway.</a> Free Radical Biology, Medicine. 50 (2), 228-236 (2011).</li><li>Jeon, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Oral+Administration+of+3,3'-Diindolylmethane+on+Dextran+Sodium+Sulfate-Induced+Acute+Colitis+in+Mice.">Effect of Oral Administration of 3,3'-Diindolylmethane on Dextran Sodium Sulfate-Induced Acute Colitis in Mice.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 64, 7702-7709 (2016).</li><li>Kim, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3,3'-Diindolylmethane+improves+intestinal+permeability+dysfunction+in+cultured+human+intestinal+cells+and+the+model+animal+Caenorhabditis+elegans.">3,3'-Diindolylmethane improves intestinal permeability dysfunction in cultured human intestinal cells and the model animal Caenorhabditis elegans.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 67 (33), 9277-9285 (2019).</li><li>Lee, S. Y., Kang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+the+Effect+of+Chemicals+on+the+Growth+and+Reproduction+of+Caenorhabditis+elegans.">Measuring the Effect of Chemicals on the Growth and Reproduction of Caenorhabditis elegans.</a> Journal of Visualized Experiments. (128), e56437 (2017).</li><li>Schmeisser, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+ROS+signaling+rather+than+AMPK/sirtuin-mediated+energy+sensing+links+dietary+restriction+to+lifespan+extension.">Neuronal ROS signaling rather than AMPK/sirtuin-mediated energy sensing links dietary restriction to lifespan extension.</a> Molecular Metabolism. 2 (2), 92-102 (2013).</li><li>Lee, S. Y., Kim, J. Y., Jung, Y. J., Kang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxicological+evaluation+of+the+topoisomerase+inhibitor,+etoposide,+in+the+model+animal+Caenorhabditis+elegans+and+3T3-L1+normal+murine+cells.">Toxicological evaluation of the topoisomerase inhibitor, etoposide, in the model animal Caenorhabditis elegans and 3T3-L1 normal murine cells.</a> Environmental Toxicology. 32 (6), 1836-1843 (2017).</li><li>Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+Caenorhabditis+elegans+life+span+on+solid+media.">Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media.</a> Journal of Visualized Experiments. (27), e1152 (2009).</li><li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Caenorhabditis+elegans+methods:+synchronization+and+observation.">Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation.</a> Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).</li><li>Al Atya, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probiotic+potential+of+Enterococcus+faecalis+strains+isolated+from+meconium.">Probiotic potential of Enterococcus faecalis strains isolated from meconium.</a> Frontiers in Microbiology. 6, 227 (2015).</li><li>Hanchi, H., Mottawea, W., Sebei, K., Hammami, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Genus+Enterococcus:+Between+Probiotic+Potential+and+Safety+Concerns-An+Update.">The Genus Enterococcus: Between Probiotic Potential and Safety Concerns-An Update.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 1791 (2018).</li><li>Pollack, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+exotoxin+A+in+pseudomonas+disease+and+immunity.">The role of exotoxin A in pseudomonas disease and immunity.</a> Reviews of Infectious Diseases. 5, 979-984 (1983).</li><li>Vasil, M. L., Liu, P. V., Iglewski, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature-dependent+inactivating+factor+of+Pseudomonas+aeruginosa+exotoxin+A.">Temperature-dependent inactivating factor of Pseudomonas aeruginosa exotoxin A.</a> Infection and Immunity. 13 (5), 1467-1472 (1976).</li><li>Horii, T., Muramatsu, H., Monji, A., Miyagishima, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Release+of+exotoxin+A,+peptidoglycan+and+endotoxin+after+exposure+of+clinical+Pseudomonas+aeruginosa+isolates+to+carbapenems+in+vitro.">Release of exotoxin A, peptidoglycan and endotoxin after exposure of clinical Pseudomonas aeruginosa isolates to carbapenems in vitro.</a> Chemotherapy. 51 (6), 324-331 (2005).</li><li>Kirikae, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+characterization+of+endotoxins+released+from+antibiotic-treated+Pseudomonas+aeruginosa+and+Escherichia+coli.">Biological characterization of endotoxins released from antibiotic-treated Pseudomonas aeruginosa and Escherichia coli.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 42 (5), 1015-1021 (1998).</li><li>Morlon-Guyot, J., Mere, J., Bonhoure, A., Beaumelle, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+of+Pseudomonas+aeruginosa+exotoxin+A+is+dispensable+for+cell+intoxication.">Processing of Pseudomonas aeruginosa exotoxin A is dispensable for cell intoxication.</a> Infection and Immunity. 77 (7), 3090-3099 (2009).</li><li>Kim, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3,3'-diindolylmethane+attenuates+colonic+inflammation+and+tumorigenesis+in+mice.">3,3'-diindolylmethane attenuates colonic inflammation and tumorigenesis in mice.</a> Inflammatory Bowel Diseases. 15 (8), 1164-1173 (2009).</li><li>Kanmani, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probiotics+and+its+functionally+valuable+products-a+review.">Probiotics and its functionally valuable products-a review.</a> Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 53 (6), 641-658 (2013).</li><li>Nguyen, M. T., Gotz, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipoproteins+of+Gram-Positive+Bacteria:+Key+Players+in+the+Immune+Response+and+Virulence.">Lipoproteins of Gram-Positive Bacteria: Key Players in the Immune Response and Virulence.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 80 (3), 891-903 (2016).</li></ol>

