Name: measuring the effects of bacteria and chemicals on the intestinal permeability of caenorhabditis elegans
Uploaded: 2019-12-03T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring the Effects of Bacteria and Chemicals on the Intestinal Permeability of Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Это исследование было поддержано Корейским институтом науки и техники в интрамуральных исследований грант (2E29563).

1. Подготовка P. aeruginosa PAO1 и Escherichia coli OP50 Культура
<ol><li>Приготовьте 500 мл стерилизованной среды Лурия-Бертани (LB)(таблица 1)и привить одну колонию P. aeruginosa в среду. Инкубировать культуру от 14 до 15 ч при 37 градусах Цельсия со скоростью встряхивания 150 об/мин.</li>
	<li>Равноме?...

<ol>
	<li>Bischoff, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+permeability&#8211;a+new+target+for+disease+prevention+and+therapy.">Intestinal permeability&#8211;a new target for disease prevention and therapy.</a> BMC Gastroenterology. 14 (1), 189 (2014).</li><li>Peng, L., Li, Z. R., Green, R. S., Holzman, I. R., Lin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Butyrate+enhances+the+intestinal+barrier+by+facilitating+tight+junction+assembly+via+activation+of+AMP-activated+protein+kinase+in+Caco-2+cell+monolayers.">Butyrate enhances the intestinal barrier by facilitating tight junction assembly via activation of AMP-activated protein kinase in Caco-2 cell monolayers.</a> The Journal of Nutrition. 139 (9), 1619-1625 (2009).</li><li>Ren, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+basis+for+intestinal+barrier+against+the+toxicity+of+graphene+oxide.">Developmental basis for intestinal barrier against the toxicity of graphene oxide.</a> Particle Fibre Toxicology. 15 (1), 26 (2018).</li><li>Kissoyan, K. A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+C.+elegans+microbiota+protects+against+infection+via+production+of+a+cyclic+lipopeptide+of+the+viscosin+group.">Natural C. elegans microbiota protects against infection via production of a cyclic lipopeptide of the viscosin group.</a> Current Biology. 29 (6), 1030-1037 (2019).</li><li>Gelino, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+autophagy+improves+healthspan+and+longevity+in+C.+elegans+during+dietary+restriction.">Intestinal autophagy improves healthspan and longevity in C. elegans during dietary restriction.</a> PLoS Genetics. 12 (7), 1006135 (2016).</li><li>Escorcia, W., Ruter, D. L., Nhan, J., Curran, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+lipid+abundance+and+evaluation+of+lipid+distribution+in+Caenorhabditis+elegans+by+Nile+red+and+oil+red+O+staining.">Quantification of lipid abundance and evaluation of lipid distribution in Caenorhabditis elegans by Nile red and oil red O staining.</a> Journal of Visualized Experiments. (133), e57352 (2018).</li><li>Johnson, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advantages+and+disadvantages+of+Caenorhabditis+elegans+for+aging+research.">Advantages and disadvantages of Caenorhabditis elegans for aging research.</a> Experimental Gerontology. 38 (11-12), 1329-1332 (2003).</li><li>Culetto, E., Sattelle, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+Caenorhabditis+elegans+in+understanding+the+function+and+interactions+of+human+disease+genes.">A role for Caenorhabditis elegans in understanding the function and interactions of human disease genes.</a> Human Molecular Genetics. 9 (6), 869-877 (2000).</li><li>Hubbard, E. J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+germ+line:+A+model+for+stem+cell+biology.">Caenorhabditis elegans germ line: A model for stem cell biology.</a> Developmental Dynamics. 236 (12), 3343-3357 (2007).</li><li>Park, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probiotic+Lactobacillus+fermentum+strain+JDFM216+stimulates+the+longevity+and+immune+response+of+Caenorhabditis+elegans+through+a+nuclear+hormone+receptor.">Probiotic Lactobacillus fermentum strain JDFM216 stimulates the longevity and immune response of Caenorhabditis elegans through a nuclear hormone receptor.</a> Scientific Reports. 