Name: measuring the effects of bacteria and chemicals on the intestinal permeability of caenorhabditis elegans
Uploaded: 2019-12-03T13:30:00
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Este estudo foi apoiado por uma bolsa de pesquisa intramural do Instituto de Ciência e Tecnologia da Coreia (2E29563).

1. Preparação de P. aeruginosa PAO1 e Escherichia coli OP50 Cultura
<ol><li>Prepare 500 mL de médio esterilizado de Luria-Bertani (LB)(Tabela 1)e inocule uma única colônia de P. aeruginosa no meio. Incubar a cultura para 14 a 15 h em 37 °C com uma velocidade de agitação de 150 rpm.</li>
	<li>Distribua igualmente a cultura bacteriana em dois tubos de centrífuga de 500 mL e centrífugas os tubos a 3.220 x g a 4 °C por 30 min.</li>
	<li>Retire o supernatant at...

<ol>
	<li>Bischoff, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+permeability&#8211;a+new+target+for+disease+prevention+and+therapy.">Intestinal permeability&#8211;a new target for disease prevention and therapy.</a> BMC Gastroenterology. 14 (1), 189 (2014).</li><li>Peng, L., Li, Z. R., Green, R. S., Holzman, I. R., Lin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Butyrate+enhances+the+intestinal+barrier+by+facilitating+tight+junction+assembly+via+activation+of+AMP-activated+protein+kinase+in+Caco-2+cell+monolayers.">Butyrate enhances the intestinal barrier by facilitating tight junction assembly via activation of AMP-activated protein kinase in Caco-2 cell monolayers.</a> The Journal of Nutrition. 139 (9), 1619-1625 (2009).</li><li>Ren, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+basis+for+intestinal+barrier+against+the+toxicity+of+graphene+oxide.">Developmental basis for intestinal barrier against the toxicity of graphene oxide.</a> Particle Fibre Toxicology. 15 (1), 26 (2018).</li><li>Kissoyan, K. A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+C.+elegans+microbiota+protects+against+infection+via+production+of+a+cyclic+lipopeptide+of+the+viscosin+group.">Natural C. elegans microbiota protects against infection via production of a cyclic lipopeptide of the viscosin group.</a> Current Biology. 29 (6), 1030-1037 (2019).</li><li>Gelino, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+autophagy+improves+healthspan+and+longevity+in+C.+elegans+during+dietary+restriction.">Intestinal autophagy improves healthspan and longevity in C. elegans during dietary restriction.</a> PLoS Genetics. 12 (7), 1006135 (2016).</li><li>Escorcia, W., Ruter, D. L., Nhan, J., Curran, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+lipid+abundance+and+evaluation+of+lipid+distribution+in+Caenorhabditis+elegans+by+Nile+red+and+oil+red+O+staining.">Quantification of lipid abundance and evaluation of lipid distribution in Caenorhabditis elegans by Nile red and oil red O staining.</a> Journal of Visualized Experiments. (133), e57352 (2018).</li><li>Johnson, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advantages+and+disadvantages+of+Caenorhabditis+elegans+for+aging+research.">Advantages and disadvantages of Caenorhabditis elegans for aging research.</a> Experimental Gerontology. 38 (11-12), 1329-1332 (2003).</li><li>Culetto, E., Sattelle, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+Caenorhabditis+elegans+in+understanding+the+function+and+interactions+of+human+disease+genes.">A role for Caenorhabditis elegans in understanding the function and interactions of human disease genes.</a> Human Molecular Genetics. 9 (6), 869-877 (2000).</li><li>Hubbard, E. J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+germ+line:+A+model+for+stem+cell+biology.">Caenorhabditis elegans germ line: A model for stem cell biology.</a> Developmental Dynamics. 236 (12), 3343-3357 (2007).</li><li>Park, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probiotic+Lactobacillus+fermentum+strain+JDFM216+stimulates+the+longevity+and+immune+response+of+Caenorhabditis+elegans+through+a+nuclear+hormone+receptor.">Probiotic Lactobacillus fermentum strain JDFM216 stimulates the longevity and immune response of Caenorhabditis elegans through a nuclear hormone receptor.