Ved å benytte denne nye metoden for å bestemme gut permeabilitet i C. elegans, som kombinerer automatiserte fluorescens mikroskopi og kvantitativ bildeanalyse, forskjellene forårsaket av tarm mikroorganismer eller kjemikalier kan fastsettes i Vivo, spesielt i C. elegans tarmen. Denne protokollen er nyttig for gut permeabilitet undersøkelser og gjelder for mange oppgaver, for eksempel reaktive oksygen arter (ROS) bestemmelse under stress forhold og morfologiske undersøkelser, på grunn av sin bekvem...

Intestinal permeabilitet regnes som en av de viktigste barrierene knyttet til intestinal bakterieflora og slimhinne immunitet og vil trolig bli påvirket av flere faktorer, for eksempel gut bakterieflora modifikasjoner, epitel verdifall, eller mucus lag endringer1. Aktuelle papirer har rapportert effektive protokoller for å måle intestinal permeabilitet av kultivert menneskelige tarm celler ved å analysere fluorescens Flux priser på tvers av intestinal celle lag2, men færre forskningsartikler presentere en passende prosedyre for å måle tarmen permeabilitet i nematoder, spesielt i C. elegans, ved hjelp av FITC-dextran farging.
Det er to representative protokoller for å måle tarmen permeabilitet i C. elegans bruke Nile Red3 og erioglaucine Disodium (eller Smurf analysen)4,5. I denne protokollen, brukte vi FITC-dextran (gjennomsnittlig molekylvekt 10 000), som har en mye høyere molekylvekt enn Nilen rød (MW = 318,37) og erioglaucine Disodium (MW = 792,85). FITC-dextran er mer likt enn Nilen rød eller erioglaucine Disodium fargestoffer til faktiske makro molekylære næringsstoffer som karbohydrater, som absorberes gjennom intestinal laget. Intestinal permeabilitet av C. elegans matet med erioglaucine Disodium (blå Smurf fargestoff) kan lett evalueres uten fluorescens mikroskopi. Men i Smurf analysen, kvantitativ analyse av intestinal permeabilitet er vanskelig på grunn av mangel på standardisering og bør evalueres manuelt4,5. I tilfelle av Nilen rød analysen, Nilen rød også flekker lipid dråper i celler, noe som kan forstyrre den nøyaktige bestemmelse av gut permeabilitet i C. elegans6. Den nåværende protokoller muliggjør rask og presis kvantitativ analyse av intestinal permeabilitet i C. elegans behandlet med ulike tarmbakterier og kjemikalier samtidig unngå løs lipid farging.
C. elegans er en typisk modell i biologiske felt på grunn av sin rimelige pris, enkel manipulasjon, begrenset dyreetikk problemer, og kortlevetid, noe som er gunstig for rask eksperimentering7. Spesielt etter hele C. elegans Genova ble publisert, nesten 40% av gener i C. elegans Genova ble funnet å være orthologous til gener som forårsaker menneskelige sykdommer8. Videre gjør den gjennomsiktige kroppen observasjon inne i organismen, noe som er fordelaktig for forsker på cellulære hendelser og for fluorescens anvendelser i cellebiologi, for eksempel Stamcelle farging med DAPI eller immunhistokjemi9. C. elegans blir ofte brukt som et eksperimentelt dyr for å studere samspillet mellom tarmen bakterieflora og verten; i tillegg er C. krystalldekorNS brukes til skjermen helsefremmende probiotiske bakterier10,11,12 samt kosttilskudd kjemikalier fremme intestinal helse13,14.
Pseudomonas aeruginosa og Enterococcus faecalis er velkjente gut bakterier som negativt påvirker fordøyelsessystemet, spesielt de colonic epitelceller i tarmkanalen15,16. Derfor, måle tarmen permeabilitet utløst av disse bakteriene er nødvendig for screening og utvikling av nye legemidler som kan gjenopprette og redusere skadene forårsaket av bakteriell betennelse og infeksjon. I denne protokollen, testet vi effekten av disse tarm bakteriene på intestinal permeabilitet av C. elegans.
Vi rapporterer også en optimalisert protokoll for testing kjemikalier på intestinal permeabilitet av C. elegans. For dette formålet, brukte vi 3, 3 '-diindolylmethane (Dim) som en modell kjemisk fordi Dim er en bioaktive metabolitten sammensatte avledet fra indol-3-carbinol, som er til stede i Brassica mat planter, og har blitt rapportert å ha terapeutiske effekter på IBD i mus17,18. I tillegg har vi nylig oppdaget at DIM forbedrer intestinal permeabilitet dysfunksjon i både kultivert menneskelige tarm celler så vel som modellen nematode C. elegans19.