8, 7441 (2018).</li><li>Kim, Y., Mylonakis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+immune+conditioning+with+the+probiotic+bacterium+Lactobacillus+acidophilus+strain+NCFM+enhances+gram-positive+immune+responses.">Caenorhabditis elegans immune conditioning with the probiotic bacterium Lactobacillus acidophilus strain NCFM enhances gram-positive immune responses.</a> Infection and Immunity. 80 (7), 2500-2508 (2012).</li><li>Nakagawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+and+mechanisms+of+prolongevity+induced+by+Lactobacillus+gasseri+SBT2055+in+Caenorhabditis+elegans.">Effects and mechanisms of prolongevity induced by Lactobacillus gasseri SBT2055 in Caenorhabditis elegans.</a> Aging Cell. 15 (2), 227-236 (2016).</li><li>Dinh, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cranberry+extract+standardized+for+proanthocyanidins+promotes+the+immune+response+of+Caenorhabditis+elegans+to+Vibrio+cholerae+through+the+p38+MAPK+pathway+and+HSF-1.">Cranberry extract standardized for proanthocyanidins promotes the immune response of Caenorhabditis elegans to Vibrio cholerae through the p38 MAPK pathway and HSF-1.</a> PLoS One. 9 (7), 103290 (2014).</li><li>Vayndorf, E. M., Lee, S. S., Liu, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+apple+extracts+increase+lifespan,+healthspan+and+resistance+to+stress+in+Caenorhabditis+elegans.">Whole apple extracts increase lifespan, healthspan and resistance to stress in Caenorhabditis elegans.</a> Journal of Functional Foods. 5 (3), 1236-1243 (2013).</li><li>Huycke, M. M., Abrams, V., Moore, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enterococcus+faecalis+produces+extracellular+superoxide+and+hydrogen+peroxide+that+damages+colonic+epithelial+cell+DNA.">Enterococcus faecalis produces extracellular superoxide and hydrogen peroxide that damages colonic epithelial cell DNA.</a> Carcinogenesis. 23 (3), 529-536 (2002).</li><li>Laughlin, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+key+role+of+Pseudomonas+aeruginosa+PA-I+lectin+on+experimental+gut-derived+sepsis.">The key role of Pseudomonas aeruginosa PA-I lectin on experimental gut-derived sepsis.</a> Annals of Surgery. 232 (1), 133-142 (2000).</li><li>Huang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3,3'-Diindolylmethane+decreases+VCAM-1+expression+and+alleviates+experimental+colitis+via+a+BRCA1-dependent+antioxidant+pathway.">3,3'-Diindolylmethane decreases VCAM-1 expression and alleviates experimental colitis via a BRCA1-dependent antioxidant pathway.</a> Free Radical Biology, Medicine. 50 (2), 228-236 (2011).</li><li>Jeon, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Oral+Administration+of+3,3'-Diindolylmethane+on+Dextran+Sodium+Sulfate-Induced+Acute+Colitis+in+Mice.">Effect of Oral Administration of 3,3'-Diindolylmethane on Dextran Sodium Sulfate-Induced Acute Colitis in Mice.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 64, 7702-7709 (2016).</li><li>Kim, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3,3'-Diindolylmethane+improves+intestinal+permeability+dysfunction+in+cultured+human+intestinal+cells+and+the+model+animal+Caenorhabditis+elegans.">3,3'-Diindolylmethane improves intestinal permeability dysfunction in cultured human intestinal cells and the model animal Caenorhabditis elegans.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 67 (33), 9277-9285 (2019).</li><li>Lee, S. Y., Kang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+the+Effect+of+Chemicals+on+the+Growth+and+Reproduction+of+Caenorhabditis+elegans.">Measuring the Effect of Chemicals on the Growth and Reproduction of Caenorhabditis elegans.</a> Journal of Visualized Experiments. (128), e56437 (2017).</li><li>Schmeisser, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+ROS+signaling+rather+than+AMPK/sirtuin-mediated+energy+sensing+links+dietary+restriction+to+lifespan+extension.">Neuronal ROS signaling rather than AMPK/sirtuin-mediated energy sensing links dietary restriction to lifespan extension.</a> Molecular Metabolism. 2 (2), 92-102 (2013).