</a> Scientific Reports. 8, 7441 (2018).</li><li>Kim, Y., Mylonakis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+immune+conditioning+with+the+probiotic+bacterium+Lactobacillus+acidophilus+strain+NCFM+enhances+gram-positive+immune+responses.">Caenorhabditis elegans immune conditioning with the probiotic bacterium Lactobacillus acidophilus strain NCFM enhances gram-positive immune responses.</a> Infection and Immunity. 80 (7), 2500-2508 (2012).</li><li>Nakagawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+and+mechanisms+of+prolongevity+induced+by+Lactobacillus+gasseri+SBT2055+in+Caenorhabditis+elegans.">Effects and mechanisms of prolongevity induced by Lactobacillus gasseri SBT2055 in Caenorhabditis elegans.</a> Aging Cell. 15 (2), 227-236 (2016).</li><li>Dinh, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cranberry+extract+standardized+for+proanthocyanidins+promotes+the+immune+response+of+Caenorhabditis+elegans+to+Vibrio+cholerae+through+the+p38+MAPK+pathway+and+HSF-1.">Cranberry extract standardized for proanthocyanidins promotes the immune response of Caenorhabditis elegans to Vibrio cholerae through the p38 MAPK pathway and HSF-1.</a> PLoS One. 9 (7), 103290 (2014).</li><li>Vayndorf, E. M., Lee, S. S., Liu, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+apple+extracts+increase+lifespan,+healthspan+and+resistance+to+stress+in+Caenorhabditis+elegans.">Whole apple extracts increase lifespan, healthspan and resistance to stress in Caenorhabditis elegans.</a> Journal of Functional Foods. 5 (3), 1236-1243 (2013).</li><li>Huycke, M. M., Abrams, V., Moore, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enterococcus+faecalis+produces+extracellular+superoxide+and+hydrogen+peroxide+that+damages+colonic+epithelial+cell+DNA.">Enterococcus faecalis produces extracellular superoxide and hydrogen peroxide that damages colonic epithelial cell DNA.</a> Carcinogenesis. 23 (3), 529-536 (2002).</li><li>Laughlin, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+key+role+of+Pseudomonas+aeruginosa+PA-I+lectin+on+experimental+gut-derived+sepsis.">The key role of Pseudomonas aeruginosa PA-I lectin on experimental gut-derived sepsis.</a> Annals of Surgery. 232 (1), 133-142 (2000).</li><li>Huang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3,3'-Diindolylmethane+decreases+VCAM-1+expression+and+alleviates+experimental+colitis+via+a+BRCA1-dependent+antioxidant+pathway.">3,3'-Diindolylmethane decreases VCAM-1 expression and alleviates experimental colitis via a BRCA1-dependent antioxidant pathway.</a> Free Radical Biology, Medicine. 50 (2), 228-236 (2011).</li><li>Jeon, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Oral+Administration+of+3,3'-Diindolylmethane+on+Dextran+Sodium+Sulfate-Induced+Acute+Colitis+in+Mice.">Effect of Oral Administration of 3,3'-Diindolylmethane on Dextran Sodium Sulfate-Induced Acute Colitis in Mice.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 64, 7702-7709 (2016).</li><li>Kim, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3,3'-Diindolylmethane+improves+intestinal+permeability+dysfunction+in+cultured+human+intestinal+cells+and+the+model+animal+Caenorhabditis+elegans.">3,3'-Diindolylmethane improves intestinal permeability dysfunction in cultured human intestinal cells and the model animal Caenorhabditis elegans.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 67 (33), 9277-9285 (2019).</li><li>Lee, S. Y., Kang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+the+Effect+of+Chemicals+on+the+Growth+and+Reproduction+of+Caenorhabditis+elegans.">Measuring the Effect of Chemicals on the Growth and Reproduction of Caenorhabditis elegans.</a> Journal of Visualized Experiments. (128), e56437 (2017).</li><li>Schmeisser, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+ROS+signaling+rather+than+AMPK/sirtuin-mediated+energy+sensing+links+dietary+restriction+to+lifespan+extension.">Neuronal ROS signaling rather than AMPK/sirtuin-mediated energy sensing links dietary restriction to lifespan extension.</a> Molecular Metabolism. 2 (2), 92-102 (2013).