I denne studien, brukte vi tre ulike eksperimentelle forhold. Først målte vi virkningene av de ulike bakteriene, P. aeruginosa og E. faecalis, på intestinal permeabilitet (figur 1). For det andre målte vi effekten av levende og varme-deaktivert P. aeruginosa på intestinal permeabilitet (figur 2). For det tredje målte vi effekten av DIM (en modell kjemisk) på intestinal permeabilitet av C. elegans matet med P. aeruginosa (Figur 3).
Målet med denne studien var å utvikle optimaliserte protokoller som måler intestinal permeabilitet av C. elegans, som er endret ved behandling med ulike tarmbakterier så vel som med kjemikalier.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >3,3&#8217;-diindolylmethane&#160;</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >D9568</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >90&#215;15 mm Petri dishes</td>
			<td >SPL Life Sciences, South Korea</td>
			<td >10090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >60&#215;15 mm Petri dishes</td>
			<td >SPL Life Sciences, South Korea</td>
			<td >10060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bactor Agar</td>
			<td >Beckton Dickinson</td>
			<td >REF. 214010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Formaldehyde solution&#160;</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >F1635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Brain Heart Infusion (BHI)&#160;</td>
			<td >Becton Dickinson</td>
			<td >REF. 237500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Caenorhabditis elegans N2</td>
			<td >Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td ></td>
			<td>Wild type&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cholesterol</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >C3045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Costa Assay Plate, 96 Well Black With Clear Flat Bottom Non-treated, No Lid Polystyrene</td>
			<td >Corning Incorporated</td>
			<td >REF. 3631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dimethyl sulfoxide</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Enterococcus faecalis KCTC 3206</td>
			<td >Korean Collection for Type Culture</td>
			<td >KCTC NO. 3206</td>
			<td>Falcutative anaerobic</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Escherichia coli OP50</td>
			<td >Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fluorescein isothiocyanate - dextran</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >FD10S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Harmony software&#160;</td>
			<td >PerkinElmer</td>
			<td ></td>
			<td>verson 3.5</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Luria-Bertani LB medium</td>
			<td >Merck</td>
			<td >VM743185 626&#160; 1.10285.5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Magnesium sulfate heptahydrate&#160;</td>
			<td >Fisher Bioreagents</td>
			<td >BP2213-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fluoromount aqueous mounting medium</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >F4680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Operetta CLS High-Content Analysis System</td>
			<td >PerkinElmer</td>
			<td>&#160;HH16000000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Peptone</td>
			<td >Merck</td>
			<td >EMD 1.07213.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pseudomonas aeruginosa PA01</td>
			<td >Korean Collection for Type Culture</td>
			<td >KCTC NO. 1637</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium Chloride</td>
			<td >Fisher Bioreagents</td>
			<td >BP358-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Stereo Microscope</td>
			<td >Nikon, Japan</td>
			<td >SMZ800N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Yeast extract</td>
			<td >Becton Dickinson</td>
			<td >REF. 212750</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring the effects of bacteria and chemicals on the intestinal permeability of caenorhabditis elegans