</li><li>Lee, S. Y., Kim, J. Y., Jung, Y. J., Kang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxicological+evaluation+of+the+topoisomerase+inhibitor,+etoposide,+in+the+model+animal+Caenorhabditis+elegans+and+3T3-L1+normal+murine+cells.">Toxicological evaluation of the topoisomerase inhibitor, etoposide, in the model animal Caenorhabditis elegans and 3T3-L1 normal murine cells.</a> Environmental Toxicology. 32 (6), 1836-1843 (2017).</li><li>Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+Caenorhabditis+elegans+life+span+on+solid+media.">Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media.</a> Journal of Visualized Experiments. (27), e1152 (2009).</li><li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Caenorhabditis+elegans+methods:+synchronization+and+observation.">Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation.</a> Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).</li><li>Al Atya, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probiotic+potential+of+Enterococcus+faecalis+strains+isolated+from+meconium.">Probiotic potential of Enterococcus faecalis strains isolated from meconium.</a> Frontiers in Microbiology. 6, 227 (2015).</li><li>Hanchi, H., Mottawea, W., Sebei, K., Hammami, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Genus+Enterococcus:+Between+Probiotic+Potential+and+Safety+Concerns-An+Update.">The Genus Enterococcus: Between Probiotic Potential and Safety Concerns-An Update.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 1791 (2018).</li><li>Pollack, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+exotoxin+A+in+pseudomonas+disease+and+immunity.">The role of exotoxin A in pseudomonas disease and immunity.</a> Reviews of Infectious Diseases. 5, 979-984 (1983).</li><li>Vasil, M. L., Liu, P. V., Iglewski, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature-dependent+inactivating+factor+of+Pseudomonas+aeruginosa+exotoxin+A.">Temperature-dependent inactivating factor of Pseudomonas aeruginosa exotoxin A.</a> Infection and Immunity. 13 (5), 1467-1472 (1976).</li><li>Horii, T., Muramatsu, H., Monji, A., Miyagishima, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Release+of+exotoxin+A,+peptidoglycan+and+endotoxin+after+exposure+of+clinical+Pseudomonas+aeruginosa+isolates+to+carbapenems+in+vitro.">Release of exotoxin A, peptidoglycan and endotoxin after exposure of clinical Pseudomonas aeruginosa isolates to carbapenems in vitro.</a> Chemotherapy. 51 (6), 324-331 (2005).</li><li>Kirikae, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+characterization+of+endotoxins+released+from+antibiotic-treated+Pseudomonas+aeruginosa+and+Escherichia+coli.">Biological characterization of endotoxins released from antibiotic-treated Pseudomonas aeruginosa and Escherichia coli.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 42 (5), 1015-1021 (1998).</li><li>Morlon-Guyot, J., Mere, J., Bonhoure, A., Beaumelle, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+of+Pseudomonas+aeruginosa+exotoxin+A+is+dispensable+for+cell+intoxication.">Processing of Pseudomonas aeruginosa exotoxin A is dispensable for cell intoxication.</a> Infection and Immunity. 77 (7), 3090-3099 (2009).</li><li>Kim, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3,3'-diindolylmethane+attenuates+colonic+inflammation+and+tumorigenesis+in+mice.">3,3'-diindolylmethane attenuates colonic inflammation and tumorigenesis in mice.</a> Inflammatory Bowel Diseases. 15 (8), 1164-1173 (2009).</li><li>Kanmani, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probiotics+and+its+functionally+valuable+products-a+review.">Probiotics and its functionally valuable products-a review.</a> Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 53 (6), 641-658 (2013).</li><li>Nguyen, M. T., Gotz, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipoproteins+of+Gram-Positive+Bacteria:+Key+Players+in+the+Immune+Response+and+Virulence.">Lipoproteins of Gram-Positive Bacteria: Key Players in the Immune Response and Virulence.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 80 (3), 891-903 (2016).</li></ol>