</li><li>Lee, S. Y., Kim, J. Y., Jung, Y. J., Kang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxicological+evaluation+of+the+topoisomerase+inhibitor,+etoposide,+in+the+model+animal+Caenorhabditis+elegans+and+3T3-L1+normal+murine+cells.">Toxicological evaluation of the topoisomerase inhibitor, etoposide, in the model animal Caenorhabditis elegans and 3T3-L1 normal murine cells.</a> Environmental Toxicology. 32 (6), 1836-1843 (2017).</li><li>Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+Caenorhabditis+elegans+life+span+on+solid+media.">Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media.</a> Journal of Visualized Experiments. (27), e1152 (2009).</li><li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Caenorhabditis+elegans+methods:+synchronization+and+observation.">Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation.</a> Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).</li><li>Al Atya, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probiotic+potential+of+Enterococcus+faecalis+strains+isolated+from+meconium.">Probiotic potential of Enterococcus faecalis strains isolated from meconium.</a> Frontiers in Microbiology. 6, 227 (2015).</li><li>Hanchi, H., Mottawea, W., Sebei, K., Hammami, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Genus+Enterococcus:+Between+Probiotic+Potential+and+Safety+Concerns-An+Update.">The Genus Enterococcus: Between Probiotic Potential and Safety Concerns-An Update.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 1791 (2018).</li><li>Pollack, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+exotoxin+A+in+pseudomonas+disease+and+immunity.">The role of exotoxin A in pseudomonas disease and immunity.</a> Reviews of Infectious Diseases. 5, 979-984 (1983).</li><li>Vasil, M. L., Liu, P. V., Iglewski, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature-dependent+inactivating+factor+of+Pseudomonas+aeruginosa+exotoxin+A.">Temperature-dependent inactivating factor of Pseudomonas aeruginosa exotoxin A.</a> Infection and Immunity. 13 (5), 1467-1472 (1976).</li><li>Horii, T., Muramatsu, H., Monji, A., Miyagishima, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Release+of+exotoxin+A,+peptidoglycan+and+endotoxin+after+exposure+of+clinical+Pseudomonas+aeruginosa+isolates+to+carbapenems+in+vitro.">Release of exotoxin A, peptidoglycan and endotoxin after exposure of clinical Pseudomonas aeruginosa isolates to carbapenems in vitro.</a> Chemotherapy. 51 (6), 324-331 (2005).</li><li>Kirikae, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+characterization+of+endotoxins+released+from+antibiotic-treated+Pseudomonas+aeruginosa+and+Escherichia+coli.">Biological characterization of endotoxins released from antibiotic-treated Pseudomonas aeruginosa and Escherichia coli.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 42 (5), 1015-1021 (1998).</li><li>Morlon-Guyot, J., Mere, J., Bonhoure, A., Beaumelle, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+of+Pseudomonas+aeruginosa+exotoxin+A+is+dispensable+for+cell+intoxication.">Processing of Pseudomonas aeruginosa exotoxin A is dispensable for cell intoxication.</a> Infection and Immunity. 77 (7), 3090-3099 (2009).</li><li>Kim, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3,3'-diindolylmethane+attenuates+colonic+inflammation+and+tumorigenesis+in+mice.">3,3'-diindolylmethane attenuates colonic inflammation and tumorigenesis in mice.</a> Inflammatory Bowel Diseases. 15 (8), 1164-1173 (2009).</li><li>Kanmani, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probiotics+and+its+functionally+valuable+products-a+review.">Probiotics and its functionally valuable products-a review.</a> Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 53 (6), 641-658 (2013).</li><li>Nguyen, M. T., Gotz, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipoproteins+of+Gram-Positive+Bacteria:+Key+Players+in+the+Immune+Response+and+Virulence.">Lipoproteins of Gram-Positive Bacteria: Key Players in the Immune Response and Virulence.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 80 (3), 891-903 (2016).</li></ol>