I levende organismer, intestinal hyperpermeability er et alvorlig symptom som fører til mange inflammatoriske tarm sykdommer (IBDs). Caenorhabditis elegans er en nonmammalian dyr modell som er mye brukt som et analysesystem på grunn av sin korte levetid, åpenhet, kostnadseffektivitet, og mangel på dyreetikk problemer. I denne studien ble en metode utviklet for å undersøke virkningene av ulike bakterier og 3, 3 '-diindolylmethane (DIM) på intestinal permeabilitet av C. elegans med høy gjennomstrømming bildeanalyse system. Ormene var infisert med annerledes tarmen bacteria eller cotreated med svak for 48 h og matet med fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran overnight. Deretter intestinal permeabilitet ble undersøkt ved å sammenligne fluorescens bilder og fluorescens intensitet inne i ormen organer. Denne metoden kan også ha potensial til å identifisere probiotiske og patogene tarmbakterier som påvirker intestinal permeabilitet i dyre modellen og er effektiv for å undersøke virkningene av skadelige eller helsefremmende kjemikalier på intestinal permeabilitet og intestinal helse. Imidlertid har denne protokollen også noen betydelige begrensninger på genetisk nivå, spesielt for å bestemme hvilke gener er endret for å kontrollere sykdom, fordi denne metoden er mest brukt for fenotypiske besluttsomhet. I tillegg er denne metoden begrenset til å bestemme nøyaktig hvilke patogene underlag forårsake betennelse eller øke permeabilitet av ormene tarmen under infeksjon. Derfor, ytterligere grundige studier, inkludert undersøkelse av den molekylære genetiske mekanismen ved hjelp av mutant bakterier og nematoder samt kjemiske komponent analyse av bakterier, er pålagt å fullt ut evaluere funksjonen av bakterier og kjemikalier for å bestemme intestinal permeabilitet.

Etter inkubasjons med P. aeruginosa PAO1, C. elegans viste en betydelig økning i FITC-dextran fluorescens i ormen kroppen i forhold til fluorescens vist etter inkubasjons med de to andre bakterielle stammer (figur 1). Den fluorescens intensiteten av ormer matet med e. coli OP50, P. aeruginosa PAO1, og E. faecalis KCTC3206 var 100,0 ± 6,6, 369,7 ± 38,9, og 105,6 ± 10,6%, henholdsvis. Dataene understreker at P. aeruginosa forårsaket me...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring the Effects of Bacteria and Chemicals on the Intestinal Permeability of Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Measuring the Effects of Bacteria and Chemicals on the Intestinal Permeability of Caenorhabditis elegans

Denne protokollen beskriver hvordan du kan måle intestinal permeabilitet av Caenorhabditis elegans. Denne metoden er nyttig for grunnleggende biologisk forskning på intestinal helse relatert til samspillet mellom tarmbakterier og deres vert og for screening for å identifisere probiotiske og kjemiske agenter for å kurere leaky gut syndrom og inflammatoriske tarm sykdommer.

Måle effekten av bakterier og kjemikalier på intestinal permeabilitet av Caenorhabditis elegans

In living organisms, intestinal hyperpermeability is a serious symptom that leads to many inflammatory bowel diseases (IBDs). Caenorhabditis elegans is a ...