Используя этот новый метод определения проницаемости кишечника в C. elegans, который сочетает в себе автоматизированную флуоресцентную микроскопию и количественный анализ изображений, различия, вызванные кишечными микроорганизмами или химическими веществами, могут быть определены...

Проницаемость кишечника считается одним из основных барьеров, связанных с кишечной микробиотой и слизистым иммунитетом и, вероятно, будет зависеть от нескольких факторов, таких как изменения микрофлоры кишечника, эпителиальные нарушения, или изменения слизистого слоя1. Последние документы сообщили эффективные протоколы для измерения кишечной проницаемости культивированных клеток кишечника человека путем анализа флуоресценции поток ставки через слой клеток кишечника2, но меньше научных работ представляют собой подходящую процедуру для измерения проницаемости кишечника в нематод, особенно в C. elegans, с помощью FITC-dextran пятен.
Есть два репрезентативных протокола для измерения проницаемости кишечника в C. elegans с использованием Нила красный3 и erioglaucine динайди (или Smurf асссе)4,5. В этом протоколе мы использовали FITC-dextran (средний молекулярный вес 10 000), который имеет гораздо более высокий молекулярный вес, чем красный Нил (МВс 318,37) и эриоглауцин динайоя (МВт 792,85). FITC-dextran больше похож, чем красный Нил или erioglaucine динатрия красителей фактических макромолекулярных питательных веществ, таких как углеводы, которые поглощаются через кишечный слой. Проницаемость кишечника C. elegans, питаемых с помощью erioglaucine disodium (голубой краситель Smurf), может быть легко оценена без флуоресценционной микроскопии. Однако, в анализе Smurf, количественный анализ кишечной проницаемости затруднен из-за отсутсвия стандартизации и должен быть оценен вручную4,5. В случае Красного нила, Красный Нил также пятна липидных капель в клетках, которые могут помешать точное определение проницаемости кишечника в C. elegans6. Настоящие протоколы позволяют быстро и точно анализировать проницаемость кишечника у C. elegans, обработанных различными кишечными бактериями и химическими веществами, избегая при этом неспецифических липидных окрашивания.
C. elegans является типичной моделью в биологических областях из-за своей доступной цене, легкой манипуляции, ограниченных вопросов этики животных, и короткий срок службы, что выгодно для быстрых экспериментов7. В частности, после публикации всего генома C. elegans, почти 40% генов гена c. elegans были признаны ортологичными для генов, вызывающих заболевания человека8. Кроме того, прозрачный организм позволяет наблюдать внутри организма, что выгодно для исследования клеточных событий и для применения флуоресценции в клеточной биологии, например, окрашивания стволовых клеток с помощью DAPI или иммуногистохимии9. C. elegans часто используется в качестве экспериментального животного для изучения взаимодействия микрофлоры кишечника и хозяина; кроме того, C. elegans используется для проверки здоровья поощрения пробиотических бактерий10,11,12, а также диетические химические вещества содействия здоровья кишечника13,14.
Pseudomonas aeruginosa и Enterococcus faecalis являются известными бактериями кишечника, которые негативно влияют на желудочно-кишечную систему, особенно на кишечные клетки кишечника15,16. Таким образом, измерение проницаемости кишечника, вызванного этими бактериями, необходимо для скрининга и разработки новых препаратов, которые могут восстановить и уменьшить ущерб, причиненный бактериальным воспалением и инфекцией. В этом протоколе мы проверили влияние этих кишечных бактерий на проницаемость кишечника C. elegans.
Мы также сообщаем об оптимизированном протоколе для тестирования химических веществ на проницаемости кишечника C. elegans. Для этой цели мы использовали 3,3'-diindolylmethane (DIM) в качестве модели химического вещества, потому что DIM является биологически активным метаболитом соединение, полученное из индола-3-карбинол, который присутствует в Brassica пищевых растений, и, как сообщается, терапевтическое воздействие на IBD у мышей17,18. Кроме того, мы недавно обнаружили, что DIM улучшает дисфункцию проницаемости кишечника как в культивированных клеток кишечника человека, а также модель нематод C. elegans19.
В этом исследовании мы использовали три различных экспериментальных условия. Во-первых, мы измерили влияние различных бактерий, P. aeruginosa и E. faecalis, на проницаемость кишечника(рисунок 1). Во-вторых, мы измерили влияние живой и теплоинактивированной P. aeruginosa на проницаемость кишечника(рисунок 2). В-третьих, мы измерили влияние DIM (модель химического) на кишечной проницаемости C. elegans кормили с P. aeruginosa (Рисунок 3).
Целью данного исследования было разработать оптимизированные протоколы, которые измеряют проницаемость кишечника C. elegans, которая изменяется путем лечения различными кишечными бактериями, а также с химическими веществами.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >3,3&#8217;-diindolylmethane&#160;</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >D9568</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >90&#215;15 mm Petri dishes</td>
			<td >SPL Life Sciences, South Korea</td>
			<td >10090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >60&#215;15 mm Petri dishes</td>
			<td >SPL Life Sciences, South Korea</td>
			<td >10060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bactor Agar</td>
			<td >Beckton Dickinson</td>
			<td >REF. 214010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Formaldehyde solution&#160;</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >F1635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Brain Heart Infusion (BHI)&#160;</td>
			<td >Becton Dickinson</td>
			<td >REF. 237500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Caenorhabditis elegans N2</td>
			<td >Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td ></td>
			<td>Wild type&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cholesterol</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >C3045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Costa Assay Plate, 96 Well Black With Clear Flat Bottom Non-treated, No Lid Polystyrene</td>
			<td >Corning Incorporated</td>
			<td >REF. 3631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dimethyl sulfoxide</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Enterococcus faecalis KCTC 3206</td>
			<td >Korean Collection for Type Culture</td>
			<td >KCTC NO. 3206</td>
			<td>Falcutative anaerobic</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Escherichia coli OP50</td>
			<td >Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fluorescein isothiocyanate - dextran</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >FD10S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Harmony software&#160;</td>
			<td >PerkinElmer</td>
			<td ></td>
			<td>verson 3.5</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Luria-Bertani LB medium</td>
			<td >Merck</td>
			<td >VM743185 626&#160; 1.10285.5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Magnesium sulfate heptahydrate&#160;</td>
			<td >Fisher Bioreagents</td>
			<td >BP2213-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fluoromount aqueous mounting medium</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >F4680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Operetta CLS High-Content Analysis System</td>
			<td >PerkinElmer</td>
			<td>&#160;HH16000000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Peptone</td>
			<td >Merck</td>
			<td >EMD 1.07213.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pseudomonas aeruginosa PA01</td>
			<td >Korean Collection for Type Culture</td>
			<td >KCTC NO. 1637</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium Chloride</td>
			<td >Fisher Bioreagents</td>
			<td >BP358-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Stereo Microscope</td>
			<td >Nikon, Japan</td>
			<td >SMZ800N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Yeast extract</td>
			<td >Becton Dickinson</td>
			<td >REF. 212750</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring the effects of bacteria and chemicals on the intestinal permeability of caenorhabditis elegans