Utilizando este novo método para determinar a permeabilidade intestinal em C. elegans, que combina microscopia fluorescência automatizada e análise quantitativa de imagem, as diferenças causadas por microorganismos intestinais ou produtos químicos podem ser determinadas in vivo, especificamente no intestino C. elegans. Este protocolo é útil para investigações de permeabilidade intestinal e aplicável a muitas tarefas, como determinação de espécies reativas de oxigênio (ROS) condições de e...

A permeabilidade intestinal é considerada como uma das principais barreiras relacionadas à microbiota intestinal e à imunidade mucosa e é provável que seja afetada por vários fatores, como modificações de microbiota intestinal, comprometimento epitelial ou alterações de camada de muco1. Trabalhos recentes relataram protocolos eficazes para medir a permeabilidade intestinal das células intestinais humanas cultivadas, analisando as taxas de fluxo de fluorescência em toda a camada de células intestinais2,mas menos trabalhos de pesquisa apresentam um procedimento adequado para medir a permeabilidade intestinal em nematóides, particularmente em C. elegans, usando manchas fitc-dextran.
Existem dois protocolos representativos para medir a permeabilidade intestinal em C. elegans usando vermelho Nilo3 e dissodium erioglaucine (ou o ensaio Smurf)4,5. Neste protocolo, usamos FITC-dextran (peso molecular médio 10.000), que tem um peso molecular muito maior do que o vermelho do Nilo (MW = 318,37) e dissodium erioglaucine (MW = 792,85). FITC-dextran é mais semelhante ao vermelho do Nilo ou corantes dissimeses erioglaucinos aos nutrientes macromoleculares reais, como carboidratos, que são absorvidos através da camada intestinal. A permeabilidade intestinal de C. elegans alimentada com disódio erioglaucine (corcel azul Smurf) pode ser facilmente avaliada sem microscopia de fluorescência. No entanto, no ensaio do Smurf, a análise quantitativa da permeabilidade intestinal é difícil devido à falta de padronização e deve ser avaliada manualmente4,5. No caso do ensaio vermelho do Nilo, o vermelho do Nilo também mancha sídropis lipídicos nas células, o que pode interferir com a determinação exata da permeabilidade intestinal em C. elegans6. Os protocolos atuais permitem a análise quantitativa rápida e precisa da permeabilidade intestinal em C. elegans tratados com várias bactérias e produtos químicos intestinais ao evitar a coloração lipid inespecífica.
C. elegans é um modelo típico em campos biológicos devido ao seu preço acessível, manipulação fácil, questões limitadas de ética animal, e vida útil curta, que é benéfico para a experimentação rápida7. Em particular, depois que todo o genoma de C. elegans foi publicado, quase 40% dos genes no genoma de C. elegans foram encontrados para ser ortologous aos genes que causam doenças humanas8. Além disso, o corpo transparente permite a observação dentro do organismo, que é vantajoso para pesquisar eventos celulares e para aplicações de fluorescência na biologia celular, por exemplo, manchas de células-tronco com DAPI ou imunohistoquímica9. C. elegans é frequentemente usado como um animal experimental para estudar a interação entre a microbiota intestinal e o hospedeiro; além disso, C. elegans é usado para rastrear bactérias probióticas promotoras de saúde10,11,12, bem como produtos químicos dietéticos que promovem a saúde intestinal13,14.
Pseudomonas aeruginosa e Enterococcus faecalis são bactérias intestinais bem conhecidas que afetam negativamente o sistema gastrointestinal, especialmente as células epiteliais colônicas do trato intestinal15,16. Portanto, medir a permeabilidade intestinal desencadeada por essas bactérias é necessário para o rastreamento e desenvolvimento de novos medicamentos que podem recuperar e reduzir os danos causados pela inflamação bacteriana e infecção. Neste protocolo, testamos os efeitos dessas bactérias intestinais sobre a permeabilidade intestinal de C. elegans.
Também relatamos um protocolo otimizado para testar produtos químicos sobre a permeabilidade intestinal de C. elegans. Para este fim, usamos 3,3'-diindolylmethane (DIM) como um modelo químico porque DIM é um composto de metabólito bioativo derivado do indole-3-carbinol, que está presente em plantas alimentares Brassica, e tem sido relatado para ter efeitos terapêuticos sobre ibd em camundongos17,18. Além disso, descobrimos recentemente que dim melhora a disfunção de permeabilidade intestinal em ambas as células intestinais humanas cultivadas, bem como o modelo nematódeo C. elegans19.