Denne metoden vil være nyttig for grunnleggende biologiske studier knyttet til samspillet mellom tarmmikrobiota og tarmhelse. I tillegg kan denne protokollen brukes til screening av potensielle probiotika og nutraceuticals for å kurere tarmhelseproblemer, som lekkasje tarmsyndrom og inflammatoriske tarmsykdommer. Denne protokollen bruker et bildesystem med høy gjennomstrømning for å muliggjøre rask og presis kvantitativ analyse av intestinal permeabilitet i C.elegans behandlet med ulike bakterier og kjemikalier.Vi anbefaler at en forsker som ikke er kjent med denne teknikken begrenser antall prøver for å unngå feilmerking og andre feil. Denne prosedyren består av mange trinn som krever visuell demonstrasjon, for eksempel overføring av ormer til 96-brønnsplater og bruk av Operetta-maskinen, samt Harmony-programvaren. Start med å forberede 500 milliliter sterilt LB medium.Inokuler en enkelt koloni av P.aeruginosa inn i mediet, og inkuber kulturen i 14 til 15 timer ved 37 grader Celsius mens du rister på 150 rpm. Neste dag, jevnt fordele bakteriekulturen i to 500-milliliter rør, og sentrifuge dem på 3, 220 ganger g og fire grader Celsius i 30 minutter. Fjern supernatant, la 25 milliliter i hvert rør, for et totalt gjenværende volum på 50 milliliter, og deretter gjenbruke bakteriell pellet.Oppbevar bakteriekulturen ved fire grader Celsius til den er klar til bruk. For å teste effekten av bakterier på intestinal permeabilitet av C.elegans, fjern kulturene fra kjøleskapet og virvle dem grundig. Tilsett totalt 800 mikroliter til hver friske NGM-plate, og la platene tørke i en 20-graders Celsius inkubator over natten.For å forberede DIM-plater, tilsett 50 ml NGM agarmedium i en flaske DIM som inneholder NGM kjøttkraft, og bland godt. Hell deretter 20 milliliter av mediet i hver 90-by-15-millimeter Petri-skål. Forbered DMSO-platene ved å tilsette 20 milliliter DMSO som inneholder NGM medium til hver petriskål, og la platene stå ved romtemperatur i minst tre timer for å stivne.Spre 800 mikroliter vortexed E.coli eller P.aeruginosa kultur på hver friske NGM plate, og la platene tørke i en 20-graders Celsius inkubator over natten. Vask de alderss synkroniserte L4 larver med S-buffer, og overfør ca 500 ormer til NGM plater som inneholder forskjellige bakterier og kjemikalier. Deretter inkubere platene ved 20 grader Celsius i 48 timer.Forbered FITC-dextran-supplerte plater ved å blande to milliliter varmeaktivert E.coli med fire milligram FITC-dextran. Tilsett 100 mikroliter av blandingen til hver av 20 ferske NGM agarplater, og la platene tørke i en time på en ren laboratoriebenk. Etter 48 timers behandling vasker du ormene med S-buffer, overfører dem til FITC-dextran-supplerte plater og til NGM-plater uten FITC-dextran, og inkubere platene over natten.Neste dag, vask ormene med S-buffer, og la dem krype i den friske NGM agarplaten i en time. Tilsett 50 mikroliter med 4% formaldehyd til hver brønn av en svart, 96-brønn, flatbunnet plate, og overfør ca 50 ormer til hver brønn. Etter ett til to minutter, fjern alle formaldehyd, og legg til 100 mikroliter monteringsmedium i hver brønn.Formaldehyd er et giftig kjemikalie og bør håndteres med forsiktighet. Hvis du vil ta bilder fra fluorescerende, trykker du på Åpne lokk-ikonet i bildebehandlingsprogramvaren og setter platen inn i maskinen. Klikk Oppsett, velg platetypen, og legg til brightfield- og EGFP-kanalene.Hvis du vil justere oppsettet, går du til Oppsett-valget og velger Spor. Sett det første bildet på ett mikrometer, antall fly til 10, og avstanden til ett mikrometer. Velg en av behandlingsbrønnene og ett fangstfelt, og trykk Test i Kjør eksperiment-delen.Hvis bildene er tilfredsstillende, går du tilbake til Oppsett-delen og trykker på Tilbakestill-ikonet. Deretter velger du alle målbrønnene og et passende antall fangstfelt. Gå til Kjør eksperiment, skriv inn platenavnet, og trykk Start.For å måle fluorescensintensiteten, gå til Bildeanalyse-delen, skriv inn bildet og finn cellen ved å velge EGFP-kanalen og metoden B.Juster parametrene i henhold til manuskriptinstruksjonene, og velg gjennomsnittet som utgang. Trykk på Bruk-ikonet for å lagre oppsettet. Få et varmekart og en datatabell ved å gå til Evaluering-delen og justere avlesningsparameteren, og start deretter evalueringen.C.elegans viste en betydelig økning i FITC-dextran fluorescens etter inkubasjon med P.aeruginosa sammenlignet med de to andre bakterielle stammene, noe som indikerer at P.aeruginosa forårsaket mer vital skade på epiteltt gut barrieren og økt intestinal permeabilitet. Levende og varmeinaktivert P.aeruginosa utløste svært forskjellige effekter på tarmpermeabiliteten i C.elegans. Ved varmeinaktivering indikerer både fluorescensbildene og statistiske data at P.aeruginosa ikke utløste noen toksisitet for nematoder.En 48-timers samtidig behandling med DIM reduserte SIGNIFIKANT FITC-dextran fluorescensintensiteten inne i tarmene til ormer utsatt for P.aeruginosa, noe som viser at DIM kan betraktes som et godt naturlig produkt for å kurere intestinal permeabilitetsdysfunksjon forårsaket av bakterielle infeksjoner. Det er viktig å huske at under fremstillingen av FITC-dextranbelagte plater må du minimere lyseksponeringen på grunn av lysfølsomheten til FITC-dextran. Denne teknikken kan brukes til å bestemme de patogene og probiotiske effektene av tarmbakterier og deres aktive komponenter ved å teste bakteriene, samt deres kjemiske sammensetning.