В живых организмах гиперпроницаемость кишечника является серьезным симптомом, который приводит ко многим воспалительным заболеваниям кишечника (IBD). Caenorhabditis elegans является немлекопитающим животных модель, которая широко используется в качестве системы анализа из-за его короткий срок службы, прозрачность, рентабельность и отсутствие вопросов этики животных. В этом исследовании был разработан метод для исследования воздействия различных бактерий и 3,3'-diindolylmethane (DIM) на проницаемость кишечника C. elegans с высокой пропускной способностью системы анализа изображений. Черви были инфицированы различными бактериями кишечника или cotreated с DIM в течение 48 ч и кормили флуоресцен изотиоцианат (FITC)-dextran ночь. Затем проницаемость кишечника была изучена путем сравнения флуоресценции изображений и интенсивности флуоресценции внутри червя органов. Этот метод может также иметь потенциал для выявления пробиотических и патогенных кишечных бактерий, которые влияют на проницаемость кишечника в животной модели и эффективен для изучения влияния вредных или способствующих здоровью химических веществ на проницаемость кишечника и кишечного здоровья. Однако, этот протокол также имеет некоторые значительные ограничения на генетическом уровне, особенно для определения того, какие гены изменяются для контроля болезни, потому что этот метод в основном используется для фенотипического определения. Кроме того, этот метод ограничивается определением того, какие именно патогенные субстраты вызывают воспаление или увеличивают проницаемость кишечника червей во время инфекции. Поэтому для полной оценки функции бактерий и химических веществ при определении проницаемости кишечника необходимы дальнейшие углубленные исследования, включая изучение молекулярно-генетического механизма с использованием мутантных бактерий и нематод, а также анализ химических компонентов бактерий.