Neste estudo, utilizámos três condições experimentais diferentes. Primeiro, medimos os efeitos das diferentes bactérias, P. aeruginosa e E. faecalis, sobre permeabilidade intestinal(Figura 1). Em segundo lugar, medimos os efeitos do P. aeruginosa inativo ao vivo e inativado pelo calor sobre a permeabilidade intestinal(Figura 2). Em terceiro lugar, medimos os efeitos do DIM (um modelo químico) sobre a permeabilidade intestinal de C. elegans alimentados com P. aeruginosa (Figura 3).
O objetivo deste estudo foi desenvolver protocolos otimizados que medem a permeabilidade intestinal de C. elegans,que é alterado pelo tratamento com várias bactérias intestinais, bem como com produtos químicos.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >3,3&#8217;-diindolylmethane&#160;</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >D9568</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >90&#215;15 mm Petri dishes</td>
			<td >SPL Life Sciences, South Korea</td>
			<td >10090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >60&#215;15 mm Petri dishes</td>
			<td >SPL Life Sciences, South Korea</td>
			<td >10060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bactor Agar</td>
			<td >Beckton Dickinson</td>
			<td >REF. 214010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Formaldehyde solution&#160;</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >F1635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Brain Heart Infusion (BHI)&#160;</td>
			<td >Becton Dickinson</td>
			<td >REF. 237500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Caenorhabditis elegans N2</td>
			<td >Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td ></td>
			<td>Wild type&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cholesterol</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >C3045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Costa Assay Plate, 96 Well Black With Clear Flat Bottom Non-treated, No Lid Polystyrene</td>
			<td >Corning Incorporated</td>
			<td >REF. 3631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dimethyl sulfoxide</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Enterococcus faecalis KCTC 3206</td>
			<td >Korean Collection for Type Culture</td>
			<td >KCTC NO. 3206</td>
			<td>Falcutative anaerobic</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Escherichia coli OP50</td>
			<td >Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fluorescein isothiocyanate - dextran</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >FD10S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Harmony software&#160;</td>
			<td >PerkinElmer</td>
			<td ></td>
			<td>verson 3.5</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Luria-Bertani LB medium</td>
			<td >Merck</td>
			<td >VM743185 626&#160; 1.10285.5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Magnesium sulfate heptahydrate&#160;</td>
			<td >Fisher Bioreagents</td>
			<td >BP2213-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fluoromount aqueous mounting medium</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >F4680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Operetta CLS High-Content Analysis System</td>
			<td >PerkinElmer</td>
			<td>&#160;HH16000000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Peptone</td>
			<td >Merck</td>
			<td >EMD 1.07213.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pseudomonas aeruginosa PA01</td>
			<td >Korean Collection for Type Culture</td>
			<td >KCTC NO. 1637</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium Chloride</td>
			<td >Fisher Bioreagents</td>
			<td >BP358-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Stereo Microscope</td>
			<td >Nikon, Japan</td>
			<td >SMZ800N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Yeast extract</td>
			<td >Becton Dickinson</td>
			<td >REF. 212750</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring the effects of bacteria and chemicals on the intestinal permeability of caenorhabditis elegans