Research

JoVE Journal

Medicine

Measuring the Effects of Bacteria and Chemicals on the Intestinal Permeability of Caenorhabditis elegans

Measuring the Strength of Mice

Måle styrke for Mus

Kondziela7 devised the inverted screen test and published it in 1964. It is a test of muscle strength using all four limbs. Most normal mice easily score ...

Measuring Frailty in HIV-infected Individuals. Identification of Frail Patients is the First Step to Amelioration and Reversal of Frailty

Måling Frailty hos HIV-infiserte individer. Identifisering av svake pasienter er det første skrittet til forbedring og Reversering av Frailty

A simple, validated protocol consisting of a battery of tests is available to identify elderly patients with frailty syndrome. This syndrome of decreased ...

Non-invasive Assessment of the Efficacy of New Therapeutics for Intestinal Pathologies Using Serial Endoscopic Imaging of Live Mice

Non-invasiv Vurdering av effekt av New Therapeutics for Intestinal Patologier Bruke Serial Endoskopisk Imaging av levende mus

Animal models of inflammatory bowel disease (IBD) and colorectal cancer (CRC) have provided significant insight into the cell intrinsic and extrinsic ...

Ex Vivo Intestinal Sacs to Assess Mucosal Permeability in Models of Gastrointestinal Disease

Ex Vivo Intestinal Sacs to Assess Mucosal Permeability in Models of Gastrointestinal Disease

Ex Vivo Tarm Sacs å vurdere slimhinner Permeabilitet i modeller av gastrointestinal sykdom

The epithelial barrier is the first innate defense of the gastrointestinal tract and selectively regulates transport from the lumen to the underlying ...

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

Fosfor-31 Magnetic Resonance spektroskopi: Et verktøy for måling<em&gt; I Vivo</em&gt; Mitokondriell oksidativ fosforylering Kapasitet i Human Skeletal Muscle

Skeletal muscle mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) capacity, which is critically important in health and disease, can be measured in vivo ...

Analyzing Beneficial Effects of Nutritional Supplements on Intestinal Epithelial Barrier Functions During Experimental Colitis

Analysere gunstige effektene av kosttilskudd på Intestinal Epitelial barrierefunksjoner Under Experimental kolitt

Inflammatory bowel diseases (IBD), including Crohn&#39;s disease and ulcerative colitis, are chronic relapsing disorders of the intestines. They cause ...

Measuring the Effect of Chemicals on the Growth and Reproduction of Caenorhabditis elegans

Measuring the Effect of Chemicals on the Growth and Reproduction of Caenorhabditis elegans

Måle effekten av kjemikalier på vekst og reproduksjon av Caenorhabditis elegans

Toxicological evaluation is crucial for understanding the effects of chemicals on living organisms in basic and applied biological science fields. A ...

A Murine Model of Fetal Exposure to Maternal Inflammation to Study the Effects of Acute Chorioamnionitis on Newborn Intestinal Development

En murinmodell av fostereksponering for maternal betennelse for å studere effekten av akutt chorioamnionitt på nyfødt tarmutvikling

Chorioamnionitis is a common precipitant of preterm birth and is associated with many of the morbidities of prematurity, including necrotizing ...

Isolation of Murine Intestinal Mesenchyme Resulting in a High Yield of Telocytes

Isolering av murine intestinal mesenkym som resulterer i et høyt utbytte av telocytter

The murine small intestine, or colon mesenchyme, is highly heterogenous, containing distinct cell types including blood and lymphatic endothelium, nerves, ...

Assessing Strength Exercise Volume and Its Impact on Insulin Sensitivity in Obesity

Randomized Controlled Trial to Study the Acute Effects of Strength Exercise on Insulin Sensitivity in Obese Adults

Exploring the Impact of Reduced Resistance Exercise Volume on Metabolic Health (Video) | JoVE

Randomisert kontrollert studie for å studere de akutte effektene av styrketrening på insulinfølsomhet hos overvektige voksne

An acute session of strength exercise (SE) ameliorates insulin sensitivity (IS) for several hours; however, the effects of SE volume (i.e., number of ...