После инкубации с P. aeruginosa PAO1, C. elegans показал значительное увеличение FITC-декрен флуоресценции в организме червя по сравнению с флуоресценцией, показанной после инкубации с другими двумя бактериальными штаммами (Рисунок 1). Интенсивность флуоресценции червей, пи...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring the Effects of Bacteria and Chemicals on the Intestinal Permeability of Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Measuring the Effects of Bacteria and Chemicals on the Intestinal Permeability of Caenorhabditis elegans

Этот протокол описывает, как измерить кишечную проницаемость Caenorhabditis elegans. Этот метод полезен для фундаментальных биологических исследований по здоровью кишечника, связанных с взаимодействием кишечных бактерий и их хозяина и для скрининга для выявления пробиотических и химических агентов для лечения синдрома вытекающей кишечника и воспалительных заболеваний кишечника.

Измерение воздействия бактерий и химических веществ на кишечную проницаемость Caenorhabditis elegans

In living organisms, intestinal hyperpermeability is a serious symptom that leads to many inflammatory bowel diseases (IBDs). Caenorhabditis elegans is a ...

Этот метод будет полезен для фундаментальных биологических исследований, связанных с взаимодействием между кишечной микробиотой и здоровьем кишечника. Кроме того, этот протокол может быть использован для скрининга потенциальных пробиотиков и нутрицевтики для лечения кишечных проблем со здоровьем, таких как синдром вытекающей кишки и воспалительных заболеваний кишечника. Этот протокол использует высокой пропускной способности системы визуализации для обеспечения быстрого и точного количественного анализа проницаемости кишечника в C.elegans лечение с различными бактериями и химическими веществами.Мы рекомендуем ученому, который не знаком с этой техникой, ограничения количества образцов, чтобы избежать неправильной маркировки и других ошибок. Эта процедура состоит из многих шагов, которые требуют визуальной демонстрации, таких как передача червей на 96-хорошо пластин и с помощью машины Operetta, а также программное обеспечение Гармония. Начните с подготовки 500 миллилитров стерильной среды LB.Привить одну колонию P.aeruginosa в среду, и инкубировать культуру в течение 14 до 15 часов при 37 градусов по Цельсию при тряске при 150 об/мин. На следующий день равномерно распределит бактериальную культуру на две 500-миллилитровые трубки и центрифугировать их при 3, 220 раз г и четыре градуса по Цельсию в течение 30 минут. Удалите супернатант, оставив 25 миллилитров в каждой трубке, для общего оставшегося объема 50 миллилитров, а затем повторно потуперить бактериальные гранулы.Храните бактериальную культуру при четырех градусах Цельсия до готовности к использованию. Чтобы проверить влияние бактерий на проницаемость кишечника C.elegans, удалить культуры из холодильника, и тщательно вихрь их. Добавьте в общей сложности 800 микролитров к каждой свежей пластине NGM и позвольте пластинам высохнуть в 20-градусной инкубаторе По Цельсию на ночь.Чтобы подготовить DIM пластины, добавить 50 миллилитров NGM агар среды в бутылку DIM содержащие бульон NGM, и тщательно перемешать. Затем залить 20 миллилитров среды в каждую 90-на-15-миллиметровую чашку Петри. Подготовьте пластины DMSO, добавив 20 миллилитров DMSO, содержащих NGM средний к каждой чашке Петри, и оставить пластины при комнатной температуре, по крайней мере три часа, чтобы укрепить.