Em organismos vivos, a hiperpermebilidade intestinal é um sintoma grave que leva a muitas doenças inflamatórias intestinais (DII). Caenorhabditis elegans é um modelo animal não mamífero que é amplamente utilizado como um sistema de ensaio devido à sua curta vida útil, transparência, custo-eficácia e falta de questões éticas animais. Neste estudo, um método foi desenvolvido para investigar os efeitos de diferentes bactérias e 3,3'-diindolylmethane (DIM) sobre a permeabilidade intestinal de C. elegans com um sistema de análise de imagem de alta produção. Os vermes foram infectados com diferentes bactérias do intestino ou cotratados com DIM por 48 h e alimentados com isotiocianato de fluorescena (FITC)-dextran durante a noite. Em seguida, a permeabilidade intestinal foi examinada comparando as imagens de fluorescência e a intensidade da fluorescência dentro dos corpos do verme. Este método também pode ter o potencial de identificar bactérias intestinais probióticas e patogênicas que afetam a permeabilidade intestinal no modelo animal e é eficaz para examinar os efeitos de produtos químicos nocivos ou promotores da saúde sobre permeabilidade intestinal e saúde intestinal. No entanto, este protocolo também tem algumas limitações consideráveis a nível genético, especialmente para determinar quais genes são alterados para controlar a doença, porque este método é usado principalmente para determinação phenotípica. Além disso, este método é limitado a determinar exatamente quais substratos patogênicos causam inflamação ou aumentam a permeabilidade dos intestinos dos vermes durante a infecção. Portanto, são necessários mais estudos aprofundados, incluindo a investigação do mecanismo genético molecular usando bactérias mutantes e nematóides, bem como a análise de componentes químicos de bactérias, são necessários para avaliar plenamente a função de bactérias e produtos químicos na determinação da permeabilidade intestinal.