Распространение 800 микролитров вихревых E.coli или P.aeruginosa культуры на каждой свежей пластины NGM, и позволяют пластины высохнуть в 20-градусный инкубатор по Цельсию на ночь. Вымойте возраст синхронизированные личинки L4 с помощью S-буфера и перенесите около 500 червей на пластины NGM, содержащие различные бактерии и химические вещества. Затем инкубировать пластины при 20 градусах по Цельсию в течение 48 часов.Приготовьте пластины, дополненные FITC-dextran, смешивая два миллилитров теплоактивированной E.coli с четырьмя миллиграммами FITC-декстрана. Добавьте 100 микролитров смеси к каждой из 20 свежих агарных пластин NGM и дайте пластинам высохнуть в течение одного часа на чистой лабораторной скамейке. После 48 часов лечения, мыть червей с S-буфер, передать их FITC-декстран-дополненные пластины и NGM пластин без FITC-декстран, и инкубировать пластины на ночь.На следующий день, мыть червей с S-буфер, и позволить им ползать в свежем NGM агар пластины в течение одного часа. Добавьте 50 микролитров 4%формальдегида в каждую колодец черной, 96-ну, плоской дном пластины, и перенесите около 50 червей в каждую колодец. Через одну-две минуты снимите весь формальдегид и добавьте в каждую хорошо 100 микролитров монтажной среды.Формальдегид является токсичным химическим веществом и должны быть обработаны с осторожностью. Чтобы запечатлеть флуоресцентные изображения, нажмите значок Open Lid в программном обеспечении для визуализации и вставьте пластину в машину. Нажмите Настройка, выберите тип пластины, и добавить brightfield и EGFP каналов.Чтобы настроить макет, перейдите к выбору Layout и выберите Track. Установите первое изображение на один микрометр, количество плоскостей до 10, и расстояние до одного микрометра. Выберите одну из лечебных скважин и одно поле захвата и нажмите Test в разделе Run Experiment.Если изображения являются удовлетворительными, вернитесь в раздел Настройка и нажмите значок сброса. Затем выберите все целевые скважины и подходящее количество полей захвата. Перейти к запуску эксперимента, введите имя пластины, и нажмите Начало.Чтобы измерить интенсивность флуоресценции, перейдите в раздел Анализ изображений, ввемите изображение и найдите ячейку, выбрав канал EGFP и метод B.Отрегулируйте параметры в соответствии с указаниями рукописи и выберите среднее качество в качестве вывода. Нажмите значок Apply, чтобы сохранить настройку. Получить тепловую карту и таблицу данных, заехав в раздел Оценка и отрегулировать параметр считывания, а затем начать оценку.C.elegans показал значительное увеличение FITC-декстран флуоресценции после инкубации с P.aeruginosa по сравнению с двумя другими бактериальными штаммами, что свидетельствует о том, что P.aeruginosa вызвало более серьезный ущерб эпителиального кишечного барьера и увеличение кишечной проницаемости. Инактивированная в реальном 2000 году P.aeruginosa вызвала очень различное воздействие на проницаемость кишечника в C.elegans. При тепловой инактивации, как флуоресценции изображения и статистические данные показывают, что P.aeruginosa не вызвало какой-либо токсичности для нематод.48-часовое совместное лечение DIM значительно снизило интенсивность флуоресценции FITC-декстрана внутри кишечника червей, подвергшихся воздействию P.aeruginosa, что свидетельствует о том, что DIM можно считать хорошим натуральным продуктом для лечения кишечной проницаемости дисфункции, вызванной бактериальными инфекциями. Важно помнить, что во время подготовки пластин с покрытием FITC-dextran необходимо свести к минимуму воздействие света из-за светочувствительность FITC-декстрана. Этот метод может быть использован для определения патогенных и пробиотических эффектов кишечных бактерий и их активных компонентов путем тестирования бактерий, а также их химический состав.