Após a incubação com P. aeruginosa PAO1, C. elegans mostrou um aumento significativo na fluorescência FITC-dextran no corpo do verme em comparação com a fluorescência mostrada após a incubação com as outras duas cepas bacterianas (Figura 1). As intensidades de fluorescência dos vermes alimentados com E. coli OP50, P. aeruginosa PAO1 e E. faecalis KCTC3206 foram 100,0 ± 6,6, 369,7 ± 38,9 e 105,6 ± 10,6%, respectivamente. Os dados enfa...

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Measuring the Effects of Bacteria and Chemicals on the Intestinal Permeability of Caenorhabditis elegans

Este protocolo descreve como medir a permeabilidade intestinal de Caenorhabditis elegans. Este método é útil para a pesquisa biológica básica sobre a saúde intestinal relacionada à interação entre bactérias intestinais e seu hospedeiro e para triagem para identificar agentes probióticos e químicos para curar a síndrome do intestino com vazamento e doenças inflamatórias intestinais.

Medindo os efeitos de bactérias e produtos químicos sobre a permeabilidade intestinal de Caenorhabditis elegans

In living organisms, intestinal hyperpermeability is a serious symptom that leads to many inflammatory bowel diseases (IBDs). Caenorhabditis elegans is a ...

Este método será útil para estudos biológicos básicos relacionados à interação entre microbiota intestinal e saúde intestinal. Além disso, esse protocolo pode ser usado para triagem de potenciais probióticos e nutracêuticos para curar problemas de saúde intestinal, como síndrome do intestino vazado e doenças inflamatórias intestinais. Este protocolo usa um sistema de imagem de alto rendimento para permitir uma análise quantitativa rápida e precisa da permeabilidade intestinal em C.elegans tratados com várias bactérias e produtos químicos.Recomendamos que um cientista que não esteja familiarizado com essa técnica limite o número de amostras para evitar erros e outros erros. Este procedimento consiste em muitas etapas que requerem demonstração visual, como transferir worms para placas de 96 poços e usar a máquina Operetta, bem como o software Harmony. Comece preparando 500 mililitros de meio LB estéril.Inocular uma única colônia de P.aeruginosa no meio, e incubar a cultura por 14 a 15 horas a 37 graus Celsius enquanto treme a 150 rpm. No dia seguinte, distribua uniformemente a cultura bacteriana em dois tubos de 500 mililitros, e centrifuá-los a 3.220 vezes g e quatro graus Celsius por 30 minutos. Remova o supernasce, deixando 25 mililitros em cada tubo, para um volume total restante de 50 mililitros, em seguida, resuspende a pelota bacteriana.Armazene a cultura bacteriana a quatro graus Celsius até estar pronto para uso. Para testar os efeitos das bactérias na permeabilidade intestinal dos C.elegans, remova as culturas da geladeira e alento-as completamente. Adicione um total de 800 microliters a cada placa NGM fresca, e deixe as placas secarem em uma incubadora Celsius de 20 graus durante a noite.Para preparar as placas DIM, adicione 50 mililitros de ngm médio em uma garrafa de DIM contendo caldo NGM, e misture bem. Em seguida, despeje 20 mililitros do meio em cada placa de Petri de 90 por 15 milímetros. Prepare as placas de DMSO adicionando 20 mililitros de DMSO contendo meio NGM a cada placa de Petri, e deixe as placas em temperatura ambiente por pelo menos três horas para solidificar.Espalhe 800 microliters de cultura E.coli ou P.aeruginosa em cada placa NGM fresca, e permita que as placas sequem em uma incubadora Celsius de 20 graus durante a noite. Lave as larvas L4 sincronizadas por idade com tampão S e transfira aproximadamente 500 vermes para as placas de NGM contendo diferentes bactérias e produtos químicos. Em seguida, incubar as placas a 20 graus Celsius por 48 horas.Prepare as placas complementadas pelo FITC-dextran misturando dois mililitros de E.coli inativados a calor com quatro miligramas de FITC-dextran. Adicione 100 microliters da mistura a cada uma das 20 placas frescas de ágar NGM, e deixe as placas secarem por uma hora em um banco de laboratório limpo. Após 48 horas de tratamento, lave os vermes com tampão S, transfira-os para placas complementadas pelo FITC-dextran e para placas de NGM sem FITC-dextran, e incubar as placas durante a noite.No dia seguinte, lave os vermes com tampão S, e deixe-os rastejar na placa de ágar NGM fresco por uma hora. Adicione 50 microliters de 4% de formaldeído a cada poço de uma placa preta, de 96 poços, de fundo plano, e transfira aproximadamente 50 vermes para cada poço. Após um a dois minutos, remova todo o formaldeído e adicione 100 microliters de meio de montagem em cada poço.Formaldeído é um químico tóxico e deve ser tratado com cuidado. Para capturar imagens fluorescentes, pressione o ícone Open Lid dentro do software de imagem e insira a placa na máquina. Clique em Configurar, selecione o tipo de placa e adicione os canais brightfield e EGFP.Para ajustar o layout, vá para a seleção Layout e selecione Acompanhar. Coloque a primeira imagem em um micrômetro, número de planos para 10, e a distância para um micrômetro. Selecione um dos poços de tratamento e um campo de captura e pressione teste na seção Executar experimentos.Se as imagens forem satisfatórias, retorne à seção Configuração e pressione o ícone Redefinir. Em seguida, selecione todos os poços alvo e um número adequado de campos de captura. Vá para Executar experimento, digite o nome da placa e pressione Iniciar.Para medir a intensidade da fluorescência, vá até a seção Análise de Imagens, insira a imagem e encontre a célula escolhendo o canal EGFP e o método B.Ajuste os parâmetros de acordo com as instruções do manuscrito e escolha a média como a saída. Pressione o ícone Aplicar para salvar a configuração. Obtenha um mapa de calor e uma tabela de dados indo até a seção Avaliação e ajuste o parâmetro de leitura e, em seguida, inicie a avaliação.C.elegans mostrou um aumento significativo na fluorescência FITC-dextran após a incubação com P.aeruginosa em comparação com as outras duas cepas bacterianas, indicando que a P.aeruginosa causou danos mais vitais à barreira intestinal epitelial e aumento da permeabilidade intestinal. P.aeruginosa ativada ao vivo e inativado pelo calor desencadeou efeitos muito diferentes na permeabilidade intestinal em C.elegans. Após a inativação do calor, tanto as imagens de fluorescência quanto os dados estatísticos indicam que p.aeruginosa não desencadeou nenhuma toxicidade aos nematoides.Um co-tratamento de 48 horas com DIM diminuiu significativamente a intensidade de fluorescência fitc-dextran dentro das entranhas de vermes expostos à P.aeruginosa, o que demonstra que o DIM pode ser considerado um bom produto natural para curar disfunção de permeabilidade intestinal causada por infecções bacterianas. É importante lembrar que durante a preparação das placas revestidas fitc-dextran, você precisa minimizar a exposição à luz por causa da sensibilidade à luz do FITC-dextran. Esta técnica pode ser usada para determinar os efeitos patogênicos e probióticos das bactérias intestinais e seus componentes ativos testando as bactérias, bem como sua composição química.

Research

JoVE Journal

Medicine

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