Research

JoVE Journal

Medicine

Measuring the Effects of Bacteria and Chemicals on the Intestinal Permeability of Caenorhabditis elegans

Measuring the Strength of Mice

Измеритель прочности Мыши

Kondziela7 devised the inverted screen test and published it in 1964. It is a test of muscle strength using all four limbs. Most normal mice easily score ...

Measuring Frailty in HIV-infected Individuals. Identification of Frail Patients is the First Step to Amelioration and Reversal of Frailty

Измерение Frailty у ВИЧ-инфицированных людей. Идентификация ослабленных больных это первый шаг к мелиорации и Восстановление Frailty

A simple, validated protocol consisting of a battery of tests is available to identify elderly patients with frailty syndrome. This syndrome of decreased ...

Non-invasive Assessment of the Efficacy of New Therapeutics for Intestinal Pathologies Using Serial Endoscopic Imaging of Live Mice

Неинвазивная оценка эффективности новых терапевтических средств для кишечника патологий помощи последовательной Эндоскопическая визуализации Живая мышей

Animal models of inflammatory bowel disease (IBD) and colorectal cancer (CRC) have provided significant insight into the cell intrinsic and extrinsic ...

Ex Vivo Intestinal Sacs to Assess Mucosal Permeability in Models of Gastrointestinal Disease

Ex Vivo Intestinal Sacs to Assess Mucosal Permeability in Models of Gastrointestinal Disease

Экс Vivo Кишечные Sacs для оценки слизистой проницаемости в моделях желудочно-кишечные заболевания

The epithelial barrier is the first innate defense of the gastrointestinal tract and selectively regulates transport from the lumen to the underlying ...

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

Фосфор-31 спектроскопии магнитного резонанса: Прибор для измерения<em&gt; В Vivo</em&gt; Митохондриальной окислительное фосфорилирование потенциала в скелетных мышцах человека

Skeletal muscle mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) capacity, which is critically important in health and disease, can be measured in vivo ...

Analyzing Beneficial Effects of Nutritional Supplements on Intestinal Epithelial Barrier Functions During Experimental Colitis

Анализируя Благотворное влияние пищевых добавок на Кишечный Эпителиальное барьерные функции Во время экспериментального колита

Inflammatory bowel diseases (IBD), including Crohn&#39;s disease and ulcerative colitis, are chronic relapsing disorders of the intestines. They cause ...

Measuring the Effect of Chemicals on the Growth and Reproduction of Caenorhabditis elegans

Measuring the Effect of Chemicals on the Growth and Reproduction of Caenorhabditis elegans

Измерение воздействия химических веществ на рост и размножение Caenorhabditis elegans

Toxicological evaluation is crucial for understanding the effects of chemicals on living organisms in basic and applied biological science fields. A ...

A Murine Model of Fetal Exposure to Maternal Inflammation to Study the Effects of Acute Chorioamnionitis on Newborn Intestinal Development

Мурин модель плода воздействия материнского воспаления для изучения последствий острого хориоамнионит на развитие кишечника новорожденных

Chorioamnionitis is a common precipitant of preterm birth and is associated with many of the morbidities of prematurity, including necrotizing ...

Isolation of Murine Intestinal Mesenchyme Resulting in a High Yield of Telocytes

Выделение мезенхимы кишечника мыши, приводящее к высокому выходу телоцитов

The murine small intestine, or colon mesenchyme, is highly heterogenous, containing distinct cell types including blood and lymphatic endothelium, nerves, ...

Assessing Strength Exercise Volume and Its Impact on Insulin Sensitivity in Obesity

Randomized Controlled Trial to Study the Acute Effects of Strength Exercise on Insulin Sensitivity in Obese Adults

Exploring the Impact of Reduced Resistance Exercise Volume on Metabolic Health (Video) | JoVE

Рандомизированное контролируемое исследование по изучению острого влияния силовых упражнений на чувствительность к инсулину у взрослых с ожирением

An acute session of strength exercise (SE) ameliorates insulin sensitivity (IS) for several hours; however, the effects of SE volume (i.e., number of ...